CN111757927B - 用于根器官培养物的生物反应器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于根器官培养物的生物反应器，其使得能够在无菌环境之外进行大部分接种或生物量转移、培养物的培养和收获。本发明进一步涉及生产和无菌收获根的方法，以及单独或作为还包括接种容器或至少一个另外的生物反应器的装置的部分使用上述生物反应器生产根培养物的方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于根器官培养物的生物反应器，其使得能够在无菌环境之外进行大部分接种或生物量转移、培养物的培养和收获。本发明进一步涉及生产和无菌收获根的方法，以及单独或作为还包括接种容器或至少一个另外的生物反应器的装置的部分使用上述生物反应器生产根培养物的方法。
发明背景
根器官培养物的生产提供了获取植物组织衍生化合物的途径，而避免了从田间起源植物衍生化合物的常见弊端。在生物反应器中，所有环境因素都可以在窄的范围内控制。该益处允许灵活、可再现且可预测的生物量收获以衍生经济上相关的化合物，例如次生植物代谢物。根器官培养物通常不依赖于光合作用，并从培养基中隔离所有必需的营养物。然而，根器官培养物可分为发根和不定根。
发根(hairy root)来源于用发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化的植物材料。转化后，植物组织在细根中生长，没有进一步分化成不同的组织类型。可以使用发根培养物，利用其一系列代谢途径或植物来源，在液体培养物中产生高价值的次生植物代谢物。代谢物和其他有价值的产物包括染料、调味剂、农药和药物。根器官培养物通常是遗传稳定的长期培养物，并且发根培养物是特别有利的，这是由于发根表现出的快速生长通常与悬浮的非植物真核细胞培养物的生长速率相当。重要的是，与这些其他悬浮培养物相反，发根培养物不需要对培养物添加生长调节因子。
然而，由于这些根的形态，大规模的发根培养存在一些问题。具体来说，发根具有正常植物根的主要形态特征，这意味着它们适合于在固体培养基上生长。因此，它们在液体培养物中生长时相互附着，并在液体培养基中伸长生长时形成致密的团。由于这些根团，在接种(生物反应器生产过程的第一步)过程中就已经出现处理发根培养物的困难。
原核或其他真核生物体的细胞悬浮培养物可以容易地在容器之间转移以进行接种，其中通过管和导管在容器或容器室之间的转移几乎不依赖于各自的生物量浓度。相反，随着培养物生物量持续生长，发根团的大小增加。因此，就接种管、管和端口而言，用于接种较大培养物的接种物中较高的生物量浓度影响合适的接种容器和生物反应器的技术设计方面。因此，从实验室到工业规模的培养规模扩大，生长形态极大限制了基于发根的生产过程的技术装置的设计空间。
到目前为止，这些挑战仅得到部分解决。实验室规模的发根培养物中使用的标准程序是手动解剖根团，随后将所得的根块手动转移至生物反应器。因此，接种容器和生物反应器通常在无菌环境，例如层流工作台中开放以在不污染培养物的情况下手动转移根块。然而，这种方法很难放大到工业生产体积。
Ramakrishnan et al.(1994,Biotechnology techniques 8(9):639-644)进行了向用发根培养物接种生物反应器的可放大解决方案的第一步。他们使用灭菌的搅拌器将预培养物的根匀浆化以制备接种物。然后将得到的浆液过滤，吸干并通过4L转移容器通过使用压缩空气的正置换转移到16.68L生物反应器中。然而，切割、过滤、吸干和填充转移容器的步骤都必须在无菌环境中进行，这与手动转移一样限制这种方法的可缩放性。
Wilson et al.(1990,Progress in Plant Cellular and Molecular Biology,pp.700-705；and WO 89/10958)能够使用与500L生物反应器顶部以凸缘连接的专用接种容器来接种500L中试规模生物反应器。然而，该较小的接种容器的接种也必须在无菌环境中进行，也在无菌环境中解剖根块。除此之外，从500L扩大到工业规模培养体积的问题仍然难以捉摸，并且尚未报告针对反应器接种目的的发根培养接种或转移的可缩放解决方案。
