CN111763257B - 抗gitr抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗GITR抗体或其抗原结合片段，以及制备方法和用途。该抗GITR抗体或其抗原结合片段可以有效阻断GITR与配体的结合，且与人GITR结合的特异性强，亲和力高，体内实验也表明被非人动物良好耐受，并且无毒，显著抑制肿瘤的增长。

Description

抗GITR抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗GITR抗体技术领域，具体涉及抗GITR抗体或其抗原结合片段，以及制备方法和用途。
背景技术
癌症是目前人类死亡率最高的疾病之一。根据世界卫生组织的统计数据，2012年全球癌症发病和死亡病例数分别达到1400万和820万。在中国，新诊断的癌症病例为307万，死亡人数为220万。
抗癌抗体的最新临床和商业成功已引起对基于抗体的治疗剂的极大兴趣。需要开发抗癌抗体以用于各种基于抗体的疗法中治疗癌症。
GITR（糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体蛋白）分子是一种I型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员，包括胞外区、跨膜区域和胞浆区，在Treg细胞的高水平表达，也在CD4+和CD8+T细胞上低水平表达，经刺激活化后表达显著增加。GITR的配体GITRL，为肿瘤坏死因子（TNF）超家族成员，主要表达在抗原呈递细胞（APC）。GITR与GITRL结合后，传导T细胞表面的共刺激信号，和CD28、CD3一起辅助T细胞受体（TCR）的作用，刺激T细胞活化、增殖和分泌细胞因子（但其辅助刺激作用没有CD28强烈）；抑制Foxp3+ Tregs免疫抑制活性；诱导激活巨噬细胞。已有研究证明GITR在多种免疫过程中起重要作用，在感染、肿瘤和自身免疫/炎性疾病治疗领域具有巨大应用价值。
因此，本领域急需获得更多的抑制GITR与其配体结合的技术，故本发明提供了一种新的抗GITR抗体或其抗原结合片段，将其用于感染、肿瘤、自身免疫疾病或炎性疾病的治疗。
发明内容
本发明提供了一种特异性结合GITR的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段可以有效抑制GITR与其配体的结合，且与人GITR结合的特异性强，亲和力高，体内实验也表明被非人动物良好耐受，并且无毒，显著抑制肿瘤的增长。具体如下：
本发明的第一方面，提供了一种抗GITR抗体或其抗原结合片段，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：1或7所示，VHCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：2或8所示，VHCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列包含SEQ ID NO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列包含SEQ ID NO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列包含SEQ ID NO：6所示。
Figure 236675DEST_PATH_IMAGE001
进一步优选的，所述的重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:13或与SEQ IDNO:13具有80%以上同源性且保留与GITR结合的能力。
进一步优选的，所述的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:14或与SEQ IDNO:14具有80%以上同源性且保留与GITR结合的能力。
优选的，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或多克隆抗体。
优选的，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段可以是单链抗体（scFv）、Fv抗体、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性单链抗体、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体，以及任何包含抗体结合域或同源的抗体结合域的多肽。其中，抗体结合域可以包括完整的重链和/或轻链CDR、完整的抗体的重链和/或轻链可变区、完整的全长重链和/或轻链、或者来自所述抗体的单个、两个、三个、四个、五个或六个CDR。单链抗体包含一个重链可变区和一个轻链可变区。
优选的，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段中还包含来自人IgG1抗体的恒定结构域。进一步优选包含CL、CH1、CH2和/或CH3结构域。
优选的，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段特异性结合人、嵌合或非人动物GITR。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段特异性结合人GITR（例如SEQ ID NO:12）、猴GITR（例如SEQ ID NO:10）或嵌合GITR（例如SEQ ID NO:11）。
本发明的第二方面，提供了一种编码上述抗GITR抗体或其抗原结合片段的核酸。
本发明的第三方面，提供了一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
（1）包含重链可变区的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区包含SEQ IDNO:1、2和3的VHCDR1、2和3，并且其中所述重链可变区在与包含SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列的轻链可变区配对时结合GITR；和/或，
（2）包含轻链可变区的免疫球蛋白轻链或其片段，所述轻链可变区包含SEQ IDNO:4、5和6的VLCDR1、2和3，并且其中所述轻链可变区在与包含SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的重链可变区配对时结合GITR。
