CN110004242B - 甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF0239引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体公开了甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF0239引物及其应用，申请人通过对中双11号和73290的F2和F2:3家系分离群体进行田间实验和性状调查获得开花期性状的表型数据；结合F2分离群体的基因型和遗传图谱，进行QTL检测，获得了A2连锁群上共同控制油菜开花期和成熟期的主效基因位点，其对油菜开花期的贡献率为17.2%，加性效应为2.1，显性效应为0.9；对油菜成熟期的贡献率为9.4%，加性效应为0.6，显性效应为0.4。通过检测与成熟期性状相关的分子标记，即可预测成熟期的长短，进而准确快速筛选早熟品种。

Description

甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记 BrSF0239引物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，更具体涉及甘蓝型油菜开花期和成熟期主 效QTL位点的分子标记BrSF0239引物及其应用。

背景技术

油菜是我国第一大油料作物，约占世界油菜产量的20％(Hu et al.,2016)。菜籽油是 国产食用植物油的第一大来源，占国产食用植物油总量的57.2％，在国家食用油供给中占有 十分重要的地位(范成明等，2018)。我国国产植物油对外依存度已超过60％，且有继续 增加的趋势(王汉中等，2014)。另外，菜籽油与柴油有较为相近的脂肪酸构成，是一种绿 色可再生能源。

虽然我国是世界上最大的菜籽油生产国，但植物油的供给量还是严重不足，每年仍需大 量进口。导致这一现象的主要原因是油菜的经济效益不高，虽然我国油菜种植总面积位居世 界第一，但人均种植面积很少，加之近年来油菜与粮棉作物茬口矛盾突出，油菜种植面积持 续降低(官春云等2010)。双季稻与油菜的季节矛盾是南方双季稻种植区冬季大量田地闲置 的主要原因，解决这个矛盾的根本途径是油菜的早熟育种。已有的研究表明早熟油菜一般早 花，早花与早熟成正相关(Campbell and Kondra 1978；高永同1979)，因此研究油菜开花 期相关QTL对油菜早熟改良，加快油菜早熟育种具有重要意义。

虽然传统育种方法曾经为生产提供了许多优良油菜品种,但由于育种周期长、选择效率 低,已经无法完全满足当前油菜生产的需要。随着分子生物学和分子遗传学的发展,育种家 们对性状的选择正在逐渐实现由表型选择向基因型选择的过渡。分子标记辅助育种是将分子 遗传学与传统的表型选择有效结合的一种新的育种手段,其基本原理是在油菜育种过程中直 接利用与目标性状基因紧密连锁和共分离的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因 组筛选,以达到提高目标性状选择效率、缩短育种年限的目的。分子标记辅助选择育种技术 的关键是鉴定与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记。近年来，美国等发达国家都投入 巨资开展这方面的研究工作。伴随着水稻、玉米、小麦等重要作物农艺性状分子标记的开发， 利用筛选到的分子标记进行辅助选择育种已渐趋成熟，目标性状也从简单的单基因质量性状 扩展到复杂的多基因数量性状。随着基因组学和测序技术的高速发展，油菜分子标记研究日 渐受到关注，研究的领域涉及种质遗传多样性分析、遗传图谱的构建、基因标记和定位、品 种纯度鉴定、配合力预测、标记辅助选择等多方面，并取得了重要进展。但与发达国家相比， 我国油菜分子育种研究还有较大差距，主要体现在：不能有效地发掘和利用种质资源中的有 利基因，缺乏有自主知识产权及育种价值的基因和标记等。