在接种生物反应器并在所述生物反应器中培养发根培养物之后，收获发根培养物在可缩放性方面面临类似的一系列问题。发根培养物的形态特征预先确定了必要的反应器规格。如前所提及，发根纠缠在一起，并在与生长相关的长度增加和根分支后形成团。随着进一步的生长，根团变得更大且更密，直至团的最外层根限制与团内部的营养物、代谢物和氧交换的点。结果是观察到的生物量增长的减少，其由一般活的根的饥饿导致的死亡引起。因此，现有技术的反应器通常共享某种固体附着基质以用于发根生长。这些基质增加了生物量在反应器体积上的分布。凭借更好的生物量分布，降低根团密度并且使根死亡最小化(见例如WO 89/10958)。
然而，关于这些反应器***的可缩放性的问题在体积大于100-500L(在生物工艺工程中视为“中试规模”)时出现。为了反应器收获并转移到更大的生产反应器(称为种子链)，首先必须将生物量从附着基质中分离出来，然后必须转移到更大的反应器。在这些必要步骤期间，必须避免任何种类的污染，即这些步骤必须在无菌条件下进行，例如通过使用层流，这使得它们的实现变得费时、困难且昂贵。
适用于发根培养物的现有技术的反应器都需要提供无菌环境以用于其操作，例如通过使用洁净室技术，以便在收获时保持无菌，因为必须开放反应器容器中的大开口以手动收获根培养物。尚未描述将收获的发根培养物自动无菌转移到更大的反应器容器(种子列(seed train))中或用于提取期望的次生代谢物。
此外，上文描述的Wilson等人的500升反应器项目由于无菌性问题于21世纪早期关闭。
总而言之，当试图实现大规模发根培养时，存在两个主要问题：接种生物反应器，即切割，任选地清洗活发根生物量，以及将活发根生物量转移到大规模培养物中，以及从大批量培养物生产和无菌收获发根，即从附着基质上分离发根，切割它们，并任选地将它们转移到更大体积的培养物中，都需要在昂贵且大规模的、不切实际的无菌(例如洁净室)条件下进行人工工作。
因此，需要用于所有规模的发根培养物的替代接种容器和生物反应器，其实现上述过程的自动化并且不需要无菌环境。
像发根一样，不定根是植物组织，其可用于根器官培养中以生产与工业相关的次生代谢物。虽然两者都具有共享表型根生长，但是此种生长是由不同的触发因素诱导的。如上所述，使用发根土壤杆菌来建立发根，以转化植物组织并引起典型的发根生长。与发根相反，不定根是通过在培养基中使用植物生长激素来建立和维持的。对于相同的植物生物体，毛状和不定根的生长速率可以是相当的，在约0.01–0.5d-1范围内。虽然同一植物物种的不定根和发根之间表型和形态学特征是相当的，但是生理学特征相差很大。例如，不定根需要连续补充植物生长激素，而认为发根具有遗传稳定性。另外，在切割根生物量时，已显示发根的生长速率下降(Krombholz et al.,Planta Medica 58(34):328-333,1August 1992)。相比之下，已显示不定根的生长速度在将根切成碎片后增加(Krombholz et al.,PlantaMedica 58(34):328-333(1August 1992)；Sung et al.,Plant Cell,Tissue,and OrganCulture 62(3):187-193(1January 2000)；Paek et al.,Plant cell,Tissue and OrganCulture 81(3):287-300(1June 2005))。
尽管生理学不同，但在液体培养基中培养的发根的表型类似于不定根培养物的表型。在这两种培养物中，根在整个生长期期间伸长并分支，因此表现出大的纠缠在一起，因此形成团的趋势。团形成的此趋势随着培养时间和生物量含量而增加。这些致密堆积的团大大阻碍了自动化处理。这些团可以达到堆积密度，其中在不使用外部机械能(例如，均质化)的情况下无法实现团的崩解。此外，代谢物的除去和培养基以及气体交换在团的中心部分中受到严格限制，从而损害生物量的生长。尽管已经显示均质化对生长速率的影响在发根和不定根之间不同，但是这种团形成和相关的含义是毛状和不定根培养物的共同特征。得出结论，由于不定根对剪切应力的敏感性，它们比不定根更难以培养。因此，适合于发根培养的任何方法或容器也适合于不定根的培养，但是相反的情况不适用。
