CN111763715A - 脂蛋白a亚型kiv-2结构域的拷贝数量检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种从基因水平检测Apo A分子KIV‑2亚型结构域的重复数检测的试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒采用基因合成的方法合成KIV‑2已知重复数的标准品，解决了无阳性样本或者样本样本量有限的确定；采用SYBR Green qPCR检测方法，能够高灵敏和特异性的检测总量≥1ng的基因组DNA，在1‑2内天快速得到结果。

Description

脂蛋白A亚型KIV-2结构域的拷贝数量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种从基因水平检测Apo A分子KIV-2亚型结构域的重复数检测的试剂盒及其检测方法。
背景技术
脂蛋白a(Lp(a))一种特殊的脂蛋白颗粒，血清Lp(a)浓度主要由基因控制，可作为动脉硬化性心脑血管疾病的独立危险因素指标。其结构在蛋白质方面与LDL很相似，但带有一个富含糖类和高度亲水性的载脂蛋白Apo(a)蛋白。Apo(a)蛋白中kringle4-2型结构域重复序列的数量由基因决定，每个Apo(a)粒子的KIV-2型重复数型重复数从3到40不等，因此Apo(a)的大小不仅在个体间且在同一个体都是高度可变的。
研究kringle4-2型重复数、Lp(a)浓度与疾病相关性。现有方法主要通过实时荧光定量PCR检测，检测已知KIV-2型重复数样本与待测样本KIV-2型重复数，计算出待测样本KIV-2型重复数。此方法需要有已知KIV-2型重复数的情况下才能检测，所以没有阳性样本则无法开展相关实验，并且阳性样本量无法实现量产。
因此，提供一种从基因水平检测Apo A分子KIV-2亚型结构域的重复数检测的试剂盒及其检测方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测KIV-2结构域的重复数量的诊断试剂盒及其制备方法、检测方法。通过基因合成标准品，解决了标准品差异较大，提高了检测方法的准确度等；通过qPCR及设计特异性引物提高了检测的灵敏度及特异性问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物组合，其特征在于，包括组合一和组合二：
组合一：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合二：
(5)、上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和
(6)、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
(7)、如(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个。
本发明还提供了所述的引物组合在制备检测KIV-2结构域的重复数量的试剂和/或试剂盒中的应用。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的引物组合在制备检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂和/或试剂盒中的应用。
本发明还提供了检测KIV-2结构域的重复数量或检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂，包括所述的引物组合。
在上述研究的基础上，本发明还提供了检测KIV-2结构域的重复数量或检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂盒，包括所述的引物组合以及常用的助剂或载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品的序列具有：
(1)具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在上述研究的基础上，本发明还提供了KIV-2结构域的重复数量的检测方法，取待测样本与所述的引物组合、所述的试剂或所述的试剂盒中的引物组合混合后扩增，检测。
在上述研究的基础上，本发明还提供了动脉硬化性心脑血管疾病的检测方法，取待测样本与所述的引物组合、所述的试剂或所述的试剂盒中的引物组合混合后扩增，检测。
本发明的试剂盒采用基因合成的方法合成KIV-2已知重复数的标准品，解决了无阳性样本或者样本样本量有限的确定；采用SYBR Green qPCR检测方法，能够高灵敏和特异性的检测总量≥1ng的基因组DNA，在1-2内天快速得到结果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示专利中KIV和ALB引物溶解曲线结果图示，采用SYBR Green qPCR检测方法，验证引物的特异性及重复性；
图2示专利中KIV和ALB引物溶解曲线结果图示，采用SYBR Green qPCR检测方法，验证引物的特异性及两对引物Ct值的差异。
具体实施方式
本发明公开了一种检测KIV-2结构域的重复数量的诊断试剂盒及其检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的检测KIV-2结构域的重复数量的诊断试剂盒及其检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、标准品的合成：
在上海百力格生物订购，合成下列序列，作为标准品原液DNA序列(如SEQ ID No.5所示)。
GGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTAAGTAGATAAGAAATTATTCTTTTATAGCTTTGGCATGACCTCACAACTTAGGAGGATAGCCTAGGCTTTTCTGTGGAGTTGCTAAAGTTGAGTTCGGAGAACTCAGCTTGAAGCATGTCTCTTGTCACAGAAACTTCAGTTGGCCCTTTATTCTCTTATGGTAAAGAACAAAGACATACGCATTTGGGTAGTATTCTGGGGTCCGACTATGCGAGTGTGGTGTCATAGATGACCAAGCTTGGCAGGTTCTTCCAGTGACAGTGGTGGAGTATGTGCCTCGATAACTCTGTCCATTACCGTGGTAGCACTCCTGCACCCCAGGCCTCTGCTCAGTCGGTGCTGAAATGAAAACACAAGAAATAAACTGAGTATCTCTGAG
2、合成KIV-2重复数检测引物及ALB检测引物：
在引物设计阶段两个主要创新指标参数：
1)参数一：保证内参引物(ALB)和检测引物(KIV)在1ng DNA模板起始量Ct＞30，所以引物设计筛选方法如下：长度选取的范围为90-110nt，Tm值60-62℃；引物长度20-25nt范围内；自由能(G)＜160Kcal/mol。
2)参数二：KIV-2扩增产物的自由能小于ALB扩增产物的自由能。使KIV-2检测引物扩增效率较ALB内参引物扩增效率高，内参引物ALB的Ct值总小于检测引物KIV-2。
根据以上两点优化的设计参数，设计了下表两对引物，验证得到结果：2.0≥Ct(KIV-2)-Ct(ALB)≥1.0，Ct(ALB)＞30，Ct(KIV-2)＞28。所以在引物设计阶段保证了检测的灵敏度和可靠性。
表1
KIV-2-F 如SEQ ID No.1所示 GAGGCACATACTCCACCACTGT
KIV-2-R 如SEQ ID No.2所示 TTGGGTAGTATTCTGGGGTCC
ALB-F 如SEQ ID No.3所示 TGCCGAAGTGGAAAATGATG
ALB-R 如SEQ ID No.4所示 CATCCTTTGCCTCAGCATAGTTT
3、KIV-2引物SYBR Green PCR反应体系配制：
每个待测样本KIV-2引物做6个重复，并且每批次实验需要做标准品，且标准品也需要做6个重复。
表2
试剂名称 体积(μl)
2X SYBR Green PCR Master Mix 5.0
KIV-2-F/KIV-2-R(4uM) 1.0
ddH<sub>2</sub>O 2.0
DNA(5ng) 2.0
Total 10.0
4、ALB引物SYBR GreenPCR反应体系配制：
每个待测样本ALB引物做6个重复，并且每批次实验需要做标准品，且标准品也需要做6个重复。
表3
试剂名称 体积(μl)