随着分子标记技术的不断发展，其在作物中的应用越来越广泛。Grodzicker等(1974) 创立了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)标记技术。R FLP是第一代分子标记，具有数量丰富、稳定遗传、专一性、重复性好、共显性等特点。但 是，该标记对DNA要求量比较大；且操作程序繁琐、耗时费力、周期长；还需要使用放射 性同位素对探针进行标记，这些因素都局限了RFLP标记的广泛使用。AFLP标记结合了P CR和RFLP标记技术，在作物遗传多样性研究、细胞学研究、品种纯度鉴定和抗病等研究 中得到广泛的应用(宋顺华等，2006；袁素霞，2009；王雪，2004)。但AFLP标记也存在一些缺点：成本较高，过程复杂，技术难度大；标记大多为显性标记；对DNA质量和限制 性内切酶质量要求较高。SSR标记，也叫微卫星DNA标记(microsatellite DNA)，已经被 广泛应用于作物的基因定位、分子标记辅助选择、DNA指纹图谱、品种纯度鉴定、种质资 源的保存及利用和遗传多样性分析等研究中(陈烨丽，2010；缪体云，2007；荆赞革，201 0；王冬梅，2011)。SSR标记具有数量丰富、多态性高、操作简单、成本较低等优点，长期 以来被广泛引用于分子标记辅助选择。近十年来，随着测序技术的持续进步，使得基于基因 组序列信息的分子标记开发成为可能，如SNP标记和InDel标记(Hyten et al.，2010)。目 前，全基因组选择育种芯片还只在水稻中开始尝试(Yu et al.,2014)，油菜等其他作物仍 以分子标记辅助选择为主。

大多数重要的农艺性状(如产量、品质、抗性等)均表现数量性状的遗传特点，表型连 续分布且易受环境条件的影响，因此基于表型选择的常规育种方法对复杂数量性状的选择效 果不好，致使育种效率低下，育种周期延长。由于分子标记技术和数量遗传学的发展和结合， 人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitativetrait loci,QTL)， 然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。QTL定位就是在遗传分离 群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用QTL作图软件对分离群体的数量性状表型 数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。甘蓝型油菜开花期的遗传 研究结果均表明开花期是由多基因控制且存在主基因效应的数量性状(Zaman et al.，1995； Lagercrantz et al.，1996；Osborn et al.，1997；蔡长春等，2007)目前对油菜开花期和成熟 期的QTL定位研究也有一些报道，但通常检测出的QTL效应值较小且重复性不好，较难在 油菜育种中应用。Raman等(2013)利用两个春油菜品种Skipton和Ag-Spectrum为亲本的 DH群体，研究表明开花期是一个复杂的性状，调控开花期QTL分布在10条不同染色体上， 由至少20个QTL位点参与调控，单个表型变异率为2.4％-28.6％；比较QTL位置和已测序 白菜基因组注释的开花相关基因的物理位置，结果显示位于A02、A03、A07和C06上的开 花期相关QTL可能代表拟南芥中已知与开花期相关基因的同源基因。Wei等(2014)进行 开花期QTL定位，检测到17个与开花期相关QTL；同时在A02连锁群上发现两个与开花 期相关QTL，单个QTL的表型变异贡献率3.29％-5.17％。本研究通过QTL定位，旨在筛选 到油菜早花早熟相关QTL位点，用于油菜早花早熟性状的标记辅助选择。

发明内容

本发明目的是在于提供了甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF02 39引物，所述的引物为：TGTGTGGAACAGTGTTTGGAA和TCTCTGGCTCTCTT TCGCTC。

本发明的另一个目的在于提供了甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记B rSF0239引物的应用，所述的QTL位点的效应值和贡献率都较高，对油菜开花期的调控起 着关键作用，该引物可用作图位克隆、油菜高产育种、分子标记辅助选择。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

油菜开花期性状的QTL位点的获得，它包括如下步骤：

(1)利用在开花期上有极显著差异的油菜品种中双11号和73290杂交，杂种F1代自交 产生F2群体及其F2:3家系。

(2)采用CTAB法(Doyle et al.1987)提取亲本中双11和73290及F2分离群体的叶片总DNA。

(3)合成油菜公开(http://www.ukcrop.net/Brassica DB)和自主开发的SSR和InDel引 物，并对亲本DNA进行PCR扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对 条带的大小进行判别，筛选多态性引物。