发明概述
发明人已经开发了适用于大规模根器官培养物的生物反应器，其使得能够在不需要无菌环境的情况下接种、生产和无菌收获根器官培养生物量。发明人进一步开发了装置，该装置包括此类生物反应器和接种容器或至少一个另外的生物反应器，该装置实现切割和任选地清洗容器内的根的过程，进一步适于将如此制备的接种物转移到生物反应器中，并且不需要这些步骤中任一者的无菌环境。
本发明的目的通过独立权利要求的主题解决。根据从属权利要求，优选实施方案是显而易见的。
在一个实施方案中，本发明提供了用于培养根器官培养物的生物反应器，其包含：
培养室(2)；
位于所述生物反应器底部的快速可旋转刀或转子定子(6)；
接种口(1)，其中所述接种口(1)的内径≥10mm；
收获口(5)，其中所述收获口(5)的内径≥10mm，并且其中所述收获口(5)位于所述生物反应器的底部；和
两个通风出口(3、4)，其中一个通风出口用于气体入口，并且另一个通风出口用于气体出口。
在一个实施方案中，生物反应器还包括气体喷雾器(gas sparger)(7)。在一个实施方案中，生物反应器还包括1至4个用于汲取管的出口(8)，其中所述1至4个汲取管用于碱添加、进料添加、酸添加和/或取样。在一个实施方案中，生物反应器还包括1至3个用于探针(9)的端口，其中所述探针用于测量pH、溶解氧和/或电导率。在一个实施方案中，培养室(2)的体积为1-100000L。
在一个实施方案中，生物反应器进一步包含
附着基质(attachment matrix)(10a)；
可旋转的附着基质架(attachment matrix mounting)(12)；
用于根分离的垂直剪切刀片(11a)；和
用于所述剪切刀片(13)的支持环；
其中所述附着基质(10a)上的附着点垂直排列，并且所述附着基质(10a)在所述可旋转附着基质架(12)上可垂直旋转，并且所述垂直剪切刀片(11a)是静止的。
在另一个实施方案中，生物反应器不包含附着基质。
在又一个实施方案中，生物反应器进一步包含附着基质(10b)，其中所述附着基质(10b)由珠构成，所述珠包含多糖和生长培养基。在一个实施方案中，多糖选自下组：藻酸盐、琼脂糖和胶凝糖(gellan)。在一个实施方案中，珠具有1-5mm的直径。
在另一个实施方案中，生物反应器进一步包含
附着基质(10c)；
中央垂直旋转轴；
多个水平排列的分离刀(11b)；
其中所述附着基质(10c)由多个水平的根支持盘构成，并且其中所述根支持盘以≥10cm的规则距离隔开，并且其中所述分离刀(11b)水平安装在所述垂直旋转轴上，使得一个分离刀位于距每个根支持盘的0.05-5mm的距离，并且其中分离刀(11b)的数目等于或大于根支持盘的数目。在一个实施方案中，所述多个根盘是不锈钢网格或不锈钢穿孔板。在一个实施方案中，生物反应器进一步包含
圆柱形引流管(14)
其中所述水平根支持盘安装在所述圆柱形引流管(14)的内部，其中所述引流管(14)由在其顶端和底端完全开放的圆柱体组成，并且所述气体喷雾器(7)由两个独立可用的喷射元件组成，其中之一(7a)位于所述引流管的中心下方，并且其中另一个(7b)是位于所述培养室的底部半部中的所述引流管下方或外部的环形喷雾器。
本发明还提供了生产和无菌收获根的方法，其包括以下步骤：
1)在本发明的生物反应器内的生长培养基中培养根器官培养物；
2)任选地将所述根器官培养物的根与所述生物反应器内部的附着基质(10a、10b或10c)分离；
3)任选地让所述根沉降；
4)使用所述生物反应器底部的所述快速可旋转刀或所述转子定子(6)切割所述生物反应器内部的所述根；并且
5)使用所述收获口(5)取出切割的根；
其中在所述生物反应器内部进行步骤1-4，并且步骤1-5不需要无菌环境。
在一个实施方案中，培养步骤进行1-12周。
在一个实施方案中，通过使用由生物反应器旋转基质(10a)上的所述剪切刀片(11a)施加的剪切力来完成所述分离步骤。