本发明的第四方面，提供了一种包含本发明所述的核酸的载体。
优选的，所述的载体能够在体内或体外或离体条件下表达。进一步优选的，所述的表达载体在体内细胞中持续高水平表达。优选的，所述的表达载体为原核表达载体或慢病毒表达载体。进一步优选的，所述的原核表达载体为大肠杆菌系列。
本发明的第五方面，提供了一种包含上述核酸或载体的细胞。
优选的，所述的细胞可以是真核的或者原核的。更优选的，所述的细胞可以为酵母细胞、293细胞、CHO细胞、大肠杆菌等。
本发明的第六方面，提供了一种产生上述的抗GITR抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞。
本发明的第七方面，提供了一种杂交瘤细胞的制备方法，所述的方法包括用人GITR免疫非人动物获得，收集人GITR免疫后非人动物的脾细胞，将收集的脾细胞与SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。
本发明的第八方面，提供了一种抗GITR抗体或其抗原结合片段的制备方法，培养包含上述的核酸的细胞，获得抗GITR抗体或其抗原结合片段。
本发明的第九方面，提供了一种制备抗GITR抗体或其抗原结合片段的方法，所述的方法包括蛋白免疫法或者DNA免疫法。
优选的，所述的方法包括用人GITR免疫非人动物获得。
优选还包含收集人GITR免疫后非人动物的脾细胞。
优选还包含将收集的脾细胞与SP2/0细胞融合获得杂交瘤细胞。
优选将杂交瘤细胞导入非人动物，以及收集非人动物腹水的步骤。
优选的，所述的人GITR可以为人GITR蛋白（优选为SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列）或编码人GITR蛋白的核苷酸序列（优选为cDNA序列，进一步优选为编码SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的核苷酸序列）。
优选的，所述的人GITR蛋白经His标记。
优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选为啮齿类动物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为大鼠或小鼠。
本发明的第十方面，提供了一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的所述的抗体或其抗原结合片段。
优选的，所述的治疗剂可以为化学合成药、抗生素或者各种生物药。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或所述的抗体-药物缀合物，以及药用载体。
优选的，所述药用载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂或崩解剂等等。
更优选的，所述药物组合物可包含在纳米载体、病毒载体、微胶囊、脂质体等中给予。
本发明的第十二方面，提供了一种组合物、检测试剂盒、芯片或抗体偶联物，其包含如下任一组：
1）本发明所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段；
2）本发明所述的核酸；
3）本发明所述的载体；
4）本发明所述的细胞；
5）本发明所述的杂交瘤细胞；或者，
6）本发明所述的T细胞抗原受体或CAR分子。
优选的，还包含其他辅助或与上述1）-5）任一产品协同的试剂。
优选的，所述试剂可以是药用载体，所述药用载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂、粘合剂、致湿剂、表面活性剂、润滑剂、崩解剂等等。
更优选的，所述组合物可包含在纳米载体、病毒载体、微胶囊、脂质体等中给予。
本发明的第十三方面，提供了上述的抗GITR抗体或其抗原结合片段、上述核酸、上述载体、上述细胞、上述的组合物、检测试剂盒、芯片或抗体偶联物的用途，所述的用途包括：
A）在制备治疗GITR/GITRL相关的疾病的产品中的用途；或，
B）在GITR检测中的用途。
优选的，所述的GITR/GITRL相关的疾病为感染、肿瘤、自身免疫疾病或炎性疾病。
本发明的第十四方面，提供了一种T细胞抗原受体或CAR分子，所述的T细胞抗原受体或CAR分子包含上述抗GITR抗体或其抗原结合片段。
本发明的第十五方面，提供了一种***或者杀伤肿瘤细胞的方法，所述的方法包括向个体施加有效量的本发明所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段、上述的组合物、检测试剂盒、芯片或抗体偶联物。
优选的，所述方法包括将上述组合物联合其他药物或者治疗方法进行疾病治疗。
更优选的，本发明提供了一种联合治疗受试者中的恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的上述药物组合物，还包括向所述受试者施用治疗有效量的其它治疗恶性肿瘤的药剂或施用其它治疗恶性肿瘤的方法，例如化疗药物、手术治疗、放射治疗、生物治疗、中医中药治疗、微创治疗等等。
本发明的第十六方面，提供了一种诱导免疫应答的方法，所述的方法包括向个体施加本发明所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段、上述的组合物、检测试剂盒、芯片或抗体偶联物。
本发明的第十七方面，提供了一种GITR的检测方法，所述的检测方法包括将待检测样品与本发明所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段接触，然后检测GITR与抗GITR抗体或其抗原结合片段形成的复合物。
优选的，所述的检测方法为检测GITR的存在或含量。其中，所述的存在表示有无，所述的含量可以为表达量或蛋白浓度等。
本发明的第十八方面，提供了一种诊断GITR/GITRL相关的疾病的方法，所述的方法包括取样，将样品与本发明所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段接触，然后检测GITR与抗GITR抗体或其抗原结合片段形成的复合物。
