CN111795909A

CN111795909A - 一种筛选控冰材料的方法

Info

Publication number: CN111795909A
Application number: CN201910282418.9A
Authority: CN
Inventors: 王健君; 金晟琳; 严杰; 乔杰; 闫丽盈; 李蓉
Original assignee: Institute of Chemistry CAS; Peking University Third Hospital
Current assignee: Beijing Dai Na Mi Ke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-04-09
Filing date: 2019-04-09
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2039-04-09
Also published as: CN111795909B

Abstract

本发明公开了一种筛选抗冻材料的方法，包括：测得所述控冰材料与水的亲和性；测得所述控冰材料在冰水界面的铺展性能，其中所述铺展性能由冰吸附实验测得。本发明首次提出控冰材料需同时兼具水和冰的亲和性，可在冰水界面吸附并铺展以更有效的抑制冰晶生长这一控冰机制，进而提出一种控冰材料筛选方法，建立水溶液体系并通过观察/表征冰晶生长以及材料在冰表面的吸附实现冰与控冰材料之间相互作用的定量化测量，全面评估不同控冰材料在不同浓度下对于冰和水的亲和性，为相应材料控冰性能的比较以及控冰材料在应用时所适用的浓度范围和控冰效果提供准确参考，改善了现有的通过纳升渗透压仪测定热滞后等实验方法操作复杂、难以定量的局限。

Description

一种筛选控冰材料的方法

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种筛选控冰材料的方法。

背景技术

冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和***速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(***、***)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性材料的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。

目前最常用的冷冻保存方法为玻璃化冷冻。玻璃化冷冻技术采用渗透性或非渗透性低温保护剂，虽然在快速冷冻过程中可使细胞内外的液体直接成为玻璃态而避免了冷冻过程中因冰晶形成而导致的损伤。但是，在复温过程中，现有的冷冻保存试剂不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。由于抗冻蛋白和仿生控冰材料在分子层面的控冰机制仍有争议，仿生控冰材料的研发只能依赖“试误法”逐步尝试某种控冰材料的控冰效果，工作量大，成功几率渺茫，所以还需探索出仿生材料控冰机制的一般性原则和筛选方法。

发明内容

本发明提供一种筛选控冰材料的方法，包括如下步骤：(1)测得所述控冰材料与水的亲和性；(2)测得所述控冰材料在冰水界面的铺展性能。

作为本发明的一个实施方案，所述步骤(1)可以通过测定所述控冰材料在水中的溶解度、水合常数、分散尺寸、扩散系数等、和/或计算所述控冰材料与水分子形成的分子间氢键数等方法测定；具体地，例如采用分子动力学模拟(Molecular dynamics simulation,MD)测定所述控冰材料分子与水分子形成的分子间氢键数，或者采用动态光散射测定所述控冰材料在水溶液中的分散尺寸。

作为本发明的一个实施方案，所述步骤(2)可以通过测定在冰水界面处所述控冰材料在冰表面的吸附含量得到所述材料在冰水界面的铺展性能，和/或计算所述控冰材料与冰-水分子形成的分子间氢键数等方法测定所述材料与冰的亲和性；具体地，例如采用MD模拟测定所述控冰分子与冰-水分子形成的分子间氢键数，或者采用冰吸附实验于冰水界面处测得所述控冰材料分子在冰表面的吸附量。

根据本发明，所述冰吸附实验包括测得所述控冰材料在冰表面的吸附量。

根据本发明，所述控冰材料在冰表面的吸附量＝(冰表面所吸附的控冰材料质量m₁/含有控冰材料的原溶液中控冰材料的总质量m₂)╳100％。

作为本发明的一个实施方案，所述冰吸附实验包括以下步骤：

S1:取质量为m2的控冰材料，配制所述控冰材料的水溶液，降温至过冷温度；

S2:将预冷的控温棒置于所述水溶液中诱导冰层在控温棒表面生长，持续搅拌水溶液，以待控冰材料逐渐吸附于冰层表面，保持水溶液、控温棒温度在过冷温度；

S3:测定控冰材料在冰表面的吸附量。

根据本发明的实施方案，所述控温棒为导热材料制得的棒状物。所述棒状物可以是实心的或者中空的。当所述控温棒为中空的，其中空内腔有冷却液流动，可以通过控制冷却液的温度控制控温棒的温度，从而控制冰块的生长速度。