在一个实施方案中，培养步骤包括通过经由使用气体喷雾器(7)在整个培养步骤中以0.2-50sL/L/h充气所述根器官培养物来诱导培养基运动。在一个实施方案中，用无菌空气进行充气，所述无菌空气具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2的组成。
在一个实施方案中，通过溶解附着基质(10b)珠来完成所述分离步骤。在一个实施方案中，通过添加柠檬酸或多糖裂合酶(polysaccharide cleaving enzyme)溶解附着基质(10b)珠。在一个实施方案中，柠檬酸是pH 5-6的10mM柠檬酸。在另一个实施方案中，多糖裂合酶选自下组：藻酸盐裂合酶、胶凝糖裂合酶和β-琼脂糖酶。
在一个实施方案中，通过使用由生物反应器的根支持盘上方旋转的所述分离刀片(11b)施加的剪切力来完成所述分离步骤。
在一个实施方案中，通过以1-50m/s的尖端速度旋转在所述生物反应器底部的所述快速可旋转刀(6)或旋转所述转子定子(6)来完成所述切割步骤。在一个实施方案中，在0-35℃的温度进行所述切割步骤。
在一个实施方案中，使用蠕动泵、切碎机泵或螺旋输送机或通过用生长培养基冲洗来完成取出步骤。
本发明进一步提供了用于接种、培养和收获根器官培养物的装置，该装置包含连接到接种容器或本发明的至少一个另外的生物反应器的本发明的生物反应器。
在一个实施方案中，该装置包含本发明的第一生物反应器和本发明的至少一个另外的生物反应器，其中所述第一生物反应器与所述至少一个另外的生物反应器连接。
此类装置可以用于产生根的方法，包括
从活的根生物量制备用于根器官培养物的接种物的方法，其包括以下步骤：
1)在无菌环境中通过所述接种口(1)将活的根生物量引入装置的第一生物反应器中；
2)任选地在生长培养基的存在下培养引入的根生物量
3)任选地用所述第一生物反应器的快速可旋转刀或转子定子(6)切割所述根生物量，
任选地其中在0-35℃的温度进行切割步骤，
4)使用所述第一生物反应器的收获口(5)和所述至少一个另外的生物反应器的接种口(1)将切割的接种物从所述第一生物反应器转移到所述至少一个另外的生物反应器，
任选地其中通过无菌连接器发生所述转移步骤，其中所述无菌连接器提供最小的流动限制和/或其中所述连接器施加流动路径的最小横截面减小，任选地其中所述方法进一步包括冲洗所述第一生物反应器的步骤，其通过将生长培养基从所述至少一个另外的生物反应器再循环到所述第一生物反应器进行，
其中在所述第一生物反应器内进行步骤2和3，并且其中步骤2至4不需要无菌环境；
接着，使用所述至少一个另外的生物反应器进行本发明的生产和无菌收获根的方法；
其中所述第一生物反应器和所述至少一个另外的生物反应器包含在上述装置中。
在另一个实施方案中，该装置包含接种容器和生物反应器。在该实施方案中，接种容器用于从活的根生物量制备用于根器官培养物的接种物，并且包含：
接种室(21)
刀(16)，其中所述刀(16)是可旋转的搅拌器叶片结构或刀式研磨机结构的一部分，并且其中所述刀位于所述室内；
自所述室的3-5个出口，其中所述出口用于根生物量入口(15)、接种物出口(17)、通气、培养基入口(18,19)和培养基出口，并且其中所述出口的内径≥10mm。
在一个实施方案中，接种容器的3-5个出口用于尽可能少的根生物量入口、接种物出口、通风、培养基入口和培养基出口。在一个实施方案中，接种容器的3-5个出口中的至少一个可装有无菌螺帽或无菌旋转密封件(20)，并且其中剩余出口可装有无流动限制的无菌连接器，所述无菌连接器可连接到管。在一个实施方案中，用于接种物出口(17)和/或培养基出口的出口位于所述接种容器的底部。在一个实施方案中，接种室(21)的体积为0.2-50L，优选为0.2-2L。本发明进一步提供了生产根器官培养物的方法，该方法包括制备接种物的方法，随后是本发明的生产和无菌收获根的方法，其中本发明的接种容器和生物反应器包含在本发明的装置中。
此类装置可用于生产根的方法，包括从活的根生物量制备用于根器官培养物的接种物的方法，包括以下步骤：
1)在无菌环境中通过3-5个出口之一将活的根生物量引入作为本发明的装置的一部分的接种容器中；
2)用所述接种容器的刀(16)切割所述根生物量；
