CN111777678A

CN111777678A - 一种egfr l858r 新抗原表位肽及其在***中的应用

Info

Publication number: CN111777678A
Application number: CN201910437056.6A
Authority: CN
Inventors: 杜学明; 李凤娥; 霍冲; 邓丽刚; 邹庆薇; 王亚玲
Original assignee: Tianjin Hengjia Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Tianjin Hengjia Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2020-10-16

Abstract

本发明提供一种EGFR L858R新抗原表位肽及其在***中的应用，所述的EGFR L858R新抗原表位肽序列含有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中的一条或不同的两条，或含有对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2中的一条或不同的两条所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列。该新抗原表位肽可以激活T淋巴细胞，特异性杀伤带有EGFR L858R突变的HLA‑A*1101肿瘤细胞，应用于制备治疗如非小细胞肺癌的癌症药物中。

Description

一种EGFR L858R 新抗原表位肽及其在***中的应用

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，涉及抗原表位肽，具体涉及一种EGFR L858R新抗原表位肽及其在***中的应用。

背景技术

肺癌是临床常见的高度恶性肿瘤，预后极差，五年生存率不足10%。按照组织学分型，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌发病率约占80%。手术是治疗肺癌首选和最主要的治疗方法。但半数以上的非小细胞肺癌患者在首次诊断时已经发生了远处转移，失去了手术治疗的机会。肿瘤靶向药物的出现，在很大程度的改变了肿瘤的传统治疗模式，大大的改善了患者的预后，显著延长了无进展生存期和总生存期，特别是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）的出现。表皮生长因子受体(EGFR)突变能够发生在大约一半的非小细胞肺癌患者，其介导的信号通路激活在非小细胞肺癌的发生、发展中起着不可缺少的作用。非小细胞NCCN指南推荐有EGFR基因突变的晚期肺癌患者将靶向药物作为一线治疗方案。EGFR基因是由28个外显子组成，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码，其中外显子18-21是最见的基因突变点位，L858R是EGFR基因突变21外显子的一个点位，也是EGFR-TKI最敏感的点位。

随着免疫学和生物技术的发展，肿瘤免疫治疗已成为继手术、化疗、放疗、靶向治疗之后肿瘤治疗模式的又一革新。免疫治疗是利用免疫***识别肿瘤相关抗原、调控机体攻击肿瘤细胞的能力，通过干预手段提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发或增强机体抗肿瘤免疫应答，起到协同机体免疫***杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长的作用。肿瘤细胞在基因变异的基础上产生的带有特异性氨基酸序列变异的蛋白被称为新抗原（neoantigen)，这些异常蛋白，如果在细胞内（肿瘤细胞或APCs）被降解成短肽段（抗原表位），与MHC-I类或MHC-II类分子高亲和力结合，并以复合物形式呈递到细胞表面，被T细胞表面表达的T淋巴细胞受体（TCR）识别，引起T细胞活化，进而攻击和清除肿瘤细胞。将基因突变导致的新抗原表位肽进行人工合成，构建个性化的肿瘤疫苗，回输到体内激活免疫细胞，能杀死带有所述抗原的肿瘤细胞。新抗原是肿瘤免疫治疗的理想靶标。因为新抗原只在肿瘤中进行特异性表达，所以几乎不太可能诱导耐受性，损伤正常组织细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EGFR L858R新抗原表位肽及其在***中的应用，该抗原肽具有激活T细胞靶向杀死肿瘤细胞的作用。

所述新抗原表位肽的氨基酸序列选自以下任一项：

1)含有SEQ ID No .1、SEQ ID No .2中的一条或不同的两条所示的氨基酸序列组成的肽；

2)通过对SEQ ID No .1、SEQ ID No .2的一条或不同的两条所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，

所述新抗原表位肽可单独使用，也可组合使用，或与其他表位肽组合使用。

所述新抗原表位肽能与HLA-A*1101分子形成新抗原表位肽-HLA-A*1101复合物。HLA-A*1101分子可来源自抗原呈递细胞或靶细胞（肿瘤细胞）。

新抗原表位肽-HLA-A*1101复合物能够被HLA-A*1101限制性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A*1101限制性细胞毒性T淋巴细胞。

所述新抗原表位肽可与抗原呈递细胞共孵育，诱导抗原呈递细胞成熟并在细胞表面形成新抗原表位肽-HLA-A*1101复合物。

所述新抗原表位肽、新抗原表位肽-HLA-A*1101复合物、共孵育新抗原表位肽的抗原呈递细胞均可诱导T淋巴细胞活化，形成细胞毒性T淋巴细胞，杀伤呈递新抗原表位肽的靶细胞。

