CN111825615B

CN111825615B - 一种氧化异阿朴菲生物碱衍生物及其用途

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Publication number: CN111825615B
Application number: CN202010706122.8A
Authority: CN
Inventors: 孙建博; 张佳瑶; 王豫锦
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111825615A

Abstract

本发明公开了一种如式I所示的氧化异阿朴菲衍生物，R如

所示，A选自‑O‑或共价键，n为0～4的整数，R₁选自

‑NR₂R₃；R₂选自H、R₃选自C1‑C3的直链或支链烷基；但不包括A选自‑O‑，n＝2、3，R₁选自

本发明所述的氧化异阿朴菲生物碱衍生物对肺癌、肝癌、乳腺癌的抑制活性较氧化异阿朴菲明显提高、溶解度增加。本发明还公开了所述的氧化异阿朴菲衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。

Description

一种氧化异阿朴菲生物碱衍生物及其用途

技术领域

本发明属于药物化学和药物治疗学领域，具体涉及氧化异阿朴菲生物碱衍生物及其制备方法与该类新化合物在制备抗癌药物中的用途。

背景技术

癌症是影响人类健康与寿命的主要疾病，现已成为全球重要的公共卫生问题之一。根据《全球癌症报告》显示，2018年全球预计新增1810万例癌症病例，死亡人数达960万，全球癌症负担进一步加重，越来越多的人关注癌症的治疗。天然产物是发现新型抗肿瘤药物的宝库，目前已有多种天然产物被证实具有抗肿瘤活性，但天然产物往往具有毒副作用、溶解性、稳定性等问题，需要对其进行结构修饰改造使其成为临床能够使用的抗肿瘤药物。

氧化异阿朴菲类生物碱(Oxoisoaporphine)是指含有1-氮杂苯并蒽酮(1-azabenzanthrone)骨架的一类异喹啉类生物碱。最早从防己科蝙蝠属植物蝙蝠葛(Menispermum dauricum DC)中被分离得到。近年来，氧化异阿朴菲类生物碱抗肿瘤活性引起了人们的关注，已有研究表明，氧化异阿朴菲类生物碱的骨架1可以通过π-π堆积嵌入DNA的双螺旋结构，从而诱导细胞凋亡机制的发生；通过抑制拓扑异构酶来影响细胞的增殖，进而表现出抗肿瘤活性。

氧化异阿朴菲类生物碱及其衍生物有望成为新型高效抗肿瘤药物。合适的侧链引入可以显著提高此类生物碱的活性。

发明内容

本发明的目的在于选取氧化异阿朴菲类生物碱的共同母环—1-氮杂苯并蒽酮作为先导物，进行C-4位的结构修饰，获得了一系列活性较氧化异阿朴菲明显提高、溶解度增加的氧化异阿朴菲生物碱衍生物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种如式I所示的氧化异阿朴菲衍生物：

其中，R如

所示，A选自-O-或共价键，n为0～4的整数，R₁选自

-NR₂R₃；R₂选自H、R₃选自C1-C3的直链或支链烷基；但不包括A选自-O-，n＝2、3，R₁选自

优选的，所述的A选自-O-，n为2～4的整数，R₁选自

但不包括n＝2、3，R₁选自

或所述的A选自共价键，n＝0，R₁选自

更优选的，所述的A选自-O-，n＝2，R₁选自

具体地讲，式I所示化合物选自下列化合物：

4-[(2-吗啉)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[(2-异丙胺基)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[2-(2-甲基哌啶)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[2-(4-羟乙基哌嗪)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[(3-吗啉)丙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[3-(2-甲基哌啶)丙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[4-(2-甲基哌啶)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[(4-吗啉)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[(4-异丙胺基)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[4-(4-甲基哌嗪)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-[4-(4-羟乙基哌嗪)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮；4-哌嗪-1-氮杂苯并蒽酮。