3)任选地使用用于培养基入口和培养基出口的所述接种容器的3-5个出口中的一个或多个用清洗介质来清洗切割的根生物量；和
4)使用用于接种物出口(17)的3-5个出口之一，将切割的且任选清洗的接种物从所述接种容器转移到生物反应器；
其中步骤2和3在接种容器内进行，并且其中步骤2至4不需要无菌环境，然后是本发明的生产和无菌收获根的方法。
在一个实施方案中，此方法的切割步骤是通过以1-50m/s的尖端速度旋转可旋转搅拌器叶片结构的刀(16)或旋转刀式研磨机结构的刀以施加剪切力来进行。在一个实施方案中，在0-35℃的温度进行切割步骤。
在一个实施方案中，清洗介质选自盐溶液、生长培养基和缓冲溶液。在一个实施方案中，将清洗介质添加到接种容器以通过3-5个出口之一重悬切割的根生物量，并且其中通过3-5个出口之一从接种培养基中除去清洗介质。在一个实施方案中，通过倾倒、泵送、重力或施加超压发生清洗介质的除去。
在一个实施方案中，转移步骤通过无菌连接器发生，其中无菌连接器提供最小的流动限制和/或其中连接器施加流动路径的最小横截面减小。
附图简述
图1显示了用于从活的发根生物量制备根接种物的接种容器，其包含发根生物量入口(15)、刀(16)、接种物出口(17)、培养基入口，通气的出口(18、19)和培养基出口、具有用于刀的旋转搅拌器轴的出口的旋转密封安装件(rotary seal mount)(20)和接种室(21)。
图2显示了用于生产和无菌收获根的生物反应器，其包含接种口(1)、培养室(2)、两个通气出口(3、4)、收获口(5)、快速可旋转刀(6)、气体喷雾器(7)、4个用于汲取管(8)的出口和3个用于探针(9)的端口。
图3显示了用于生产和无菌收获根的生物反应器，其包含接种口(1)、培养室(2)、两个通气口(3、4)、收获口(5)、快速可旋转刀(6)、气体喷雾器(7)、4个用于汲取管(8)的出口、3个用于探针(9)的端口、可旋转的附着基质(10a)、垂直剪切刀(11a)、可旋转附着基质架(12)和用于剪切刀片(13)的支持环。
图4显示了用于生产和无菌收获根的生物反应器，其包含接种口(1)、培养室(2)、两个通气口(3、4)、收获口(5)、快速可旋转刀(6)、气体喷雾器(7)、4个用于汲取管(8)的出口、3个用于探针(9)的端口和由珠构成的附着基质(10b)。
图5显示了用于生产和无菌收获根的生物反应器，其包含接种口(1)、培养室(2)、两个通气口(3、4)、收获口(5)、快速可旋转刀(6)、气体喷雾器(7)、4个用于汲取管(8)的出口、3个用于探针(9)的端口、由水平根支持盘(10c)构成的附着基质、水平排列的分离刀(11a)、中心垂直旋转轴(12)和圆柱形导流管(14)，所述气体喷雾器(7)由两个独立可用的喷射元件组成，其中之一(7a)位于所述引流管的中心下方，并且其中另一个(7b)是位于培养室的较低半部中的引流管外部的环形喷雾器。
图6显示了用于从活根系生物量中制备3L根系接种物的实验室规模的接种容器原型，包含根生物量入口(15)、刀(16)、用于接种物出口(17)、培养基入口、培养基出口(19)和通风(18)的出口、用于刀的旋转密封安装件(20)、接种室(21)、培养基转移管(22)、通过没有任何流动路径限制的无菌连接器(25)与要接种的生物反应器连接的出口管(23)和无菌过滤器(24)。
图7显示了在固体培养基上培养12或20天后手动切割的长度为2或12mm的发根片段的生长评估。A、C和E描绘了茎尖生长。B、D和F描述了中间片段的生长。A，B：以mm/d计的平均生长速率(N＝12)。C，D：占总片段的％的活片段。E，F：仅活片段的平均生长速率，以mm/d计。
图8显示了不同自动发根均质化实验的片段大小评估。误差棒描绘了3个技术重复的标准偏差。A：最低测试功率输入0.0008kWh/g时片段大小(以mm计)分布。B：在中等测试功率输入0.0016kWh/g时片段大小(以mm计)分布。C：在最高测试功率输入0.003kWh/g时片段大小(以mm计)分布。D：在三个测试的功率输入下，均质化培养物的液相在600nm处的光密度。