本发明的第十九方面，提供了一种降低肿瘤生长速率或杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：使肿瘤细胞与有效量的产品接触，所述产品包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段，或者抗体-药物缀合物，或者药物组合物。
本发明的第二十方面，提供了一种本发明所述抗GITR抗体或其抗原结合片段在制备***的药物中的应用。
本发明所述的“抗原结合片段”是保留完整抗体的特定结合活性的抗体的一部分，即抗体的任何部分能够与完整抗体的靶分子上的表位特异结合。它包括例如Fab，Fab'，F（ab'）2和这些片段的变体。例如，完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链，或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。
本发明所述的“施加”包括但不限于口服、肠给药、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、动脉内注射、静脉注射、鼻腔给药、透皮给药、结膜下给药、腹腔内注射、眼球内给药、眼眶给药、眼球后给药、视网膜给药、脉络膜给药、鞘内注射等。
本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官或个体之后提供所希望的治疗的本发明所述的产品（优选抗GITR抗体或其抗原结合片段）的量或剂量。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展，或者是评估患者对治疗的反应。
本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述的“和/或”包括择一列出的项目以及任何数量的项目组合。
本发明所述的“包括”或“包含”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响技术效果的其他指定成分或步骤。其在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述的“个体”可以为人或非人动物。其中，所述的非人动物可以为非人哺乳动物，例如猴子、小鼠、兔子等等。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科（例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
本发明所述的“炎性疾病”选自急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症（浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎）、增生性炎症、特异性炎症（结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等）。
本发明所述的“感染”包括但不限于鼠疫、霍乱、艾滋病、非典型肺炎、甲流、肺结核、禽流感、病毒性肝炎、狂犬病、脊髓灰质炎、麻疹、流行性脑脊髓膜炎、流行性乙型脑炎、流行性出血热、钩端螺旋体病、伤寒以及血吸虫病等。
本发明所述的“自身免疫疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“肿瘤”选自白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌（例如非小细胞肺癌等）、支气管癌、骨癌、***癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自下组，该组由以下各项组成：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
除非在本公开内容中特别指出，否则在本公开内容中默认使用Kabat编号。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1是显示制备抗hGITR抗体的流程图，具体为免疫接种至血清收集的步骤，以及对收集的血清进行抗体效价的检测。
图2是显示制备抗hGITR抗体的流程图，具体为加强免疫接种、收集脾细胞、制备杂交瘤细胞，并筛选杂交瘤细胞，以及采用杂交瘤细胞生产抗体和纯化抗体的步骤。
图3是一组流式细胞术图，显示了抗hGITR抗体（2D3-mHvKv-IgG1）与hGITR之间的结合，其中，INCAGN01876为阳性对照，NC为阴性对照。
图4是一组显示分析抗hGITR抗体（2D3-mHvKv-IgG1）与猴GITR（rmGITR）、小鼠GITR（mGITR）和人-小鼠嵌合GITR（chiGITR）的交叉反应性的流式细胞术结果的图，其中，NC代表阴性对照，INCAGN01876为阳性对照。
图5是显示用抗hGITR抗体（2D3-mHvKv-IgG1）和人源化抗hGITR抗体INCAGN01876处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化GITR小鼠（B-hGITR）随时间的体重的图。
图6是显示用抗hGITR抗体（2D3-mHvKv-IgG1）和人源化抗hGITR抗体INCAGN01876处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化GITR小鼠（B-hGITR）随时间的体重百分比变化的图。
图7是显示用抗hGITR抗体（2D3-mHvKv-IgG1）和人源化抗hGITR抗体INCAGN01876处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化GITR小鼠（B-hGITR）随时间的肿瘤体积的图。
具体实施方式
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例1：产生小鼠抗hGITR抗体
为了产生针对人GITR（hGITR；SEQ ID NO:12）的小鼠抗体，用人GITR免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。通过如下所述和如图1和图2所示的方法收集抗hGITR抗体。
小鼠的免疫接种