本发明的另一目的在于提供式I所示的氧化异阿朴菲衍生物的制备方法，

当A选自-O-，n为2～4的整数，R₁选自

但不包括n＝2、3，R₁选自

时，反应路线如下：

包括：

步骤(1)、将1-氮杂苯并蒽酮溶于二甘醇，以氢氧化钠提供强碱环境，与水合肼发生羟基化反应生成4-羟基-1-氮杂苯并蒽酮；

步骤(2)、以4-羟基-1-氮杂苯并蒽酮为原料，在碳酸钾存在的条件下，与式

所示的二溴烷反应得到中间体；在碳酸钾和催化量的催化剂CTAB存在的条件下，中间体与式R₁H所示的仲胺反应得到氧化异阿朴菲衍生物。

步骤(2)中，采用的溶剂选自DMF、丙酮、乙腈、甲苯、苯、二甲苯、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃或***中的一种或多种。

所述的4-羟基-1-氮杂苯并蒽酮和碳酸钾、二溴烷的摩尔比为1:1.5:1；反应温度为0℃～80℃。

所述的中间体和碳酸钾、仲胺的摩尔比为1:1.5:1.2；反应温度为0℃～60℃。

当A选自共价键，n＝0，R₁选自

时，反应路线如下：

本发明氧化异阿朴菲衍生物的制备方法反应条件温和，所用试剂低毒，原料易得，后处理方便，产率较高。

本发明氧化异阿朴菲生物碱衍生物对肺癌细胞株A549，肝癌细胞HepG-2，人乳腺癌细胞株McF-7、MDA-MB-231及耐阿霉素细胞株McF-7/ADR的抗肿瘤活性优良，活性较氧化异阿朴菲显著提高。因此，本发明的再一目的是提供式I所示的氧化异阿朴菲生物碱衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。

所述的肿瘤为肺癌、肝癌、乳腺癌。

具体实施方案

为进一步阐明本发明，下面列举一系列实施例。这些实施例是例证性的，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1：4-[(2-吗啉)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₁)的合成

反应式如下：

将4-羟基-1-氮杂苯并蒽酮(1eq)溶于5mL无水DMF，加入K₂CO₃(1.5eq)和1,2-二溴乙烷(1eq)，80℃搅拌过夜，停止反应，反应液中加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取除去DMF，硅胶柱色谱(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯P/E＝3:1)纯化得到中间体4-(2-溴乙氧基)-1-氮杂苯并蒽酮，再将4-(2-溴乙氧基)-1-氮杂苯并蒽酮(1eq)加入反应瓶，用5mL无水DMF溶解，加入K₂CO₃(1.5eq)、CTAB及吗啉(1.2eq)，60℃搅拌过夜，停止反应，萃取除去DMF，硅胶柱色谱(洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯P/E＝5:1)纯化得到化合物I₁，黄色固体，产率67％。化合物I₁鉴定为4-[(2-吗啉)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：360.4.[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.92(d,J＝6Hz,1H),8.78(d,J＝6Hz,1H),8.64(d,J＝9Hz,1H),8.44(d,J＝6Hz,1H),8.04(d,J＝6Hz,1H),7.81(t,J＝9Hz,1H),7.69(t,J＝9Hz,1H),7.16(d,J＝9Hz,1H),4.42(d,J＝6Hz,2H),3.78(4H,s),3.02(t,J＝6Hz,2H),2.70(4H,s).

实施例2：化合物4-[(2-异丙胺基)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₂)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以异丙胺替换化合物吗啉，其他条件不变，制得目标化合物I₂，黄色固体，产率58％。化合物I₂鉴定为4-[(2-异丙胺基)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：333.2.[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.86(d,J＝9Hz,1H),8.77(d,J＝6Hz,1H),8.48(d,J＝9Hz,1H),8.28(d,J＝9Hz,1H),7.98(d,J＝6Hz,1H),7.87(t,J＝7.5Hz,1H)，7.73(t,J＝7.5Hz,1H),7.60(d,J＝9Hz,1H),4.6(s,1H)，3.96(t,J＝6Hz,2H),3.45(s,3H),1.24(d,J＝6Hz,6H).

