CN111763251B

CN111763251B - 一种白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用

Info

Publication number: CN111763251B
Application number: CN202010707862.3A
Authority: CN
Inventors: 彭燕; 蒲棋; 吴星; 章有知; 程碧真; 孙梦薇; 贾彤; 冯华昊
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111763251A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用。本发明所述白三叶转录因子TrNAC氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的白三叶转录因子TrNAC具有潜在的抗非生物胁迫能力，其编码序列在干旱、盐、低温、重金属胁四种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高，将其编码序列转入到拟南芥中，转基因植株较野生型生长速度更快，叶片更大型，同时在自然干旱胁迫下也表现出明显的抗旱性，对培育高生长性能和抗非生物胁迫能力的植物具有重要意义。

Description

一种白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用。

背景技术

白三叶(Trifolium repens L.)是多年生冷季型豆科牧草，在我国西南和长江中下游等地区广泛种植。因其具有产量高、适口性好、营养成分及消化率高以及生物固氮能力强等特点，成为世界各地栽培利用的主要豆科牧草之。此外，由于白三叶茎叶优美、再生速度快，并且具有防止水土流失、吸附尘土、净化空气等功能，成为温带地区观赏性草坪和绿地建植的主要草种。然而，白三叶喜冷凉湿润气候，根系浅，调控蒸腾能力低，耐旱性差，且白三叶一般种植于土层浅薄、贫瘠的土地，在缺水条件下，其生长、产量以及抗病害的能力都会受到严重影响。在干旱易发地区种植白三叶，其生产力和持久性会受到限制。因此干旱是限制白三叶优质、高产的主要因素之一。因此，发掘提高白三叶生长及抗旱相关基因并进行功能验证将为提高白三叶产量及其抗逆性奠定重要基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种白三叶转录因子TrNAC及其编码序列，使得所述TrNAC在干旱、盐、寒冷和重金属胁迫下表现出较高的表达量，同时可以提高植物生长性能，可以作为潜在的植物抗逆蛋白和提高生长性能蛋白；

本发明的另外一个目的在于提供上述TrNAC在提高植物抗逆性中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供上述TrNAC在提高植物生长性能中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种白三叶转录因子TrNAC，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明以白三叶品种“拉丁诺”为材料，从其基因序列中获得了一种能够在非生物胁迫下表现出较高潜在白三叶转录因子TrNAC，通过qRT-PCR验证了所述转录因子TrNAC的编码序列在干旱、盐、低温、重金属胁迫下的表达模式，结果表明该编码序列在这四种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高。

在非生物胁迫下，所述转录因子TrNAC的编码序列在根与叶中的表达量均发生了显著的变化，各胁迫条件及时间点下有所差异。将该编码序列通过基因工程的手段转入到拟南芥中，转基因植株较野生型生长速度更快，叶片更大，根系更长和更多；在自然干旱胁迫下也表现出明显的抗旱性。

同时，本发明还提供了所述转录因子TrNAC的编码序列，在本发明具体实施方式中，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示序列中的1-882bp或如SEQ ID NO:2所示序列。此外，本发明还提供了含有所述编码序列的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒的技术方案，以期利用基因工程手段去表达所述转录因子TrNAC。

基于本发明所述转录因子TrNAC在植物非生物胁迫下以及促进生长(生长速度快、叶片更大、根系更长和更多)的效果，本发明提供了所述转录因子TrNAC在提高植物抗逆性中的应用或在在提高植物生长性能中的应用。

在本发明具体实施方式中，所述抗逆性选自抗旱、抗盐、抗寒和抗重金属中的一种或两种以上；所述植物为白三叶或拟南芥。

根据应用，本发明还提供了一种提高植物抗逆性和/或生长性能的方法，利用基因工程技术将本发明所述编码序列导入到目标植物中，提高目标植物的抗逆性和/或生长性能。

其中，所述基因工程技术可采用本领域中已记载的导入基因的技术手段，如利用农杆菌介导的花序浸染法、重组质粒、重组菌、转基因细胞系或表达盒等等对导入基因实现过表达；在本发明具体实施方式中，所述基因工程技术为农杆菌介导的花序浸染法。

由以上技术方案可知，本发明提供的转录因子TrNAC具有潜在的抗非生物胁迫能力，其编码序列在干旱、盐、低温、重金属胁四种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高，将其编码序列转入到拟南芥中，转基因植株较野生型生长速度更快，叶片更大型，同时在自然干旱胁迫下也表现出明显的抗旱性，对培育高生长性能和抗非生物胁迫能力的植物具有重要意义。