2X SYBR Green PCR Master Mix 5.0
ALB-F/ALB-R(4uM) 1.0
ddH<sub>2</sub>O 2.0
DNA(5ng) 2.0
Total 10.0
5、加样&上机
将反应体系加入384孔反应板内，放入离心机，瞬时离心。
将反应板放入Roche 480qPCR分析仪中，PCR扩增及检测样本Ct值。
表4
Figure BDA0002636593830000061
6、结果分析：
ΔCt待测＝Ct待测KIV-2-Ct待测ALB
ΔCt标准品＝Ct标准品KIV-2-Ct标准品ALB
Figure BDA0002636593830000062
计算得出
Figure BDA0002636593830000063
即为待测样本的KIV-2重复数。
实施例2灵敏度验证
按照实验流程，分别使用内参基因ALB及待检KIV基因引物检测1ng基因组DNA(三个不同样本)，每个样本检测6个重复；测得1ng gDNA内参基因ALB及待检KIV基因的Ct值统计结果如下表：
表5
KIV基因 ALB基因
统计数 15 15
Ct最大值 23.04 29.82
Ct平均值 22.94 29.55
1ng基因组DNA的Ct值＞30，说明检测的灵敏度较高。
实施例3引物特异性验证溶解曲线：
标准品及基因组DNA，KIV-2与ALB引物溶解曲线(如图1、图2所示)：
qPCR溶解曲线结果：KIV及ALB基因扩增引物的单一且重复性好，证明两对引物都具有高度的特异性。
实施例4标准品稳定性评估数
取不同批次的两个标准品(标准品1和标准品2)，通过检测内参基因ALB及待测基因KIV的Ct值，计算其最大值、最小值、均值、极差。ΔCt的极差值只有0.021，说明不同批次间的标准品准确度和可重复性较好。
表6
Figure BDA0002636593830000071
表7
Ct(KIV) Ct(ALB) ΔCt
最大值 27.980 29.870 -1.525
最小值 27.340 28.940 -1.568
均值 27.715 29.261 -1.546
极差 0.208 0.287 0.021
实施例5实验例
对A、B、C(取样量1ng)三个待测样本KIV-2重复数检测为例，根据实验步骤得出以下检测结果并分析得出KIV区域的重复数量：
表8
Figure BDA0002636593830000081
Figure BDA0002636593830000082
即为待测样本的KIV-2重复数。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海韦翰斯生物医药科技有限公司
<120> 脂蛋白A亚型KIV-2结构域的拷贝数量检测试剂盒
<130> MP2012206
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggcacata ctccaccact gt 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgggtagta ttctggggtc c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgccgaagtg gaaaatgatg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catcctttgc ctcagcatag ttt 23
<210> 5
<211> 598
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcggacctt gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga 60
atgctgtgaa aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga 120
gatgcctgct gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa 180
aaactatgct gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgtaa gtagataaga aattattctt 240
ttatagcttt ggcatgacct cacaacttag gaggatagcc taggcttttc tgtggagttg 300
ctaaagttga gttcggagaa ctcagcttga agcatgtctc ttgtcacaga aacttcagtt 360
ggccctttat tctcttatgg taaagaacaa agacatacgc atttgggtag tattctgggg 420
tccgactatg cgagtgtggt gtcatagatg accaagcttg gcaggttctt ccagtgacag 480
tggtggagta tgtgcctcga taactctgtc cattaccgtg gtagcactcc tgcaccccag 540
gcctctgctc agtcggtgct gaaatgaaaa cacaagaaat aaactgagta tctctgag 598

Claims (8)

1.引物组合，其特征在于，包括组合一和组合二：
组合一：
(1)、上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
(2)、下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(3)、如(1)或(2)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)或(2)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(4)、与(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列；
组合二：
(5)、上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和
(6)、下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
(7)、如(5)或(6)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(5)或(6)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(8)、与(5)或(6)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述取代、缺失或添加一个或多个中的多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个。
3.如权利要求1或2所述的引物组合在制备检测KIV-2结构域的重复数量的试剂和/或试剂盒中的应用。
4.如权利要求1或2所述的引物组合在制备检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂和/或试剂盒中的应用。
5.检测KIV-2结构域的重复数量或检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合。
6.检测KIV-2结构域的重复数量或检测动脉硬化性心脑血管疾病的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的引物组合以及常用的助剂或载体。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准品，所述标准品的序列具有：
(1)具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；或
(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(3)、与(1)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
8.KIV-2结构域的重复数量的检测方法，其特征在于，取待测样本与如权利要求1或2所述的引物组合、如权利要求5所述的试剂或如权利要求6至7任一项所述的试剂盒中的引物组合混合后扩增，检测。
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