实施例3：4-[2-(2-甲基哌啶)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₃)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以2-甲基哌啶替换化合物吗啉，其他条件不变，制得目标化合物I₃，黄色固体，产率80％。化合物I₃鉴定为4-[2-(2-甲基哌啶)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：373.2[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.96(d,J＝6Hz,1H),8.82(d,J＝3Hz,1H),8.69(d,J＝6Hz,1H),8.48(d,J＝3H,1H),8.10(d,J＝3Hz,1H),7.84(t,J＝4.5Hz,1H),7.69(t,J＝4.5Hz,1H),7.23(d,J＝3Hz,1H),4.43(t,J＝3Hz,2H),3.32(d,J＝3Hz,1H),3.06(t,J＝3Hz,2H),2.53(t,J＝6Hz,J＝9Hz,2H),1.72(t,J＝6Hz,J＝9Hz,6H),1.25(d,3H).

实施例4：4-[2-(4-羟乙基哌嗪)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₄)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以4-羟乙基哌嗪替换化合物吗啉，其他条件不变，制得目标化合物I₄，黄色固体，产率85％。化合物I₄鉴定为4-[2-(4-羟乙基哌嗪)乙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：404.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.94(d,J＝6Hz,1H),8.81(d,J＝6Hz,1H),8.67(d,J＝6Hz,1H),8.46(d,J＝9Hz,1H),8.08(d,J＝6Hz,1H),7.81(t,J＝6Hz,1H),7.67(t,J＝6Hz,1H),7.20(d,J＝9Hz,1H),4.44(t,J＝6Hz,2H),3.65(t,J＝6Hz,2H),3.04(t,J＝6Hz,2H),2.74(s,8H),2.59(t,J＝6Hz,2H).

实施例5：4-[(3-吗啉)丙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₅)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以1,3-二溴丙烷替换化合物1,2-二溴乙烷，其他条件不变，制得目标化合物I₅，黄色固体，产率55％。化合物I₅鉴定为4-[(3-吗啉)丙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：375.2.[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.95(d,J＝9Hz,1H),8.80(d,J＝6Hz,1H),8.66(d,J＝6Hz,1H),8.47(d,J＝9Hz,1H),8.08(d,J＝6Hz,1H),7.83(t,J＝7.5Hz,1H),7.69(t,J＝7.5Hz,1H),7.20(d,J＝6Hz,1H),4.8(t,J＝6Hz,2H),3.79(t,J＝4.5Hz,4H),2.68(t,J＝7.5Hz,2H),2.55(t,J＝4.5Hz,4H),2.21(q,J＝7.5Hz,2H).

实施例6：4-[3-(2-甲基哌啶)丙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₆)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以2-甲基哌啶替换吗啉，1,3-二溴丙烷替换化合物1,2-二溴乙烷，其他条件不变，制得目标化合物I₆，黄色固体，产率73％。化合物I₆鉴定为4-[3-(2-甲基哌啶)丙氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：387.1[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.80(t,J＝7.5Hz,2H),8.50(d,J＝9Hz,1H),8.27(d,J＝9Hz,1H),8.03(d,J＝6Hz,1H),7.88(t,J＝7.5Hz,1H),7.73(t,J＝7.5Hz,1H),7.42(d,J＝6Hz,1H),4.36(s,2H),2.69(br,3H),2.10(br,2H),1.62(br,4H),1.32(br,4H),1.10(d,3H).

实施例7：4-[4-(2-甲基哌啶)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₇)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以2-甲基哌啶替换吗啉，1,4-二溴丁烷替换化合物1,2-二溴乙烷，其他条件不变，制得目标化合物I₇，黄色固体，产率11％。化合物I₇鉴定为4-[4-(2-甲基哌啶)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：401.1[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.95(d,J＝6Hz,1H),8.79(d,J＝6Hz,1H),8.66(d,J＝6Hz,1H),8.47(d,J＝7.5Hz,1H),8.10(d,J＝7.5Hz,1H),7.83(t,J＝7.5Hz,1H),7.69(t,J＝7.5Hz,1H),7.18(d,J＝6Hz,1H),4.35(t,J＝6Hz,2H),3.86(t,J＝6Hz,2H),2.14(t,J＝7.5Hz,3H),1.92(t,J＝6Hz,2H),1.32(t,11H).