(4)利用多态性引物对F2分离群体进行分子标记分析，获得基因型数据。

(5)把F2分离群体的基因型数据输入Joinmap4.0软件(商业途径获得)，进行遗传连 锁图谱的构建；

(6)F2群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记)以及F2群体及其F2:3家系的开花期和成熟期性状数据输入WinQTLcart2.5软件进行QTL定位。其中，位于A2 连锁群上的QTL在三个群体中能重复检测到，而且效应值和贡献率较大。

利用上述技术措施，申请人最终获得了一个同时控制甘蓝型油菜开花期和成熟期多效性 主效QTL位点，与申请人自主开发的SSR标记BoSF0239紧密连锁，针对BoSF0239F设计 其引物序列为5’-TGTGTGGAACAGTGTTTGGAA-3’；BoSF0239R:5’-TCTCTGGCTCTCTTTCGCTC-3’。利用WinQTLCart2.5软件分析测得其对油菜开花期的贡献率为17.2％，加性效应为2.1，显性效应为0.9；对油菜成熟期的贡献率为9.4％，加性效应为0.6， 显性效应为0.4。

甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF0239引物的应用，包括利 用本发明提供的引物，利用该引物可用于甘蓝型油菜的育种，包括筛选早花早熟单株，用于 甘蓝型油菜的图位克隆或是用于甘蓝型油菜分子标记辅助选择。

与现有技术相比，本具有以下优点：

本发明定位了油菜品种中双11号控制开花期的重要QTL位点，该标记与离主效基因位 点的遗传距离很近(<2cM)且是基于基因组序列信息的共显性SSR标记，因而可靠且使用 方便，这给今后中双11号衍生品系的选育提供了极大的便利。可分别解释17.2％和9.4％的 表型方差。在常规育种方法中，开花期和成熟期性状表型鉴定要等到成熟考种，费时费力且 选择效率低下(开花期和成熟期表型受环境影响较大)。通过检测开花期和成熟期性状主效 基因位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中主效 基因位点位置明确，主效基因位点的检测方法方便快速，不受环境影响。利用该标记对两亲 本衍生的后代群体进行检测，证明其效应，检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与 开花期成熟期性状相关的分子标记，即可预测开花期和成熟期的长短，进而准确快速筛选早 花早熟品种。

附图说明

图1为F2:3家系在不同环境种植时开花期的频率分布图；

结果表明开花期表型呈正态分布，且变异范围很宽，证明开花期属于数量性状。

图2为F2:3家系在不同环境种植时成熟期的频率分布图；

结果表明成熟期表型呈正态分布，且变异范围很宽，证明成熟期属于数量性状。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未 特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

油菜开花期分离群体的构建及性状测定：

本实施例中使用油菜测序品种中双11和另一个遗传差异大的油菜品种73290杂交，杂种F 1代自交产生F2群体及其F2:3。其中，中国农科院油料所阳逻综合试验基地，于2009年种植F 2群体，2010，2011和2012年种植F2:3家系群体。两亲本和分离群体的开花期和成熟期表型 在成熟期收获后经考种鉴定。考种数据表明：开花期和成熟期在3个环境下的均值均呈正态 分布，表明开花期和成熟期性状的数量遗传特征(图1、图2)。

实施例2：

引物的开发和合成：

申请人利用的SSR引物包括两类：一类是已发表文章和芸苔属数据库中公开引物序列 (http://www.brassica.info/resource/markers/ssr-exchange.php)；另一类是申请人根据白菜和甘 蓝scaffold序列开发的，分别命名为BrSF和BoSF系列，具体的开发方法是先利用SSR Hu nter软件在每个scaffold搜索SSR，然后用Primer3.0软件设计SSR引物。自主开发的InDe l引物则是通过比对73290的重测序序列和中双11的参考基因组序列而来，首先，利用BW A软件把73290的重测序序列定位到中双11的全基因组参考序列上，然后利用samtools软 件查找InDel。