以100μg/mL的浓度以20μg/小鼠用经His标记的人GITR蛋白免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。将经His标记的人GITR蛋白用佐剂乳化，并注射在小鼠背部的四个位置。对于第一次皮下（s.c.）注射，将稀释的抗原用等体积的完全弗氏佐剂（CFA）乳化。在随后的皮下注射中，将蛋白质用等体积的不完全弗氏佐剂（IFA）乳化。在第三次注射或加强免疫接种之后三天，收集血液（血清）并使用ELISA分析抗体效价。
在另一个实验中，通过将编码人GITR的表达质粒注射到小鼠中来免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。通过使用基因枪以1000μg/μL的浓度以每只小鼠60μg将编码抗原的质粒注射到小鼠的胫骨前肌中（肌内注射；i.m.注射）。进行至少四次注射，每两次注射之间间隔至少14天。在最后一次免疫接种之后7天收集血液（血清），并通过ELISA测试血清的抗体效价。
在前一次免疫接种之后至少十四天还进行了增强免疫接种的程序（通过注射质粒或通过注射蛋白质）。将在表面表达GITR抗原的CHO细胞通过尾静脉注射到小鼠体内。然后在注射之后四天收集脾。
SP2/0细胞与脾细胞的融合
研磨脾组织。首先通过CD3ε微珠和抗小鼠IgM微珠选择脾细胞，然后使其与SP2/0细胞融合。然后将细胞平板接种在具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）培养基的96孔板中。
杂交瘤的初步筛选
根据标准程序，使用荧光激活细胞分选（Fluorescence-Activated CellSorting，FACS）对96孔板中的杂交瘤上清液进行初步筛选。在筛选之前，将中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞添加到96孔板中（每孔2×104个细胞）。使用50μL上清液。实验中使用的抗体是：
（1）荧光素（FITC）缀合的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性的；和
（2）Alexa Fluor® 647缀合的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性的。
亚克隆
使用ClonePix2进行亚克隆。简单地说，将在初步筛选中鉴定出的阳性孔转移到半固体培养基中，并鉴定和测试IgG阳性克隆。使用FITC抗小鼠IgG Fc抗体。
腹水抗体
将1×106个阳性杂交瘤细胞腹腔内注射至B-NDG®小鼠（北京百奥赛图，中国北京）。通过使杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长来产生单克隆抗体。杂交瘤细胞在小鼠腹部扩增并且产生腹水。腹水含有高浓度的抗体，可将其收获以备后用。
抗体纯化
使用GE AKTA蛋白色谱（GE Healthcare, Chicago, Illinois, United States）纯化腹水中的抗体，得到61-2D3（“2D3”）小鼠抗体。
确定了所述抗体的VH、VL和CDR区。2D3的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQ ID NO:1-6（Kabat编号）或SEQ ID NO:7、8、3、4、5、6（Chothia编号）中。重链可变区的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:13中，轻链可变区的氨基酸序列示出在SEQ ID NO:14中。
实施例2：小鼠抗hGITR抗体的体外测试：与人GITR（hGITR）的结合
进行体外测定以确定抗hGITR抗体是否可与hGITR之间结合。
从小鼠腹水中收集抗hGITR抗体，并通过色谱纯化。将25μL用人GITR瞬时转染的CHO细胞加入板中的每个孔中。将纯化的抗体滴定至终浓度为10、1、0.1、0.01、0.001μg/mL。将滴定的抗体在4℃以每孔25μL添加到每个孔中，并孵育30分钟。
2D3是实施例1中所述的小鼠抗hGITR抗体。基于2D3，产生了2D3-mHvKv-IgG1嵌合抗hGITR抗体。该嵌合抗体具有来自相应的小鼠抗hGITR抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域，以及来自人IgG1抗体的恒定结构域（包括，例如CL、CH1、CH2和CH3结构域）。
在用磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤两次之后，将50μL的FITC标记的抗人IgG Fc抗体（Fluorescein (FITC)-AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, FcγFragment Specific,来源Jackson，货号109-096-170））以1:500的稀释度添加到每个孔中，在4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术确定FITC的信号。
如图3所示，当嵌合抗hGITR抗体2D3-mHvKv-IgG1和人源化抗hGITR抗体INCAGN01876抗体（作为阳性对照药物）的浓度提高时，FITC的信号升高，表明抗hGITR抗体2D3-mHvKv-IgG1可与人GITR之间结合，而且，其与人GITR之间的结合能力明显强于阳性对照组。
实施例3：抗hGITR抗体针对猴、小鼠和人-小鼠嵌合GITR的交叉反应性
在每一个实验中，用小鼠GITR（mGITR，SEQ ID NO:9）、猴（恒河猴）GITR(rmGITR，SEQ ID NO:10）或嵌合（小鼠和人）GITR（chiGITR，SEQ ID NO:11）编码序列转染CHO细胞。
将25μL CHO细胞添加至每个孔。将25μL纯化的抗hGITR抗体（10μg/mL）添加至每个孔，并在4℃孵育30分钟。
在用PBS（1200rmp，5分钟）洗涤两次之后，将50μL FITC标记的抗人IgG Fc抗体以1:500的稀释度添加到每个孔中，并在4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤（1200rmp，5分钟）。通过流式细胞术确定FITC的信号。
如图4所示，嵌合抗hGITR抗体2D3-mHvKv-IgG1和人源化抗hGITR抗体INCAGN01876与小鼠GITR均没有交叉反应，但是与rmGITR和chiGITR具有强交叉反应性。