实施例8：4-[(4-吗啉)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₈)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以1,4-二溴丁烷替换化合物1,2-二溴乙烷，其他条件不变，制得目标化合物I₈，黄色固体，产率49％。化合物I₈鉴定为4-[(4-吗啉)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：389.2[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.93(d,J＝6Hz,1H),8.78(d,J＝6Hz,1H),8.64(d,J＝6Hz,1H),8.44(d,J＝6Hz,1H),7.93(t,J＝6Hz,1H),7.82(t,J＝7.5Hz,1H),7.67(d,J＝7.5Hz,1H),7.37(d,J＝9Hz,1H),4.05(t,J＝6Hz,2H),3.33(t,J＝3Hz,4H),2.80(t,J＝7.5Hz,2H),2.04(t,J＝6Hz,4H),1.65(m,2H),1.27(m,2H).

实施例9：4-[(4-异丙胺基)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₉)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以4-异丙胺基替换吗啉，1,4-二溴丁烷替换化合物1,2-二溴乙烷，其他条件不变，制得目标化合物I₉，黄色固体，产率19％。化合物I₉鉴定为4-[(4-异丙胺基)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：361.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.94(d,J＝6Hz,1H),8.77(d,J＝6Hz,1H),8.65(d,J＝9Hz,1H),8.45(d,J＝6Hz,1H),8.08(d,J＝6Hz,1H),7.81(t,J＝7.5Hz,1H),7.67(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(d,J＝9Hz,1H),4.34(s,2H),2.98(m,1H),2.48(t,J＝6Hz,2H),1.91(m,4H),1.28(s,6H).

实施例10：4-[4-(4-甲基哌嗪)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₁₀)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以4-甲基哌嗪基替换吗啉，1,4-二溴丁烷替换化合物1,2-二溴乙烷，其他条件不变，制得目标化合物I₁₀，黄色固体，产率12％。化合物I₁₀鉴定为4-[4-(4-甲基哌嗪)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：402.3[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.94(d,J＝6Hz,1H),8.78(d,J＝9Hz,1H),8.64(d,J＝6Hz,1H),8.46(d,J＝9Hz,1H),8.08(d,J＝6Hz,1H),7.83(t,J＝7.5Hz,1H),7.68(t,J＝7.5Hz,1H),7.16(d,J＝6Hz,1H),4.34(t,J＝6Hz,2H),3.85(t,J＝6Hz,2H),2.12(m,J＝6Hz,2H),1.93(m,J＝6Hz,2H),1.71(br,3H),1.31(m,8H).

实施例11：4-[4-(4-羟乙基哌嗪)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮(I₁₁)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以4-羟乙基哌嗪基替换吗啉，1,4-二溴丁烷替换化合物1,2-二溴乙烷，其他条件不变，制得目标化合物I₁₁，黄色固体，产率11％。化合物I₁₁鉴定为4-[4-(4-羟乙基哌嗪)丁氧基]-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：432.2[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.99(d,J＝6Hz,1H),8.81(d,J＝6Hz,1H),8.68(d,J＝6Hz,1H),8.48(d,J＝6Hz,1H),8.13(d,J＝6Hz,1H),7.85(t,J＝7.5Hz,1H),7.70(t,J＝7.5Hz,1H),7.21(d,J＝6Hz,1H),4.38(t,J＝4.5Hz,2H),3.87(t,J＝4.5Hz,2H),2.15(t,J＝4.5Hz,2H),1.94(t,J＝4.5Hz,2H),1.38(m,12H).

实施例12：4-哌嗪-1-氮杂苯并蒽酮(化合物I₁₂)的合成

反应式如下：

参照化合物I₁的制法，以4-(2-溴乙氧基)-1-氮杂苯并蒽酮为原料，以哌嗪替换化合物吗啉，其他条件不变，制得目标化合物I₁₂，黄色固体，产率12％。化合物I₁₂鉴定为4-哌嗪-1-氮杂苯并蒽酮。

ESI-MS：316.1[M+H]⁺。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃,ppm),δ_H 8.93(d,J＝9Hz,1H),8.77(d,J＝9Hz,1H),8.63(d,J＝6Hz,1H),8.44(d,J＝9Hz,1H),7.93(d,J＝6Hz,1H),7.81(t,J＝7.5Hz,1H),7.66(t,J＝7.5Hz,1H),7.34(d,J＝9Hz,1H),3.32(t,J＝4.5Hz,4H),3.23(t,J＝3Hz,4H),1.27(s,1H).