所述新抗原表位肽、新抗原表位肽-HLA-A*1101复合物、共孵育表位肽的抗原呈递细胞均可应用于抗肿瘤药物领域，如作为治疗性肿瘤疫苗的活性成分。

所述治疗性肿瘤疫苗或免疫原性组合物能够引起特异性细胞毒性T细胞应答，该疫苗或免疫原性组合物包括新抗原表位肽、佐剂、载体中一种或几种，进一步，所述的新抗原表位肽可以与载体或抗原呈递细胞（如树突状细胞）结合。

所述抗肿瘤药物可以治疗含有EGFR L858R的HLA-A*1101患者。优选的所述患者为非小细胞肺癌患者。

所述新抗原表位肽可制备用于***的免疫治疗药物或方法，包括过继性细胞疗法，如嵌合抗原受体T细胞技术（CAR-T）和T细胞受体嵌合型T细胞技术（TCR-T）。

所述新抗原表位肽、新抗原表位肽-HLA-A*1101复合物可用于筛选特异性T淋巴细胞受体（TCR），特异性TCR识别所述表位肽-HLA-A*1101复合物，并介导T淋巴细胞发挥抗肿瘤细胞毒性作用。

所述抗肿瘤药物可以单独使用或联合免疫佐剂使用或与其他抗肿瘤药物或治疗方法联合使用，联合的药物可以包括化药、靶向药物、免疫检查点抑制剂；治疗方法包括化疗。使用方法可以同时或以任何顺序依次给予。

所述抗肿瘤药物可以是药物组合物，包含新抗原表位肽、任选地药学上可接受的载体、赋形剂、添加剂组合的有效量的一种或多种，进一步，所述的新抗原表位肽包括其药学上可接受的盐。

本发明的有益效果是：

HLA-A*1101分型人群占比很高，尤其在亚洲地区，研究HLA-A*1101限制性新抗原，可以针对很广泛的适用患者人群。专利所述新抗原表位肽疫苗可以为HLA-A*1101型患者提供一种新的、有希望的免疫治疗方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A流式细胞术分析新抗原肽KITDFGRAK引起的特异性CTL占比。

图1B流式细胞术分析新抗原肽VKITDFGRAK引起的特异性CTL占比。

图2A流式细胞术分析未转染HLA-A*1101的T2细胞的HLA表达率（对照）。

图2B流式细胞术分析转染HLA-A*1101的T2靶细胞的HLA表达率。

图3A ELISA检测新抗原肽KITDFGRAK特异性CTL与T2靶细胞共孵育的IFN-γ释放量。

图3B ELISA检测新抗原肽VKITDFGRAK特异性CTL与T2靶细胞共孵育的IFN-γ释放量。

图4 ELISA检测新抗原肽KITDFGRAK治疗后患者PBMC的IFN-γ释放量。

图5 ELISA检测新抗原肽VKITDFGRAK治疗后患者PBMC的IFN-γ释放量。

具体实施方式：

实施例1 分离外周血单核细胞

取HLA-A*1101健康供者静脉血20ml，将血液样本用等体积的无菌PBS稀释，将淋巴细胞分离液（Stemcell，07861）移入一个新的50ml离心管，保证与血液体积比为3：4，小心将稀释血液加入分离液的表面，操作尽可能轻柔，避免混合，可以清晰看到两种液体的分界。室温400g离心30min。离心后吸出单核细胞层，移入新的无菌离心管中，加入PBS洗涤两次。用RPMI-1640培养液重悬细胞并计数。

实施例2 新抗原表位肽激活特异性T淋巴细胞

将2.5×10⁶个细胞悬浮于90％RPMI-1640 + 10％FBS（含有IL-2，20ng/ml），加入2.5×10⁵ Dynabeads^® Human T-Activator CD3/CD28磁珠（Gibco，11131D），接种到6孔板中，每孔1.25×10⁶个细胞，两孔分别加入新抗原肽KITDFGRAK（2.5μg/ml）和新抗原肽VKITDFGRAK（2.5μg/ml），37℃，5％CO₂下孵育。24小时后，重悬细胞和磁珠，放置在磁力架上，丢弃磁珠，收集上清细胞继续培养一周，使用新抗原特异性四聚体检测被激活的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），见图1，图1A为新抗原肽KITDFGRAK特异性引起CTL表达，表达率为37.3%，图1B为新抗原肽VKITDFGRAK可引起特异性CTL表达，表达率为34.6%。

实施例3 特异性CTL对靶细胞的杀伤

1、构建HLA-A*1101的T2靶细胞：

将HLA-A*1101全长基因应用限制性内切酶EcoRI和BamHI克隆至慢病毒表达载体pCDH（购自SBI）中，得到重组质粒构建过表达HLA-A*1101分子的慢病毒表达载体pCDH-HLA*1101。