实施例4：抗hGITR抗体的结合亲和力
抗hGITR抗体的结合亲和力通过表面等离子体共振（SPR）用装备有预先固定的蛋白A传感器芯片的Biacore（Biacore,INC, Piscataway N.J.）T200生物传感器测量。
将抗hGITR抗体2D3-mHvKv-IgG1或INCAGN01876（1μg/mL）以10μL/分钟进样到Biacore T200生物传感器中持续30秒，以达到期望的蛋白质密度（约67个响应单位（RU））。然后将浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625nM的组氨酸标记的人GITR蛋白(来源ACRO，货号GIR-H5228）以30μL/分钟进样100秒。监测解离400秒。在每种滴定度的最后进样之后用甘氨酸（pH 2.0，30μL/分钟持续12秒）将芯片再生。通过使用Biacore T200评价软件3.0将数据全局拟合于1:1 Langmuir结合模型来同时获得动力学缔合速率（kon）和解离速率（koff）（Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., 1994. MethodsEnzymology 6. 99-110）。由动力学速率常数的商（KD=koff/kon）推导亲和力。
下面表1为2D3-mHvKv-IgG1和INCAGN01876抗体的结果。
表1
Figure 216133DEST_PATH_IMAGE002
实施例5：抗GITR抗体的体内测试
为了在体内测试抗hGITR抗体并预测这些抗体在人体中的作用，产生了人源化GITR小鼠模型。人源化GITR小鼠模型被改造以表达嵌合GITR蛋白（SEQ ID NO:11），其中小鼠GITR蛋白的细胞外区域的一部分被相应的人GITR细胞外区域替代。小鼠GITR（SEQ IDNO:9）的第1-130位氨基酸残基被人GITR（SEQ ID NO:12）的第1-142位氨基酸残基替代。人源化小鼠模型（B-hGITR）通过显著降低人与表达小鼠GITR的普通小鼠中临床结局之间的差异来为在临床环境中测试新的治疗性治疗提供新的工具。关于人源化GITR小鼠模型的详细描述可以在PCT/CN2018/091844中找到，其通过引用整体并入本文。
在结肠癌模型中测试了抗hGITR抗体对体内肿瘤生长的作用。在B-hGITR小鼠中皮下注射鼠MC-38细胞（结肠腺癌细胞）。当小鼠中的肿瘤达到100±50mm3的体积时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分到不同的组（每组5只小鼠）。然后通过腹腔给药分别向小鼠注射生理盐水（PS）和抗hGITR抗体。在每周的第2天和第5天给予抗体，即每周给药两次，持续3周（共注射6次）。
根据小鼠的体重以3mg/kg计算注射体积。测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并且按0.5×(长轴)×(短轴)2计算了肿瘤的体积。还在注射之前在将小鼠分到不同组时（第一次抗体注射之前）、在抗体注射期期间每周两次、以及在实施安乐死之前测量小鼠的体重。
使用下式计算肿瘤生长抑制百分比（TGI%）：
Figure 667974DEST_PATH_IMAGE003
。Ti是处 理组在第i天的平均肿瘤体积。T0是处理组在第0天的平均肿瘤体积。Vi是对照组在第i天的 平均肿瘤体积。V0是对照组在第0天的平均肿瘤体积。
进行t检验以进行统计学分析。TGI%高于60%表明肿瘤生长的显著抑制。p<0.05是指示显著差异的阈值。
在三组（G1，G2，G3）的每组中，分别向B-hGITR小鼠注射生理盐水（PS）作为对照（G1），嵌合抗hGITR抗体2D3-mHvKv-IgG1（G2）或人源化抗hGITR抗体INCAGN01876（G3）。在整个处理期期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的体重全部增加（图5和图6）。在三组之间未观察到体重的显著差异。结果表明，2D3-mHvKv-IgG1和INCAGN01876被良好耐受，并且对小鼠无毒。
与对照组相比，用INCAGN01876和2D3-mHvKv-IgG1处理组中的肿瘤体积增加的程度较小（图7）。特别地，G2中的肿瘤体积小于G3。
如下表所示，还计算了在第24天（分组之后24天）的TGI%。
表2
Figure 371838DEST_PATH_IMAGE004
结果表明，嵌合抗体2D3-mHvKv-IgG1和人源化抗体INCAGN01876都可抑制肿瘤的生长。其中，2D3-mHvKv-IgG1的TGI%比人源化抗体INCAGN01876高。
本领域技术人员应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在举例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改方案在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 抗GITR抗体及其用途
<130> 1
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Tyr Gly Ile Asp
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Ile Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Ala Thr Gly Pro Ser Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Ile Asp
1 5 10
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asn Ile Gly Asn Asn Tyr
1 5
<210> 9
<211> 228
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus. musculus)
<400> 9
Met Gly Ala Trp Ala Met Leu Tyr Gly Val Ser Met Leu Cys Val Leu