实施例3：

引物多态性的筛选，其流程如下：

(1)从亲本中各随机选择10株DNA等量混合，作为筛选引物的模板。

(2)利用溶解后的引物对亲本DNA进行PCR扩增，

反应体系：

PCR反应程序：

(3)凝胶电泳带型判读

实施例4：

F2群体基因型分析、遗传连锁图谱构建和QTL定位，其步骤如下：

(1)采用CTAB法提取F2群体179个单株的DNA；

(2)挑选出多态性引物对F2群体179个单株的DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。本发明涉及到的分子标记为共显性标记，即差异条带表现为位置上(既扩增产物大小)的变异，分离群体的带型依情况分别读作A、 B和H，分别表示来源于中双11号、73290和杂合带型。

(3)通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。

(4)利用Joinmap4.0软件对F2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标 记遗传连锁图谱，获得19个连锁群(含805个分子标记)，恰好对应甘蓝型油菜的19条染 色体。

(5)基于该遗传图谱、F2群体的基因型数据，以及F2群体及其F2:3家系的开花期和成熟期性状数据，利用QTLCart2.5软件进行QTL检测，在A2染色体SSR标记BoSF0239 附近(表1)检测到了两个重复性很好的主效QTL位点，其LOD值和贡献率都较大(表2)， 其中一个对油菜开花期的贡献率为17.2％，加性效应为2.1，显性效应为0.9；另一个位点对 油菜成熟期的贡献率为9.4％，加性效应为0.6，显性效应为0.4。

针对BoSF0239分子标记设计的引物为表1所示，利用该引物，在中双11号中扩增得到 一个条带，大小为148bp，在本发明中记为A；在73290中扩增得到的一个条带，大小为152bp，在本发明中记为B；在杂合子中扩增得到的两个条带，大小为148bp和152bp。

表1 A2连锁群开花期和成熟期主效QTL连锁标记BoSF0239的引物序列

表2 A2连锁群开花期和成熟期主效QTL的基本信息

实施例5：

开花期和成熟期主效QTL连锁标记BoSF0239的有效性验证，其步骤是：

(1)田间种植中选F2单株的F3代种子，在多年多点进行种植。

(2)在定苗后对F3单株挂牌取样，并提取叶片总DNA，利用分子标记BoSF0239对其进 行开花期主效QTL基因型的分析。

(3)对F3单株开花期和成熟期进行记录。结果表明，分子标记辅助选择挑选出来的732 90背景单株其开花期均值(171.6天)短于中双11号背景单株均值(177.1天)，且73290背 景单株其开花期短于中双11号背景群体均值的单株占群体的比率为91.7％(表3)；同时7 3290背景单株其成熟期均值(232.9天)短于中双11号背景单株均值(233.4天)，且73290背景单株其成熟期短于中双11号背景群体均值的单株占群体的比率为61.5％(表4)。可见在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而可以快速筛选出早花早熟 株系用于油菜育种。

表3利用SSR标记BoSF0239辅助选择得到的F3单株的开花期调查数据

注：A、B分别代表来源于亲本中双11和73290的分子标记带型

表4利用SSR标记BoSF0239辅助选择得到的F3单株的成熟期调查数据

注：A、B分别代表来源于亲本中双11和73290的分子标记带型。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记BrSF0239引物及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtgtggaac agtgtttgga a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctctggctc tctttcgctc 20

Claims (2)

1.甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记引物在甘蓝型油菜早花或早熟筛选育种中的应用，所述的引物为：TGTGTGGAACAGTGTTTGGAA和TCTCTGGCTCTCTTTCGCTC。

2.甘蓝型油菜开花期和成熟期主效QTL位点的分子标记引物在早花或早熟甘蓝型油菜分子标记辅助选择中的应用，所述的引物为：TGTGTGGAACAGTGTTTGGAA和TCTCTGGCTCTCTTTCGCTC。

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