表1.化合物I₁-I₁₂的取代基

实施例13：药理实验

采用四甲基氮唑蓝比色法(MTT法)对本发明氧化异阿朴菲生物碱衍生物进行抗肿瘤活性测试，以氧化异阿朴菲(Oxo)、阿霉素(Dox)为阳性对照药，测试了目标化合物、阳性对照药对五种癌细胞株(肺癌细胞株A549，肝癌细胞HepG-2，人乳腺癌细胞株McF-7、MDA-MB-231及耐阿霉素细胞株McF-7/ADR)抑制活性。

仪器：超净工作台(SW-CJ-1FD，AIRTECH，苏净安泰)、恒温CO₂培养箱(3111，Thermo，美国)、倒置生物显微镜(IX71，OLYMPUS，日本)、酶联免疫检测仪(Model680，BIO-RAD，美国)、平板摇床(Kylin-bell lab Instruments)、高压灭菌锅(YXO.SG41.280，上海华线)，离心机(SIGMA)。

试剂：DMEM(凯基)、RPMI-1640(凯基)、胎牛血清(GIBCO)、胰蛋白酶(SIGMA)，DMSO(SIGMA)。

细胞株：人非小细胞肺癌细胞株A549，肝癌细胞HepG-2，人乳腺癌细胞株McF-7和MDA-MB-231，耐阿霉素细胞株McF-7/ADR(均购自江苏凯基生物技术股份有限公司)。人非小细胞肺癌细胞株A549，肝癌细胞HepG-2，人乳腺癌细胞株McF-7和MDA-MB-231使用DMEM培养基，耐阿霉素细胞株McF-7/ADR使用RPMI-1640培养基。

受试化合物：化合物I₁-I₁₂、氧化异阿朴菲、阿霉素DMSO，分别配制成浓度为10mM母液，再用DMEM或RPMI-1640培养液稀释成系列浓度。

方法：将冻存的细胞株复苏，置于恒温37℃CO₂培养箱中培养，每天换液一次，待其处于指数生长期状态良好时即可铺板。加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化液，消化1-2min，在显微镜下观察细胞状态，当贴壁细胞变圆收缩时即可吸除消化液，加入1-2mL含10％胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培养基制成细胞悬液，进行细胞计数，按照每孔5×10⁴个细胞数及总孔数计算所需细胞悬液的量，将此细胞悬液接种于96孔板上，100μL/孔，周围用PBS液封，置于恒温37℃CO₂培养箱中培养24h。

取处于指数生长期状态良好的细胞，倾倒DMEM/RPMI-1640培养液，PBS洗一次，加入1mL 0.25％胰蛋白酶消化液消化1-2min，加入1mL含10％胎牛血清的DMEM培养基或RPMI-1640培养液，制得密度5×10⁴个/mL的细胞悬液，并接种于24孔板上(500μL/孔)，置恒温CO₂培养箱中培养24h。加入受试化合物，培养48h，以DMSO为空白对照组。将MTT试剂加入24孔板中(50μL/孔)，培养箱孵育4h。弃去上清液，加入DMSO(500μL/孔)溶解。采用酶标仪在570nm波长处测吸光值(OD值)，并按公式计算细胞抑制率和受试化合物的IC₅₀值(GraphPad Prism5软件计算)。

细胞抑制率％＝(空白对照组平均OD值-药物组平均OD值)/空白对照组平均OD值×100％

表2.受试化合物对人肿瘤细胞株的抗增殖作用

由表2可知，化合物I₁-化合物I₁₂对肿瘤细胞的抑制活性显著优于氧化异阿朴菲，对不同肿瘤细胞的抑制活性具有一定的选择性，对人乳腺癌细胞McF-7的抑制活性优于对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞Hep-G2、人乳腺癌细胞MDA-MB-231及耐阿霉素细胞株McF-7/ADR的抑制活性。

化合物的生物活性随着碳链长度延长而下降，当n＝2时(化合物I₁-I₄)表现出较好的生物活性，化合物I₃(IC₅₀ 1.32-7.64μM)对肿瘤细胞的抑制活性表现最为突出。化合物蒽酮环上的4-位取代基对化合物的细胞毒活性有明显影响，其中以甲基哌嗪环取代的活性最佳(I₃、I₆、I₇)。