1 5 10 15
Asp Leu Gly Gln Pro Ser Val Val Glu Glu Pro Gly Cys Gly Pro Gly
20 25 30
Lys Val Gln Asn Gly Ser Gly Asn Asn Thr Arg Cys Cys Ser Leu Tyr
35 40 45
Ala Pro Gly Lys Glu Asp Cys Pro Lys Glu Arg Cys Ile Cys Val Thr
50 55 60
Pro Glu Tyr His Cys Gly Asp Pro Gln Cys Lys Ile Cys Lys His Tyr
65 70 75 80
Pro Cys Gln Pro Gly Gln Arg Val Glu Ser Gln Gly Asp Ile Val Phe
85 90 95
Gly Phe Arg Cys Val Ala Cys Ala Met Gly Thr Phe Ser Ala Gly Arg
100 105 110
Asp Gly His Cys Arg Leu Trp Thr Asn Cys Ser Gln Phe Gly Phe Leu
115 120 125
Thr Met Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Ile Pro Glu
130 135 140
Pro Leu Pro Thr Glu Gln Tyr Gly His Leu Thr Val Ile Phe Leu Val
145 150 155 160
Met Ala Ala Cys Ile Phe Phe Leu Thr Thr Val Gln Leu Gly Leu His
165 170 175
Ile Trp Gln Leu Arg Arg Gln His Met Cys Pro Arg Glu Thr Gln Pro
180 185 190
Phe Ala Glu Val Gln Leu Ser Ala Glu Asp Ala Cys Ser Phe Gln Phe
195 200 205
Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Gln Thr Glu Glu Lys Cys His Leu Gly
210 215 220
Gly Arg Trp Pro
225
<210> 10
<211> 235
<212> PRT
<213> 恒河猴(Macaca mulatta)
<400> 10
Met Cys Ala Ser Gly Thr Leu Cys Cys Leu Ala Leu Leu Cys Ala Ala
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro Gly Cys Gly Pro Gly Arg
20 25 30
Leu Leu Leu Gly Thr Gly Lys Asp Ala Arg Cys Cys Arg Val His Pro
35 40 45
Thr Arg Cys Cys Gly Asp Tyr Gln Gly Glu Glu Cys Cys Ser Glu Trp
50 55 60
Asp Cys Val Cys Val Gln Pro Glu Phe His Cys Gly Asn Pro Cys Cys
65 70 75 80
Thr Thr Cys Gln His His Pro Cys Pro Ser Gly Gln Gly Val Gln Pro
85 90 95
Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Arg Cys Val Asp Cys Ala Leu Gly
100 105 110
Thr Phe Ser Arg Gly His Asp Gly His Cys Lys Pro Trp Thr Asp Cys
115 120 125
Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro Gly Asn Lys Thr His Asn
130 135 140
Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala Glu Pro Pro Gly Trp Leu
145 150 155 160
Thr Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys Val Leu Leu Leu Thr Ser
165 170 175
Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Pro Thr Gly
180 185 190
Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp
195 200 205
Ala Ser Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Leu Ala
210 215 220
Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
225 230 235
<210> 11
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Ile Pro Glu Pro Leu Pro Thr
145 150 155 160
Glu Gln Tyr Gly His Leu Thr Val Ile Phe Leu Val Met Ala Ala Cys
165 170 175
Ile Phe Phe Leu Thr Thr Val Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Arg Gln His Met Cys Pro Arg Glu Thr Gln Pro Phe Ala Glu Val
195 200 205
Gln Leu Ser Ala Glu Asp Ala Cys Ser Phe Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Gln Thr Glu Glu Lys Cys His Leu Gly Gly Arg Trp Pro