图9显示了不同生物反应器的内部元件的示意图。所有生物反应器具有3L的工作容积，并且特征为培养室、内径为10mm的接种口；位于生物反应器底部的内径为10mm的收获口(5)和两个通风口。设置2-6特征还在于位于生物反应器底部的快速可旋转刀或转子定子。设置2特征进一步在于附着基质和具有烧结金属喷雾器熔块(frit)的浸没管。设置3特征在于没有附着基质，但在培养过程中延伸到培养基水平之上的引流管。设置4特征在于在培养过程中延伸到培养基水平之上的引流管，由将引流管内的空间分成四个室的三个水平的根支持盘构成的附着基质，和在反应器底部的烧结的金属喷雾器熔块。设置5特征在于在培养过程中完全浸没在培养基中的引流管，由将引流管内的空间分成四个室的三个水平的根支持盘构成的附着基质，三个水平安装在中央垂直旋转轴上的分离刀，和反应器底部的烧结金属喷雾器熔块。设置6特征在于在培养过程中完全浸没在培养基中的引流管，由将引流管内的空间分成四个室的三个水平的根支持盘构成的附着基质，三个水平安装在中央垂直旋转轴上的分离刀和导流管底端下方的环。
图10显示了在图9中描绘的不同生物反应器中培养的发根培养物的生物量产率和可收获的生物量百分比分析。对培养物接种8-20g鲜量的由切割的发根片段组成的生物量，并培养15-42天。在生物反应器含有喷雾器的情况下，接种和培养期间的空气流动速率设置为10-15sL/h。A：以培养结束时的最终生物量(鲜重；以克计)除以代谢蔗糖(以克计)计算的总生物量产率，以黑条显示，培养结束时以总生物量％计的可收获生物量，以灰线显示。设置4和6的误差棒显示了3个技术重复的标准偏差。B：有效生物量产率，其通过将总生物量产率和来自A的可收获生物量相乘计算。
发明详述
如以下示例性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元件，一个或多个限制的情况下适当地实施。
将关于特定实施方案描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。
在本说明书和权利要求书中使用术语“包括/包含”时，其不排除其他元件。为了本发明的目的，术语“由...组成”认为是术语“包含”的优选实施方案，若在下文中将组定义为包括至少一定数目的实施方案，则这也应理解为公开了优选仅由这些实施方案组成的组。
当提到单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一个”、“一种”或“所述/该”时，除非明确说明，这包括该名词的复数形式。
如本文所用，术语“无菌环境”是指通过与周围环境相比没有微生物或具有减少数目的微生物来防止微生物污染的条件，其中每立方米的最大菌落形成单位(CFU/m3)为200(见EU GMP准则，洁净室D分类)。无菌环境可以是例如洁净室、层流工作台或无菌空间。
如本文所用，术语“根”是指适于稳定的根器官培养的任何植物根。特别优选的根是发根和不定根。
如本文所用，术语“发根”是指来源于用发根土壤杆菌转化的植物材料的根。转化后，植物组织在类似于毛发的细根中生长，没有进一步分化为不同的组织类型。
如本文所用，术语“不定根”是指通过使用植物生长激素源自植物材料的根。为了在体外培养中维持不定根生长，必须连续向培养基补充和/或持续含有植物生长激素。然后，植物组织在细根中生长，在培养基中不进一步分化为不同的组织类型。
如本文所用，术语“培养物”和“培养”是指通过在适于引起生物量增加并确保根材料的存活力的条件下温育来生产根材料。优选地，将所有必需的营养物供应到液体生长培养基中的根。液体生长培养基可以例如通过喷雾或滴流从上方间歇地施加到根材料，或者根材料可以间歇地连续浸没在其中。因此，根材料的液体培养物可以是例如浸没培养物或滴流床培养物。根据本发明的根器官培养物维持在生物反应器内。培养持续时间可以跨越1-12周。在一些实施方案中，培养是分批培养、补料分批培养或分批培养，接着补料分批培养。
如本文所用，术语“浸没培养”是指通过在整个培养持续时间期间将根完全浸没在液体生长培养基中来培养根。
如本文所用，术语“滴流床培养”是指通过将液体生长培养基从上方滴流到根上，使得培养基将覆盖根，然后进一步向下滴流来培养根。以这种方式，根连续或间断地涂有液体生长培养基的薄膜。与浸没在大量液体生长培养基中相比，这允许更好的气体交换。