根据本发明的实施方案，所述控温棒可经液氮、干冰、超低温冰箱冷冻等方式中的一种预冷。

根据本发明的实施方案，所述冰吸附实验过程中，保持过冷度以及吸附时间不变以使控温棒表面所得冰的表面积在误差允许范围内保持不变。

根据本发明的实施方案，配置不同浓度的控冰材料的水溶液，进行冰吸附实验，可以评估同一控冰材料在具体应用时的适用浓度范围。

根据本发明的实施方案，所述步骤S1中控冰材料可以为预先荧光标记的，例如用荧光素进行标记，所述荧光素可以选自异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、碘化丙啶(PI)等中的至少一种。本领域技术人员应当理解，所述荧光标记的作用在于测得所述控冰材料的量，因此，如果所述控冰材料的吸附量可以通过其他方式准确测量，或者材料本身具有紫外或荧光光谱吸收特性，则无需进行荧光标记。

根据本发明的实施方案，步骤S3包括：

S3a:将吸附完成的冰块取出，纯水淋洗冰表面，融化冰块得到控冰材料吸附溶液；

S3b:测定融化的控冰材料吸附溶液的体积V，测定所述吸附溶液中控冰材料的质量/体积浓度c，通过公式m₁＝cV计算得到冰表面所吸附的控冰材料质量m1。

根据本发明的实施方案，所述S3b中，所述浓度c可通过本领域已知的方法测得，例如紫外可见光谱法、荧光光谱法等。

根据本发明，所述方法用于控制冰晶生长材料的筛选，例如PVA、聚氨基酸、抗冻蛋白、多肽等。

根据本发明，所述方法还包括步骤(3)：评估所述材料与水的亲和性和在冰水界面的铺展性能，铺展能力强的材料具有良好的控冰性能。

作为本发明步骤(3)的一个具体评估方案，覆盖一定冰表面积所需控冰材料的用量越小，则说明其铺展性能越好，即满足铺展系数S＞0，其中S＝γ_I-W-(γ_IRIA-I+γIRIA_-W)，γ_I-W为常数，即，冰水界面能γ_I-W大于材料与冰以及材料与水的界面能之和γ_IRIA-I+γ_IRIA-W(γ_IRIA-I：材料与冰的界面能；γ_IRIA-W：材料与水的界面能)。

本发明中，过冷温度是指低于水的凝固点但仍不凝固或结晶的温度，在室温25℃时，所述过冷温度一般在-0.01～-0.5℃范围内，例如-0.1℃。-

本发明还提供一种冰吸附实验装置，包括多层储液腔、控温棒和温度控制器，所述多层储液腔由里到外依次包括冰吸附腔、温浴腔、冷却液储存腔，所述控温棒置于冰吸附腔内，所述控温棒和储液腔的温度由温度控制器控制。

根据本发明的冰吸附实验装置，所述控温棒为导热材料制成的中空结构，所述控温棒的中空结构设置有进液口和排液口；所述温度控制器为流体温控器，所述温度控制器设置有冷却液流出端和回流端；所述冷却液储存腔两端设置有进液口和排液口；所述温度控制器的冷却液流出端、控温棒的进液口、控温棒的排液口、冷却液储存箱的进液口、冷却液储存箱的排液口以及温度控制器的回流端依次经管道连通，所述管道内流动冷却液。

根据本发明的冰吸附实验装置，所述多层储液腔设有盖子。

使用时，所述冰吸附腔内盛放控冰材料的水溶液，中层温浴腔装有预定温度的温浴介质例如水浴、冰浴或者油浴等；冷却液温度达到设定温度后，经温度控制器流出，流入中空的控温棒中空结构，对控温棒温度实现控制，随后从控温棒排液口流出，再流入外层冷却液储存腔保持温浴介质的温度在预定水平，再经冷却液储存箱的排液口流经温度控制器的回流端进入温度控制器循环。