225 230 235 240
<210> 12
<211> 241
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro
20 25 30
Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg
35 40 45
Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu
50 55 60
Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His
65 70 75 80
Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro
85 90 95
Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys
100 105 110
Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys
115 120 125
Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro
130 135 140
Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala
145 150 155 160
Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys
165 170 175
Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu
180 185 190
Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val
195 200 205
Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu
210 215 220
Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp
225 230 235 240
Val
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Thr Gly Pro Ser Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Ile Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gly Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ile Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys

Claims (10)

1.一种抗GITR抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及轻链可变区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，VHCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，VHCDR2的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，VHCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，VLCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，VLCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，VLCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。
3.根据权利要求1所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段为单链抗体、Fv抗体、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性单链抗体、线性抗体或多特异性抗体。
4.根据权利要求1-3任一所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段特异性结合人GITR。
5.一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
（1）包含重链可变区的免疫球蛋白重链，所述重链可变区包含SEQ ID NO:1、2和3的VHCDR1、2和3，并且其中所述重链可变区在与如SEQ ID NO:14中所示氨基酸序列的轻链可变区配对时结合GITR；和，
（2）包含轻链可变区的免疫球蛋白轻链，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:4、5和6的VLCDR1、2和3，并且其中所述轻链可变区在与如SEQ ID NO:13中所示氨基酸序列的重链可变区配对时结合GITR。
6.一种细胞，其特征在于，所述的细胞包含权利要求5所述的核酸。
7.一种抗GITR抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，培养权利要求6所述的细胞，获得抗GITR抗体或其抗原结合片段。
8.一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的权利要求1-4任一所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种药物组合物，其包含权利要求1-4任一所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求8所述的抗体-药物缀合物，以及可药用载体。
10.权利要求1-4任一所述的抗GITR抗体或其抗原结合片段在制备治疗GITR/GITRL相关的疾病的药物中的用途。
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