取对数生长期293T细胞（购自中国医学科学院基础医学研究所），接种到含10%FBS的DMEM培养基的T25细胞培养瓶中，细胞汇合度达到80-90%时进行转染。将重组质粒与混合包装载体质粒pPACKH1（购自SBI）混匀，充分混匀后加入500μl 1μg/μl，脂质体转染试剂Lip2000（Invitrogen，11668-027），立即混匀，室温下静置10-15分钟。将上述DNA/脂质体复合物逐滴加入培养皿中，充分混匀。将培养皿置于37℃、5% CO₂培养箱，培养6-8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。48小时后，收集培养液至无菌离心管中，4℃、2000g离心10分钟，将上清液通过0.45µm的PES材质的滤膜过滤，取一个新的无菌超速离心管，加入含有病毒的培养基上清（即过滤液），4℃、20,000g离心3小时。小心将离心管中的液体吸去，所得沉淀即为目的慢病毒。

病毒转导T2细胞系，向培养好的T2细胞中，加入polybrene（SantaCruz,sc-134220）至终浓度为6μg/ml，加入上述慢病毒，轻轻吹打充分混匀，800g室温离心1h。然后置于37℃、5% CO₂的培养箱中，继续培养24小时，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的培养器皿中，继续培养，第4天时使用HLA分子的抗体进行标记，通过流式检测细胞HLA-A*1101的表达，见图2。图2A为未转染HLA-A*1101的T2细胞，图2B为转染HLA-A*1101的T2靶细胞，可得HLA-A*1101的转染效率为96.6%。

2、特异性CTL与靶细胞的共孵育实验

靶细胞T2-HLA1101调整细胞密度至2×10⁵/ml，按照2×10⁴/孔的量接种靶细胞至96孔板，再加入100μl 1640培养基（含10%FBS），分别加入10uM新抗原肽KITDFGRAK和10uM新抗原肽VKITDFGRAK。将96孔板置于 37℃、5% CO₂培养箱中孵育4h。

离心收集实施例2获得的CTL细胞，使用1640培养基（含10%FBS）重悬，然后按照1:1、2.5:1、5:1、10:1的效靶比，将CTL细胞分别加入到96孔板中孵育新抗原肽KITDFGRAK的T2靶细胞和孵育新抗原肽VKITDFGRAK的T2靶细胞中，将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中，培养24h。培养结束后，取出96孔板，800g室温离心10min，使用Human IFN-γ ELISA Kit（购自达科为）检测共培养上清中细胞因子IFN-γ的表达。结果见图3，图3A为新抗原肽KITDFGRAK特异性CTL对T2靶细胞的杀伤作用，在效靶比10：1时，与靶细胞共孵育的CTL分泌IFN-γ量可达1926pg/ml，图3B为新抗原肽VKITDFGRAK特异性CTL对T2靶细胞的杀伤作用，在效靶比10：1时，与靶细胞共孵育的CTL分泌IFN-γ量可达1766pg/ml。

实施例4 新抗原肽KITDFGRAK治疗EGFR L858R的HLA-A*1101患者

患者A，女，46岁，非小细胞肺癌IV期，腺癌，双肺多发转移，***多发转移。紫杉醇+顺铂4周期，培美曲塞+顺铂3周期治疗后进展，吉非替尼靶向治疗后耐药，疾病进展。取肺部病灶组织活检，进行肿瘤发生发展相关基因检测及HLA分型检测，结果显示患者携带EGFRL858R突变，HLA分型为HLA-A*1101 A*3101，HLA-B*1502 B*5102，HLA-C*0702 C*0602，HLA-DRB1*0901 DRB1*1202，HLA-DQB1*0301 DQB1*0303。使用本发明的新抗原肽KITDFGRAK进行治疗，200μg新抗原肽溶于1ml PBS，上臂皮下注射，每周1次，连续12周。

治疗前、治疗后4周、8周、12周采血，分离单个核细胞（PBMC），按每孔细胞2-5×10⁵个细胞，250µl总体积，加至96孔板中。加入抗原肽KITDFGRAK（12.5µg/ml）和IL-2（500u/ml）至对应孔中，不加抗原肽的孔作为对照，在37℃、5％CO₂培养3天，取细胞培养上清液进行IFN-γ水平检测：取人干扰素-γ ELISA检测试剂盒（北京达科为生物技术有限公司）室温平衡20min，取细胞培养液上清100µl、稀释后不同浓度标准品100µl加至相应孔，空白对照加入100µl dilution buffer，再加入用dilution buffer 1:50稀释后的抗体50µl/孔、盖上封口膜室温反应2h。用洗液300µl/孔洗三遍。其中，所用标准品、dilution buffer、抗体以及洗液均为人干扰素-γ检测试剂盒中试剂。结果见图4，治疗后4周、8周、12周患者外周血特异性T细胞分泌IFN-γ能力升高，抗原肽免疫治疗激活了患者特异性免疫反应。

