CN111778352A

CN111778352A - 与小麦粒重相关的kasp引物组及其应用

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Publication number: CN111778352A
Application number: CN202010780196.6A
Authority: CN
Inventors: 姜朋; 马鸿翔; 张旭; 吴磊; 何漪
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2040-08-05
Also published as: CN111778352B

Abstract

本发明公开一组与小麦粒重相关的KASP引物组及其应用，该引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的F1引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的F2引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物；该KASP引物组可用于配制PCR检测体系，进行小麦粒重筛选，可广泛应用于小麦育种领域。

Description

与小麦粒重相关的KASP引物组及其应用

技术领域

本申请涉及小麦育种领域，特别是一种与小麦粒重相关的KASP标记及其应用。

背景技术

高产是小麦育种的重要目标，而粒重是产量的构成要素之一，其主要受加性效应的控制，在产量因素中遗传力最高，可达59-80％(肖世和,何中虎.“小麦产量潜力和品质的改良”，见:庄巧生.《中国小麦品种改良及系谱分析》.北京:中国农业出版社,2003.pp 497-542)。小麦粒重为数量性状，呈现连续变异，受微效多基因调控(Zhang L Y,Liu D C,Guo XL,Yang W L,Sun J Z,Wang D W,Zhang A.Genomic Distribution of QuantitativeTrait Loci for Yield and Yield-Related Traits in Common Wheat.Journal ofIntegrative Plant Biology,2010,52:996-1007)。

关于小麦粒重的遗传定位研究已有诸多报道：Mason等对不同播期下的小麦产量性状进行调查，在2D和5A染色体上检测到2个千粒重QTL(Mason R E,Hays D B,Mondal S,Ibrahim A M H,Basnet B R.QTL for Yield,Yield Components and CanopyTemperature Depression in Wheat under Late Sown Field Conditions.Euphytica,2013,194:243-259)；Li等对3个RIL群体进行了多环境产量性状鉴定，鉴定到17个千粒重QTL(Li F,Wen W,He Z,Liu J,Jin H,Cao S,Geng H,Yan J,Zhang P,Wan Y,XiaX.Genome-wide linkage mapping of yield-related traits in three Chinese breadwheat populations using high-density SNP markers.Theoretical and AppliedGenetics,2018,131:1903–1924)。Tura等在32个环境中对一个DH群体开展了产量性状评价，鉴定27个千粒重QTL，并对主效位点QTgw.aww-1B进行了精细定位(Tura H,Edwards J,Gahlaut V,Garcia M,Sznajder B,Baumann U,Shahinnia F,Reynolds M,Langridge P,Balyan H S,Gupta P K,Schnurbusch T,Fleury D.QTL Analysis and Fine Mapping ofa QTL for Yield-Related Traits in Wheat Grown in Dry and HotEnvironments.Theoretical and Applied Genetics,2020,133:239-257)。由于作图群体、分子标记的差异，定位结果存在较大差异。

随着分子生物学的发展，分子标记从RFLP、RAPD和SSR等发展到近年来的SNP标记。SNP具有遗传稳定、数量多、分布广等特点，并且适于高通量检测，基于其开发的9k、90k、660k等基因型芯片集合了成千上万个SNP标记，大大提高了遗传图谱的质量(Cavanagh CR,Shiaoman C,Shichen W,Bevan Emma H,Stuart S,Seifollah K,Kerrie F,Cyrille S,Brown-Guedira G L,Alina A.Genome-Wide Comparative Diversity Uncovers MultipleTargets of Selection for Improvement in Hexaploid Wheat Landraces andCultivars.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates,2013,110:8057-8062；Wang S,Wong D,Forrest K,Allen A,Chao S,Huang B E,Maccaferri M,Salvi S,Milner S G,Cattivelli L.Characterization of PolyploidWheat Genomic Diversity Using a High-Density 90,000Single NucleotidePolymorphism Array.Plant Biotechnology Journal,2014,12:787-796；Cui F,Zhang N,Fan X,Zhang W,Zhao C,Yang L,Pan R,Chen M,Han J,Zhao X.Utilization of aWheat660k Snp Array-Derived High-Density Genetic Map for High-ResolutionMapping of a Major QTL for Kernel Number.Scientific Reports,2017,7:3788)。基于SNP位点差异，还可开发特异匹配引物末端碱基的KASP(Kompetitive Allele SpecificPCR)标记，可对SNP位点进行精准的双等位基因判断，并具有高通量的特点，适于大量样本的分子标记检测，与育种选择相契合，在育种中具有广泛应用前景(Semagn K,Babu R,Hearne S,Olsen M.Single Nucleotide Polymorphism Genotyping Using KompetitiveAllele Specific Pcr(Kasp):Overview of the Technology and Its Application inCrop Improvement.Molecular Breeding,2014,33:1-14)。