有益效果

本发明首次提出控冰材料需同时兼具与水和冰的亲和性，可在冰水界面吸附并铺展以更有效的抑制冰晶生长这一控冰机制，并提出一种新的控冰材料筛选方法，所述筛选方法不单单评估化合物本身的性质，还通过水溶液以及冰水界面体系的建立，实现观察和/或表征冰晶生长及材料在冰表面的吸附，进而实现冰与控冰材料之间相互作用的定量化测量，全面评估不同控冰材料在不同浓度下对于冰和水的亲和性，为相应材料控冰性能的比较以及控冰材料在具体应用时所适用的浓度范围和控冰效果提供准确参考。本发明的方法操作简单，可定量化测量，准确性高，改善了现有的通过纳升渗透压仪测定热滞后等实验方法操作复杂、难以定量的局限。

附图说明

图1：实施例1中不同浓度的a-PVA和i-PVA在水溶液中的分散尺寸分布；

图2：冰吸附实验及其装置示意图；

图3：实施例1两种PVA的冰吸附量随浓度变化图；

图4：两种PVA在DPBS溶液中冰晶生长的光学显微图片，A为a-PVA，B为i-PVA。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。此外，应理解，在阅读了本发明所公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

a-PVA:分子量约为13～23kDa，间同规整度r(diad syndiotacticity)约为55％(Sigma-Aldrich)；

i-PVA:分子量约为14～26kDa，全同规整度m(isotacticity)约为84％。

(1)测定两种PVA与水的亲和性

两种PVA在25℃水溶液中的粒径分布采用动态光散射(DLS)实验测量，实验仪器为带有恒温腔室和4mW He-Ne激光(λ＝632.8nm)的Nano ZS(Malvern Instruments)，其中散射角为173°。首先，分别配制浓度为1.0mg mL^-1、4.0mg mL^-1、10mg mL^-1、20mg mL^-1的a-PVA和i-PVA水溶液；将约1.0mL的PVA溶液装入12mm的一次性用聚苯乙烯比色皿进行测量。

结果如图1所示，相同浓度的a-PVA在水溶液中的分散尺寸远小于i-PVA。即，相比于a-PVA，i-PVA在水溶液中更倾向于以聚集状态存在。可见，上述a-PVA具有更好的水亲和性。

(2)测定两种PVA在冰水界面的铺展性能

采用冰吸附实验测定PVA在冰表面的吸附量，实验装置如图2所示。

a.将a-PVA和i-PVA用FITC Isomer I荧光标记。

b.将FITC标记的不同浓度PVA水溶液(40mL)置于烧杯中，将烧杯置于循环冷槽中并将溶液温度以及控温棒冷却到-0.1℃。

c.将控温棒***到事先冷却的FITC标记的PVA水溶液中之前，先将控温棒***液氮中预冷1.0分钟。之后，再快速的将控温棒***已经预冷的FITC标记的PVA水溶液里，以便在控温棒表面诱导一层极薄的冰层以诱导冰的生长。

d.FITC标记的PVA水溶液在过冷温度-0.1℃下持续磁力搅拌1.0小时，以待PVA逐渐吸附到冰的表面。所有吸附实验保持过冷度以及吸附时间不变以此确保所得冰的表面积在误差允许范围内几乎不变。

e.将形成的冰块从溶液中取出，并用纯水淋洗表面以除去附着在表面的溶液。将冰块融化。

f.PVA在冰表面的吸附量由冰块中溶质PVA的质量比原始溶液中溶质PVA的质量获得，PVA溶液的浓度由紫外可见分光光度法确定，体积由移液枪以及量筒确定。

冰吸附实验显示各浓度的a-PVA和i-PVA吸附量如图3所示，a-PVA在冰表面的吸附量由0.2mg mL^-1浓度时的16.3％增加到1.0mg mL^-1的28.7％，并且在浓度大于1.0mg mL^-1后，a-PVA在冰表面的吸附量达到饱和，饱和时吸附量约为36.5％。i-PVA在浓度小于1.0mgmL^-1时冰吸附量为0％～19.3％，低于同浓度下a-PVA在冰表面的吸附量。在低浓度时，两种PVA对冰的吸附皆未达到饱和，i-PVA覆盖的冰表面积低于a-PVA。