患者治疗期间无严重不良反应，疾病稳定，未有显著进展，患者生活质量较好，存在临床获益。

实施例5 新抗原肽VKITDFGRAK治疗EGFR L858R的HLA-A*1101患者

患者B，男，68岁，非小细胞肺癌IV期，腺癌，右肺多发，胸膜转移、***转移、骨转移。顺铂+长春瑞滨3周期，洛铂+吉西他滨2周期，吉西他滨1周期治疗后进展，吉非替尼靶向治疗后耐药，疾病进展。取肺部病灶组织活检，进行肿瘤发生发展相关基因检测及HLA分型检测，结果显示患者携带EGFR L858R突变，HLA分型为HLA-A*1101 A*2301，HLA-B*4060 B*4501，HLA-C*0702 C*0602，HLA-DRB1*0701 DRB1*1454，HLA-DQB1*0202 DQB1*0502。使用本发明的新抗原肽VKITDFGRAK进行治疗，200μg新抗原肽溶于1ml PBS，上臂皮下注射，每周1次，连续12周。

治疗前、治疗后4周、8周、12周采血，分离单个核细胞（PBMC），按每孔细胞2-5×10⁵个细胞，250µl总体积，加至96孔板中。加入抗原肽VKITDFGRAK（12.5µg/ml）和IL-2（500u/ml）至对应孔中，不加抗原肽的孔作为对照，在37℃、5％CO₂培养3天，取细胞培养上清液进行IFN-γ水平检测：取人干扰素-γ ELISA检测试剂盒（北京达科为生物技术有限公司）室温平衡20min，取细胞培养液上清100µl、稀释后不同浓度标准品100µl加至相应孔，空白对照加入100µl dilution buffer，再加入用dilution buffer 1:50稀释后的抗体50µl/孔、盖上封口膜室温反应2h。用洗液300µl/孔洗三遍。其中，所用标准品、dilution buffer、抗体以及洗液均为人干扰素-γ检测试剂盒中试剂。结果见图5，治疗后4周、8周、12周患者外周血特异性T细胞分泌IFN-γ能力升高，抗原肽免疫治疗激活了患者特异性免疫反应。

患者治疗期间无严重不良反应，治疗前后疾病稳定，未有显著进展，患者生活质量较好，存在临床获益。

以上对本发明所提供的一种EGFR L858R新抗原表位肽及其在***中的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 天津亨佳生物科技发展有限公司

<120> 一种EGFR L858R新抗原表位肽及其在***中的应用

<160> 2

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg Ala Lys

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Arg Ala Lys

1 5 10

Claims

1.一种新抗原表位肽或其组合，其特征在于，其选自以下任一项：

1) 含有SEQ ID No .1、SEQ ID No .2中的一条或不同的两条所示的氨基酸序列组成的肽；

2) 通过对SEQ ID No .1、SEQ ID No .2的一条或不同的两条所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述新抗原表位肽能与HLA-A*1101分子形成复合物而被HLA-A*1101限制性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A*1101限制性细胞毒性T淋巴细胞。

2.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1中所述的新抗原表位肽的氨基酸序列。

3.一种主要组织相容性抗原复合物，其特征在于，包括HLA-A*1101分子和如权利要求1所述的新抗原表位肽。

4.一种抗原呈递细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞可以识别及递呈如权利要求1所述的新抗原表位肽。

5.一种T淋巴细胞诱导剂，其特征在于，所述T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：

1) 如权利要求1所述的新抗原表位肽；

2) 如权利要求3所述的主要组织相容性抗原复合物；

3) 如权利要求4所述的抗原呈递细胞；

中的一种或几种。

6.一种肿瘤疫苗，其特征在于，所述肿瘤疫苗为治疗性疫苗，活性成分包括：

1) 如权利要求1所述的新抗原表位肽；

2) 如权利要求3所述的主要组织相容性抗原复合物；

3) 如权利要求4所述的抗原呈递细胞；

中的一种或几种，所述肿瘤疫苗，针对的肿瘤为带有EGFR L858R基因突变且HLA分型为HLA-A*1101的肿瘤。

7. 如权利要求1所述的新抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用，其特征在于，癌症为带有EGFR L858R基因突变且HLA分型为HLA-A*1101的肿瘤。

8.如权利要求1所述的新抗原表位肽在制备用于治疗癌症的免疫药物或方法中的应用，其特征在于，所述治疗癌症的免疫药物或方法包括过继性细胞疗法，如嵌合抗原受体T细胞技术（CAR-T）和T细胞受体嵌合型T细胞技术（TCR-T）。

9.如权利要求3所述的主要组织相容性抗原复合物，在筛选和制备T淋巴细胞受体中的应用，其特征在于，所述的T淋巴细胞受体可特异性识别如权利要求3所述的主要组织相容性抗原复合物，并介导T淋巴细胞发挥抗肿瘤细胞毒性作用。