宁麦9号与扬麦158分别是由江苏省农业科学院与江苏里下河地区农科所育成的高产优质抗病小麦品种，不仅在生产上具有较大的推广面积，而且是重要的育种亲本，近10年长江中下游冬麦区国家区试与江苏省淮南区试各有36和34个品种通过审定，含有宁麦9号或扬麦158的遗传背景的材料均为27个，占比近80％。目前，关于扬麦158与宁麦9号粒重相关的分子标记尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本申请提供一个扬麦158与宁麦9号粒重相关的QTL-Qtkw-1B对应的KASP引物组，该引物组可以迅速对长江中下游麦区(程顺和,郭文善,王龙俊.中国南方小麦.南京:江苏科学技术出版社,2012.pp 23-26)的小麦材料进行粒重相关的基因分型，加速育种进程。

具体而言，本申请首先提供了一组与小麦粒重相关的KASP引物组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物Kukri_c42354_263(F1)、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物Kukri_c42354_263(F2)、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用引物Kukri_c42354_263(R)。

本申请还提供了上述KASP引物组在检测小麦粒重中的应用，其具体步骤如下：利用上述KASP引物组配制成PCR检测体系并对样品小麦DNA进行PCR扩增，同时以扬麦158与宁麦9号作为对照；然后利用荧光分析仪对样品小麦PCR扩增产物并进行基因分型，与扬麦158聚集的样品含有T等位变异，与宁麦9号聚集的样品含有C等位变异，含有等位变异T的小麦样品粒重显著高于含有等位变异C的小麦样品。荧光检测中，荧光分析仪对小麦1B染色体35.25～39.55cM位置处QTL--Qtkw-1B进行基因分型，其所涉及的SNP位点为T/C，含有等位基因T的小麦千粒重显著高于含有等位基因C的小麦。扬麦158含有的优势等位变异为T，与引物F1结合；C为非优势等位变异，可与引物F2结合，从而利用KASP引物组将二者区分；进一步，上述应用中，所述小麦优选长江中下游麦区小麦。

进一步，上述PCR反应总体系为5μL，包含2×KASP Master Mix 2.5μL、KASP AssayMix 0.07μL、浓度为20ngμL^-1的模板DNA 2.43μL；

其中，每100μL的KASP Assay Mix配制方法如下：100μM的F1引物12μL、100μM的F2引物12μL、100μM的通用引物30μL、ddH₂O补足至100μL；所述F1引物为核苷酸序列SEQ IDNO.1前部添加能够与FAM荧光结合的序列(优选序列SEQ ID NO.10)后获得的引物序列；所述F2引物为核苷酸序列SEQ ID NO.2前部添加能够与HEX荧光结合的序列(优选序列为SEQID NO.11)后获得的引物序列；所述通用引物序列如SEQ ID NO.3所示。

PCR反应程序为：第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s，61～55℃，1min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步：94℃，20s，55℃，1min，共进行26个循环。

进一步而言，上述PCR反应总体系中，所使用的F1引物序列如SEQ ID NO.12所示，F2引物序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明同时还提供了一种用于检测小麦粒重的试剂盒，包括：2×KASP MasterMix 2.5μL、KASP Assay Mix 0.07μL、浓度为20ngμL^-1的模板DNA 2.43μL；KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM的F1引物(SEQ ID NO.12)12μL、浓度为100μM的F2引物(SEQ ID NO.13)12μL、100μM的通用引物(SEQ ID NO.3)30μL、加入ddH₂O补足至100μL。

本发明利用illumina 90k芯片对宁麦9号×扬麦158构建的282个重组自交系(F2-F8代)进行基因组扫描，构建遗传图谱，遗传图谱覆盖21条染色体；结合3个环境的表型鉴定数据进行QTL定位，最终在1B染色体上检测到一个来源于扬麦158的粒重QTL--Qtkw-1B，进一步转化为KASP标记，并验证其对小麦千粒重影响显著，可应用于育种选择。