当i-PVA浓度≥1.2mg mL^-1吸附在冰面上的量高于a-PVA，并在2.0mg mL^-1时i-PVA在冰面上的吸附量达到饱和，饱和时的吸附量为56.5％。进一步说明，两种PVA对相同大小的冰表面吸附覆盖达到饱和时，所需i-PVA的量远大于a-PVA。也就是说a-PVA可以更有效的覆盖冰的表面。

(3)冰晶重结晶抑制(IRI)活性测量

冰晶重结晶抑制(IRI)活性采用“溅射冷冻法”，将上述两种PVA分别溶解分散到DPBS溶液中，将10～30μL所述溶液在1.0m以上的高度滴加到-60℃预冷的干净硅片表面，利用冷热台以10℃min^-1的速度缓慢升温到-6℃，并在该温度下退火30min，利用偏光显微镜以及高速摄像机观察记录冰晶的大小，冷热台密封，保证内部的湿度在50％左右。每一个样品重复至少三次，使用Nano Measurer 1.2统计冰晶的尺寸，结果的误差为标准偏差。

结果如图4所示，a-PVA冰晶尺寸明显小于同浓度时i-PVA的冰晶尺寸，说明a-PVA抑制冰晶生长的能力远远优于i-PVA。

根据实施例1的结果可以看出，i-PVA与水的亲和性较a-PVA弱。因此，i-PVA在水溶液以及冰水界面倾向于以聚集状态存在，而a-PVA在水溶液以及冰水界面可以很好的铺展。两种PVA对相同大小的冰表面吸附覆盖达到饱和时，所需i-PVA的量远高于a-PVA。因此，a-PVA与i-PVA相比，是更好的控冰材料，较低浓度即能起到更好的抑制冰晶生长的效果。

应用实验例1

冷冻保存液100mL：将2.0g上述a-PVA在80℃水浴中加热并磁力搅拌溶于25mL的DPBS中，待a-PVA全部溶解并冷却到室温后调节pH为7.0，为溶液1；17g(0.05mol)的蔗糖(蔗糖在冷冻保存液中终浓度为0.5mol L^-1)超声溶解于25mL的DPBS中，待蔗糖全部溶解后加入10mL乙二醇、7.5mL的DMSO，为溶液2，待溶液1及溶液2恢复至室温，再将两种溶液混匀，调节pH值并定容补齐余量至总体积的80％，20mL的血清单独存放待保存液使用时添加。

冷冻平衡液100mL：将7.5mL的乙二醇、7.5mL的DMSO溶于65mL的DPBS中，混匀，使用时加血清使其终浓度为20％(v/v)。

冷冻保存后用于解冻的解冻液为目前医疗机构普遍使用的商业化配方：解冻液Ⅰ(含有1.0mol L^-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅱ(含有0.5mol L^-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅲ(含有0.25mol L^-1蔗糖，20％的血清，余量为DPBS)；解冻液Ⅳ(20％的血清，余量为DPBS)。

采用上述配方所制备的冷冻保存液和冷冻平衡液对小鼠的***进冷冻保存。本发明所用***冷冻保存方法具体为***先置于冷冻平衡液平衡5分钟，然后置于上述配方所制备冷冻保存液45秒，将已在冷冻保存液中平衡的***放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮(-196℃)中，并封闭载杆后继续保存；将***置于37℃的解冻液Ⅰ中平衡3分钟，再依次在解冻液II-IV中各平衡3分钟；将解冻完毕的***培养2小时，发现存活率为100％。而采用现有的常规配方(平衡液：每1mL中含有7.5％(v/v)的DMSO，7.5％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，余量为DPBS；冷冻保存液：每1mL中含有15％(v/v)的DMSO,15％(v/v)的乙二醇，20％(v/v)的胎牛血清，0.5M蔗糖，余量为DPBS)，小鼠***存活率大约为95％。表明该含有a-PVA的冷冻保存液在将DMSO含量降低50％的前提下，仍能实现冷冻保存***并复苏后具有更高的存活率，也证实了a-PVA是优良的冷冻保存材料。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种筛选控冰材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)测得所述控冰材料与水的亲和性；(2)测得所述控冰材料在冰水界面的铺展性能。