附图说明

图1所示为四种非生物胁迫下白三叶TrNAC定量表达分析；其中，纵坐标为相对表达量，横坐标为处理时间(0、1.5、3、6、12、24h)，每组柱形中左侧为根部的相对表达量，右侧为叶片的相对表达量；

图2所示为野生型与过表达TrNAC拟南芥植株正常情况下生长情况；从左至右分别为WT(野生型)，过表达株系OE1，OE1，OE8和OE12；

图3所示为野生型与过表达TrNAC拟南芥植株干旱胁迫下生长情况；其中，左上及右下为野生型植株，右上及左下为过表达植株。

具体实施方式

本发明公开了一种白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的白三叶转录因子TrNAC的编码序列开放阅读框为882bp，共编码293个氨基酸。

本发明的白三叶转录因子TrNAC的编码序列通过ProParam工具预测白三叶转录因子TrNAC分子式为C₁₅₃₁H₂₃₀₁N₄₀₇O₄₅₇S₁₁，分子量(MW)为34.07kDa，等电点理论pI为5.77，带有负电残基(Asp+Glu)43个，带有正电氨基酸残基(Arg+Lys)38个。该蛋白为稳定的非跨膜亲水性蛋白，具有多个磷酸化位点；通过对其二级结构和三级结构预测发现，其是由22.87％的α螺旋，9.90％的β转角，19.11％的延伸链和48.12％的无规则卷曲构成的蛋白。

在本发明的对比试验中，如未特别说明，各组除去人为设置的区别外(比如转入本发明所述白三叶转录因子TrNAC的编码序列或不转入所述白三叶转录因子TrNAC的编码序列的区别)，其他试验条件均保持一致。

以下就本发明所提供的一种白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用做进一步说明。

实施例1：白三叶转录因子TrNAC的基因克隆

1、实验材料

以白三叶品种“拉丁诺”为供试材料(购买于成都绿草园种业有限责任公司)，种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒后用Hoagland全营养液水培于光照培养箱中12h光照(23℃)，12h无光(19℃)，相对湿度75％，光照强度250umol·m^-2·s^-1，培养30d后，进行RNA的提取和cDNA的合成。

采用TIANGEN生物科技有限公司RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(离心柱型)(DP432)，并参照其操作手册进行。

cDNA的合成：采用PrimeScript^TMI II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒；先在微型管中配制反应混合液，随后42℃反应2min，冰上迅速冷却。反应混合液体系如表1：

表1反应混合液体系表

在另一微型管中配制反转录反应液总量为20μL。缓慢混匀后进行反转录反应。37℃下反应15min后，再85℃5sec，4℃冰上冷却。反转录反应体系如表2：

表2反转录反应液表

2、基因克隆

使用

Max DNA Polymerase进行PCR反应。反应体系如表3：

表3 PCR反应体系表

PCR反应程序：(1)94.0℃，5.0min；(2)98.0℃，10.0sec；55.0℃，5.0sec；72.0℃，5.0sec；共35cycles；(3)72.0℃，10.0min。

PCR反应引物为：

Forward primer(5'--3'):ATGCAGGGTGAATTAGAATTGCCAC；

Reversed primer(5'--3'):TCAAAATGGTTTTTGTTGGAACATG；

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用TIANGEN Mid Purification Kit普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)，并按照其操作说明进行。

通过PCR扩增及测序，得到了目的基因，该基因序列全长为1193bp(SEQ ID NO:2所示)，包含1个882bp的开放阅读框，编码293个氨基酸。再利用NCBI Blast在线比对该基因与其他植物中同一基因的亲缘关系，并利DNAMAN软件对鹰嘴豆(Cicer arietinum)、红豆(Abrus precatorius)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中该基因编码的氨基酸进行多序列比对。结果显示，该基因编码的氨基酸序列与蒺藜苜蓿、鹰嘴豆和红豆同源性较高，分别达到94％、83％和80％，故将该基因命名为TrNAC。

实施例2：TrNAC在非生物胁迫下的表达模式分析

1、荧光定量PCR

取0.1g离体根和叶片分别进行如下处理：1)200mmol/L NaCl；2)15％PEG；3)4℃低温；4)35℃高温；5)600μmol/L CdSO₄；6)5mmol/L CaCl₂；7)10mmol/L H₂O₂；8)25μmmol/LSNP；9)100mM ABA；10)20μM Spm；11)1mM IAA；在处理时间0h、1.5h、3h、6h、12h和24h后取样，提取总RNA用于反转录cDNA。测定不同组织不同处理下NAC的表达量。

荧光定量qRT-PCR反应体系及程序参考SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明书进行(购买于TaKaRa公司)。反应程序为：(1)95.0℃，30sec；(2)94.0℃，30.0sec；58.0℃，30.0sec；72.0℃，60.0sec；共30cycles；(3)72.0℃，5.0min。