附图说明

图1为Qtkw-1B遗传定位示意图；

图2为Qtkw-1B区间内不同引物扩增结果图。

具体实施方式

以下实施例涉及的宁麦9号、扬麦158及其重组自交系群体均由江苏省农业科学院麦类作物研究室保存。

实施例涉及的核苷酸序列：

SEQ ID NO.1:TCGACGATACTGGCGGTGTA

SEQ ID NO.2:TCGACGATACTGGCGGTGTG

SEQ ID NO.3:TGATCGCAAAGTGCATTATGTT

SEQ ID NO.4:AACGACGCCTGGTTTTCCTCA

SEQ ID NO.5:CGACGCCTGGTTTTCCTCG

SEQ ID NO.6:TCCGAGATGGACGAGGAACTG

SEQ ID NO.7:TGTTCTTACCTGAACTTGTGTGACA

SEQ ID NO.8:GTTCTTACCTGAACTTGTGTGACG

SEQ ID NO.9:CTGAAGCTCTGATATCATCATCATCC

SEQ ID NO.10:GAAGGTGACCAAGTTCATGCT

SEQ ID NO.11:GAAGGTCGGAGTCAACGGATT

SEQ ID NO.12:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCGACGATACTGGCGGTGTA

SEQ ID NO.13:GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCGACGATACTGGCGGTGTG

实施例1筛选千粒重标记区间

以宁麦9号×扬麦158构建重组自交系(RIL)群体(F_2:8)，包括282个家系。2016—2017和2017—2018连续2个生长季将RIL群体及其亲本种植于江苏省农业科学院六合基地。

采用增广设计(参见文献“Lan C,Zhang Y,Herrera-Foessel S A,Basnet B R,Huerta-Espino J,Lagudah E S,Singh R P.Identification and characterization ofpleiotropic and co-located resistance loci to leaf rust and stripe rust inbread wheat cultivar Sujata.Theoretical and Applied Genetics,2015,128:549-561”)，2个亲本及随机选取的30个材料种植2次重复，其余材料1次重复，三行小区种植，每行60粒，行长1.6m，行距0.25m，常规栽培管理。籽粒成熟后收获，利用万深籽粒考种机(SC-A1，浙江杭州)进行千粒重测定。另同时测量139份小麦高代品系材料(申请人将其自命名为Line001-Line139)的千粒重，用于后续验证。

采用illumina 90k芯片获取基因型。遗传图谱覆盖21条染色体，包含41个连锁群，2285个bin标记，总长为3022cM(Jiang P,Zhang X,Wu L,He Y,Zhuang W,Cheng X,Ge W,MaH,Kong L.A Novel QTL on Chromosome 5al of Yangmai 158Increases Resistance toFusarium Head Blight in Wheat.Plant Pathology,2020,69:249-258)。采用IciMapping4.1软件的完备区间作图法(inclusive composite interval mapping，ICIM)进行QTL定位(Meng L,Li H,Zhang L,Wang J.QTL Icimapping:Integrated Software for GeneticLinkage Map Construction and Quantitative Trait Locus Mapping in BiparentalPopulations.The Crop Journal,2015,3:269-283)，walking step设为0.1cM，LOD阈值设为2.5。

通过QTL定位检测到一个稳定的粒重QTL--Qtkw-1B(图1)，在2016—2017和2017—2018两个环境中均检测到，位于1B染色体35.25～39.55cM位置处(该位置未见千粒重QTL的相关报道)，对应染色体区间为IAAV1683～IAAV565，物理区间为640～653Mb，千粒重增加的优势等位变异来源于扬麦158。

实施例2 KASP分子标记筛选与验证

为了更好地对实施例1筛选获得的Qtkw-1B位点进行育种利用，基于其区间标记序列开发了适于高通量分型的KASP标记。根据SNP位点和侧翼序列设计PCR扩增引物，开发KASP分子标记。

利用Polymarker(http://www.polymarker.info/)进行KASP引物设计，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。每个标记设计2条SNP特异性引物(F1/F2)和一条通用引物(R)，F1引物前部添加能够与FAM荧光结合的特异性序列(SEQ ID NO.10:5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’)，F2引物前部添加能够与HEX荧光结合的特异性序列(SEQ IDNO.11:5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’)。从该标记区间多个SNP位点中选择3个同源性较低的SNP标记进行引物设计如表1所示：

表1引物设计

从RILs群体中随机挑选46份材料进行幼嫩叶片取样，采用CTAB法(参见文献“Saghai-Maroof M A,Soliman K M,Jorgensen R A,Allard R W.Ribosomal DNA Spacer-Length Polymorphisms in Barley:Mendelian Inheritance,Chromosomal Location,andPopulation Dynamics.Proceedings of the National Academy of Sciences,1984,81:8014-8018”)提取基因组DNA。