2.根据权利要求1所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，所述步骤(1)通过测定所述控冰材料在水中的溶解度、水合常数、分散尺寸、和/或所述控冰材料分子与水分子形成的分子间氢键数的方法测定。

3.根据权利要求1或2所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，所述步骤(2)为采用冰吸附实验测得所述控冰材料在冰表面的吸附量，

所述控冰材料在冰表面的吸附量＝(冰表面所吸附的控冰材料质量m₁/含有控冰材料的原溶液中控冰材料的总质量m₂)╳100％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，所述冰吸附实验包括：

S1:配制所述控冰材料的水溶液，降温至过冷温度；

S2:将预冷的控温棒置于所述水溶液中诱导冰层在控温棒表面生长，持续搅拌水溶液，以待控冰材料逐渐吸附于冰层表面，保持控温棒、水溶液温度在过冷温度；

S3:测定控冰材料在冰表面的吸附量；

优选地，所述控温棒经液氮、干冰、或超低温冰箱冷冻中的任一种进行预冷。

5.根据权利要求1-4任一项所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，所述冰吸附实验过程中，保持过冷度以及吸附时间恒定以此确保所得冰的表面积在误差允许范围内保持不变。

6.根据权利要求4-5任一项所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，所述步骤S1中控冰材料为预先荧光标记的，例如用荧光素进行标记。

7.根据权利要求4-6任一项所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，步骤S3包括:

S3a:将吸附完成的冰块取出，纯水洗涤，融化得到控冰材料吸附溶液；

S3b:测定融化的控冰材料吸附溶液的体积V，测定所述吸附溶液中控冰材料的质量/体积浓度c，通过公式m₁＝cV计算得到冰表面所吸附的控冰材料质量m₁。

8.根据权利要求7所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，所述S3b中，所述浓度c通过紫外可见光谱法测得。

9.根据权利要求1-8任一项所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，所述方法用于控制冰晶生长材料的筛选。

10.根据权利要求1-9任一项所述的筛选控冰材料的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(3)：评估所述材料与水的亲和性和与冰的亲和性，水亲和性和冰亲和性都强的材料具有良好的控冰性能。

11.一种冰吸附实验装置，包括多层储液腔、控温棒和温度控制器，所述多层储液腔由里到外依次包括冰吸附腔、温浴腔、冷却液储存腔，所述控温棒置于冰吸附腔内，所述控温棒和储液腔的温度由温度控制器控制。

12.根据权利要求11的冰吸附实验装置，所述控温棒为导热材料制成的中空结构，所述控温棒的中空结构设置有进液口和排液口；所述温度控制器为流体温控器，所述温度控制器设置有冷却液流出端和回流端；所述冷却液储存腔两端设置有进液口和排液口；所述温度控制器的冷却液流出端、控温棒的进液口、控温棒的排液口、冷却液储存箱的进液口、冷却液储存箱的排液口以及温度控制器的回流端依次经管道连通，所述管道内流动冷却；

优选，所述多层储液腔设有盖子；

优选，所述冰吸附实验装置在使用时，所述冰吸附腔内盛放控冰材料的水溶液，中层温浴腔装有预定温度的温浴介质例如水浴、冰浴或者油浴等；冷却液温度达到设定温度后，经温度控制器流出，流入中空的控温棒中空结构，对控温棒温度实现控制，随后从控温棒排液口流出，再流入外层冷却液储存腔保持温浴介质的温度在预定水平，再经冷却液储存箱的排液口流经温度控制器的回流端进入温度控制器循环。