检测TrNAC与内参基因β-Actin的Ct值，样品设3个独立的生物学重复以及四次技术重复。采用2^–ΔΔCt方法计算，相对表达量(Relative quantification)＝2^{–ΔΔCt目的基因}。

TrNAC引物序列为：

Forward primer(5'--3'):CTAATCGGGCTGCTGGAAG；

Reversed primer(5'--3'):GCGCTTTACCGGCATAGAA。

β-Actin引物序列为：

Forward primer(5'--3'):TTACAATGAATTGCGTGTTG；

Reversed primer(5'--3'):AGAGGACAGCCTGAATGG。

2、试验结果

通过荧光定量PCR验证了TrNAC在干旱、盐、低温和重金属胁迫下的表达模式，结果表明该基因在这四种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高。

TrNAC基因在四种非生物胁迫下无论是在根系还是在也叶片中的表达量均上升，各时间点有所差异。在干旱胁迫下，TrNAC在根系和叶片中的表达量的变化曲线相似，均在3h时增长达到峰值，分别提高了约155倍和174倍。在重金属CdSO₄胁迫下，叶片和根系中TrNAC显著上调，叶片中的上调幅度更大，分别在6h和24h达到峰值，提高约100倍和970倍。低温和盐胁迫下，根系中和叶片中TrNAC表达量也均有显著上调，叶片上调幅度大于根系中的表达量(如图1所示)。以上结果均表明TrNAC基因在白三叶对非生物逆境胁迫的抵抗中发挥了重要作用。

实施例3：TrNAC转拟南芥的验证

1、方法

1.1过表达载体构建

选择pBI121为表达载体，载体质粒提取采用TIANgen质粒小提试剂盒并按照其操作说明进行，后利用XBaI和XmaI限制性内切酶对载体进行双酶切，使之与TrNAC开放阅读框完整相连，转化农杆菌并挑取单克隆菌落测序检测。利用TIANGEN Midi Purification Kit普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行酶切产物回收。将连接成功的单菌落保存于-80℃。

1.2拟南芥的种植与培养

称取一定量的灭菌营养土装入塑料盆钵中置于托盘内；将拟南芥种子小心倒于湿润的滤纸上，置于4℃冰箱春化2-3天；使用镊子均匀地将春化后的种子于装满营养土的盆钵内，在21℃、光照/黑暗8h/16h条件下(1月后调整为光照/黑暗16h/8h)培养；每隔3-4天浇水一次，待其发芽一月以后，每半个月浇一次1/2Hoagland营养液。

1.3花序浸染法转化拟南芥

将含有目的基因的农杆菌于2mL Kan抗性的液体LB培养基中(28℃200r/min)过夜培养；将培养后的菌液(0.5％)于200mL Kan抗性的液体LB培养基中(28℃200r/min)过夜培养；将上述菌液取50mL于4℃8000r/min离心10min，后取上清液悬浮于5％蔗糖溶液；测定菌液OD₆₀₀值为0.8(5％蔗糖溶液调零)；剪去拟南芥已开花的花序及荚果，将未开花但是露白的花序浸入农杆菌菌液中15sec左右；浇水后在黑暗条件下培养48h后正常培养，收取T₀代种子。

选取饱满的T₀代种子消毒后均匀置于Kan抗性的1/2MS培养基中，4℃春化2d后正常条件培养；培养两周后，选取生长良好、长势正常的拟南芥移栽至装满营养土的盆钵中；提取拟南芥叶片DNA，以此为模板，进行PCR验证，将与目标条带一致的产物送有康生物公司测序比对。将验证正确的拟南芥收取种子后继续培养。

2、结果

将TrNAC基因通过基因工程的手段转入到野生型(Col-0)拟南芥中，通过观察发现，在相同的正常条件下，过表达转基因植株较野生型生长速度更快，叶片更大型，根系更长和更多(图2)；由于基因***拟南芥是T-DNA***法，浸染时可能***的位点不一样，所以不同过表达株系之间表达量不一样，会导致基因有不同的表达，植株的状态存在少许差异，但是均比野生型的状态更好。

而在相同的自然干旱胁迫下，过表达转基因植株相较于野生型从表型观察上生长更好，表现出更好的抗旱性(图3)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种白三叶转录因子TrNAC及其编码序列和应用

<130> MP2014345

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gln Gly Glu Leu Glu Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr

1 5 10 15

Asp Glu Glu Leu Val Asn His Tyr Leu Cys Arg Lys Cys Ala Gly Gln

20 25 30

Ser Ile Ser Val Pro Val Val Lys Glu Val Asp Leu Tyr Lys Phe Asp

35 40 45

Pro Trp Gln Leu Pro Glu Leu Gly Tyr Gln Ser Glu Lys Glu Trp Tyr

50 55 60

Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn

65 70 75 80

Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro

85 90 95

Ile Gly Lys Leu Lys Pro Met Gly Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr

100 105 110

Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu

115 120 125

Tyr Arg Leu Ala Asn Val Asp Arg Ser Ala Gly Lys Lys Asn Asn Leu

130 135 140

Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys Gly Lys

145 150 155 160

Ile Glu Lys Phe Asn Asn Asn Asn Thr Pro Lys Val Gln Asn Tyr Tyr

165 170 175

Glu His Glu Glu Glu Gln Glu His Glu Met Lys Pro Glu Ile Lys Lys

180 185 190

Leu Gly Asn Tyr Gln Leu Tyr Met Asp Thr Ser Asp Ser Val Pro Lys

195 200 205

Leu Asn Thr Asp Ser Ser Ser Ser Gly Gly His Val Val Ser Pro Asp

210 215 220

Ile Thr Cys Asp Arg Glu Val Gln Ser Glu Pro Lys Trp Asn Glu Phe

225 230 235 240

Gly Ile Gln Leu Asp Asp Ala Phe Asp Phe Gln Phe Asn Tyr Leu Glu

245 250 255

Asn Ala Leu Ser Phe Asp Tyr Asp Asp Asp Pro Phe Gly Thr Asn Asp

260 265 270

Gln Tyr Gln Ile Asn Gln Leu Ser Pro Leu Gln Asp Met Phe Met Phe

275 280 285

Gln Gln Lys Pro Phe

290

<210> 2

<211> 1193

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcagggtg aattagaatt gccacctggt ttcagatttc atccaactga tgaagaattg 60

gtgaatcatt acttatgtag gaaatgtgct ggtcaatcaa tttctgttcc tgttgtcaaa 120

gaagttgatt tgtataagtt tgatccatgg cagctacctg aattgggata ccaaagtgag 180

aaagaatggt actttttctc tccaagggat cggaaatacc cgaacggttc gcggcctaat 240

cgggctgctg gaagtggtta ttggaaagct accggagctg ataaaccgat cgggaaattg 300

aaaccgatgg ggattaaaaa ggcactggtt ttctatgccg gtaaagcgcc taaaggagtg 360

aaaactaatt ggattatgca tgaatatcgt cttgcaaatg ttgatcgatc ggccggcaag 420

aaaaacaact taaggcttga tgattgggtg ttatgtagaa tctacaacaa gaaagggaag 480

attgagaaat tcaacaataa caacacacca aaggttcaaa attactatga gcatgaagaa 540

gaacaagaac atgaaatgaa gccagaaatt aagaaattgg ggaactacca attgtacatg 600

gacacatcag attcagttcc aaagctgaac acagattcaa gcagttcagg aggacacgtg 660

gtttcaccag acatcacatg tgacagagag gttcagagtg agccaaaatg gaatgaattt 720

ggaatacagc tggatgacgc gtttgatttt cagttcaatt acttggaaaa tgcactttct 780

tttgattatg atgatgaccc ttttgggacc aatgatcagt accaaatcaa ccagctttca 840

ccattacaag acatgttcat gttccaacaa aaaccatttt gattcttgtt tttgacacaa 900

caaaaaaaca agactttttg gtaaagggta attggggggt tgcctaatta atttattttt 960

tgtaggaaaa gttataatta attcatgcaa ttacacctaa ttagctgcta tatgtggtgg 1020

accactcagg ataattagtt attcttattc tattctctag agagattagg ggaatgtgat 1080

ttttggttga catggaccat ttggaatatt ggacctaatg tatgcaaaaa aaacagaaga 1140

attgtaaaag tgtaaaagga gataggttct gcagtgtgta agtaaaaaaa caa 1193

Claims

1.一种白三叶转录因子TrNAC，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述白三叶转录因子TrNAC的编码基因。

3.根据权利要求2所述编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示序列中的1-882bp或如SEQ ID NO:2所示序列。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、重组菌或表达盒。

5.过表达权利要求1所述白三叶转录因子TrNAC在提高植物抗逆性中的应用或在提高植物生长性能中的应用；

所述抗逆性选自抗旱；

所述提高植物生长性能为植物生长速度更快、叶片更大型、根系更长和更多。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述植物为白三叶或拟南芥。

7.一种提高植物抗逆性和/或生长性能的方法，其特征在于，利用基因工程技术将权利要求2或3所述编码基因导入到目标植物中，提高目标植物的抗逆性和/或生长性能；

所述抗逆性选自抗旱；

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述基因工程技术为农杆菌介导的花序浸染法。