KASP反应总体系为5μL，包含2×KASP Master Mix 2.5μL(KBS-1016-002,购自LGC)、KASP Assay Mix0.07μL、浓度为20ngμL^-1的模板DNA 2.43μL；其中，每100μL的KASPAssay Mix配制方法如下：100μM的F1引物12μL、100μM的F2引物12μL、100μM的通用引物30μL、ddH₂O补足至100μL；所述F1引物为核苷酸序列SEQ ID NO.1前部添加能够与FAM荧光结合的序列(本实施例中使用的与FAM荧光结合的序列如SEQ ID NO.10所示)后获得的引物序列；所述F2引物为核苷酸序列SEQ ID NO.2前部添加能够与HEX荧光结合的序列(本实施例中使用的与HEX荧光结合的序列如SEQ ID NO.11所示)后获得的引物序列；具体而言，Kukri_c42354_263组所使用的合成后的F1序列如SEQ ID NO.12所示，所使用的合成后的F2引物序列如SEQ ID NO.13所示。

KASP反应程序为：第一步：94℃，15min；第二步：94℃，20s，61～55℃，1min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步：94℃，20s，55℃，1min，共进行26个循环。

PCR在购买自LGC公司型号为Hydrocycler ¹⁶的水浴PCR仪中进行。通过荧光分析仪(购自LGC，型号为PHERAstar plus)扫描分析PCR结果。

扩增时，加入宁麦9号和扬麦158作为对照组，与扬麦158聚集的为T等位变异，与宁麦9号聚集的为C等位变异。经过扩增验证，引物Kukri_c42354_263扩增效果良好(图2)，可应用于Qtkw-1B的育种选择，其优势等位变异为来源于扬麦158的T，非优势等位变异为来源于宁麦9号的C。

进一步利用开发成功的KASP标记(引物Kukri_c42354_263)对139份小麦高代品系材料进行基因分型，具体的基因型与表型值见表2：

表2

表2(续)

表3 t-检验结果

注：括号中数字表示携带相应等位变异的材料数量。

结合表型及基因型对表2检测数据进行常规t-检验，检测结果如表3所示，P<0.01显示差异达到极显著水平，表明其T/C在千粒重选择中均具有显著作用，携带T优势等位变异的材料的千粒重显著高于携带C非优势等位变异的材料。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 与小麦粒重相关的KASP引物组及其应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgacgatac tggcggtgta 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgacgatac tggcggtgtg 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatcgcaaa gtgcattatg tt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacgacgcct ggttttcctc a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgacgcctgg ttttcctcg 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccgagatgg acgaggaact g 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgttcttacc tgaacttgtg tgaca 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttcttacct gaacttgtgt gacg 24

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgaagctct gatatcatca tcatcc 26

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaggtgacc aagttcatgc ttcgacgata ctggcggtgt a 41

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaaggtcgga gtcaacggat ttcgacgata ctggcggtgt g 41

Claims

1.一组与小麦粒重相关的KASP引物组，其特征在于，所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物、核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的通用引物。

2.如权利要求1所述的KASP引物组在检测小麦粒重中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：利用所述KASP引物组配制成PCR检测体系并对样品小麦DNA进行PCR扩增，同时以扬麦158与宁麦9号作为对照，然后利用荧光分析仪对样品小麦PCR扩增产物并进行基因分型；则与扬麦158聚集的样品含有T等位变异，与宁麦9号聚集的样品含有C等位变异，含有等位变异T的小麦样品粒重显著高于含有等位变异C的小麦样品。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述PCR检测体系为5μL，包含2×KASPMaster Mix 2.5μL、KASP Assay Mix 0.07μL、浓度为20 ng μL^‒1的模板DNA 2.43 μL；

其中，每100μL 的KASP Assay Mix配制方法如下：100μM 的F1引物12μL、100μM 的F2引物 12μL 、100μM 的通用引物 30μL、ddH₂O补足至100μL；

所述F1引物为核苷酸序列SEQ ID NO.1前部添加能够与FAM荧光结合的序列后获得的引物序列；

所述F2引物为核苷酸序列SEQ ID NO.2前部添加能够与HEX荧光结合的序列后获得的引物序列；

所述通用引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

PCR扩增程序为：第一步：94℃，15 min；第二步：94℃，20 s，61~55℃，1 min，每个循环降低0.6℃，共进行10个循环；第三步：94℃，20 s，55℃，1 min，共进行26个循环。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述F2引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

6.一种用于检测小麦粒重的试剂盒，包括：2×KASP Master Mix 2.5 μL、KASP AssayMix 0.07 μL、浓度为20 ng μL^‒1的模板DNA 2.43 μL；

所述KASP Assay Mix配制方法如下：每100μL KASP Assay Mix包含浓度为100μM 的F1引物 12μL、浓度为100μM 的F2引物 12μL 、100μM 的通用引物 30μL、加入ddH₂O补足至100μL；

所述F1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述F2引物核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，所述通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。