如本文所用，术语“根生物量”是指任何活根。优选地，根生物量是根预培养物。如本文所用，术语“预培养”是指根材料的小规模培养，其中根材料几次传代到新鲜生长培养基中以增加总生物量和/或增加生物量密度。
如本文所用，术语“生长培养基”和“培养基”是指适合于促进根器官培养物生长的培养基。本发明的生长培养基通常是液体生长培养基，但是在某些实施方案中也可以通过添加多糖而固化或半固化。本发明的生长培养基将以等于或大于表1所列的最小浓度和小于或等于表1所列的最大浓度的浓度包含表1中所列的成分。优选的生长培养基为Schenk和Hildebrandt培养基(“SH培养基”)、木本植物培养基(“WPM”)、B5培养基、Murashige-Skoog培养基(“MS培养基”)、Strullu和Romand培养基(“SR培养基”)、改良的Strullu和Romand培养基(“MSR培养基”)和Becard和Fortin基本培养基(“M培养基”)。
表1
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如本文所用，术语“接种物”是指从活根生物量制备的根材料，所述根生物量已切成长度约2mm至约30mm的块，任选地用清洗介质清洗，并以0.1–2.5g/L，优选0.5g/L干质量或1.5–40g/L，优选8g/L重悬于新鲜的生长培养基中的湿质量的浓度。该接种物可用于在生物反应器中接种(即开始)根器官培养。
如本文所用，术语“制备接种物”是指切成约2mm至约30mm长度的块，任选清洗并以浓度0.1–2.5g/L，优选0.5g/L干质量或1.5–40g/L，优选8g/L来自活根生物量的湿质量活根材料重悬于新鲜生长培养基中的过程。
如本文所用，术语“清洗介质”是指例如盐溶液、生长培养基或缓冲溶液，并且适用于在制备接种物的过程期间清洗根生物量的根材料。如本文所用，术语“缓冲溶液”是包含弱酸及其共轭碱，或者反之亦然的混合物的水性溶液。缓冲溶液用作在极其多种条件下以及添加极其多种物质时将pH保持在接近恒定值的手段。
如本文所用，术语“接种容器”是指适于在其中制备用于根器官培养的接种物的容器。任选地包括在本发明的装置中的接种容器(见图1)包含接种室(21)，刀(16)，其中刀(16)是可旋转搅拌器叶片结构或刀式研磨机结构的一部分，且其中刀(16)位于接种室(21)内，和3-5个出口，其中出口用于根生物量入口(15)、接种物出口(17)、通风、培养基入口(18，19)和培养基出口，且其中内径≥10mm。优选地，接种容器具有4个出口，最优选地，接种容器具有5个出口。每个出口用于尽可能少的根生物量入口(15)、接种物出口(17)、通气、培养基入口(18、19)和培养基出口；即，每个出口仅用于上述过程中的2个，优选1个。接种容器的至少一个出口可以装有无菌螺帽或无菌旋转密封件。接种容器的剩余出口可以装有没有流动限制的无菌连接器。安装到接种容器出口的无菌连接器可以连接到管。优选地，用于接种物出口和/或培养基出口(17)的出口位于接种容器的底部，允许通过重力、施加压力或用培养基冲洗实现的接种物和/或培养基的出口。
接种容器的接种室(21)的室容积为0.2-50L，优选为0.2-25L，更优选为0.2-10L，还更优选为0.2-5L，最优选为0.2-2L.
接种容器由玻璃制成。更优选地，接种容器由硼硅酸盐玻璃制成。最优选地，接种容器由硼硅酸盐玻璃3.3(“Duran”)或“Pyrex”制成。有利地，玻璃接种容器具有高的机械耐久性和温度耐久性，允许通过高压灭菌进行灭菌。此外，玻璃接种容器是透明的，并且在转移到生物反应器之后残留在接种容器中的接种物的任何根材料都是清晰可见的。同样地，透明性允许用户看到通过将生长培养基从生物反应器再循环多少个冲洗循环后，经由接种容器，所有剩余的根物质已转移到生物反应器。
接种室的刀(16)是可旋转的搅拌器叶片结构或刀式研磨机结构的一部分。优选地，刀(16)可通过出口之一***到接种室中，并安装在无菌旋转密封件(20)上，该无菌旋转密封件可装配到刀(16)***藉由的出口。刀(16)可以自动旋转。优选地，可旋转搅拌器叶片结构的刀(16)以1-50m/s的尖端速度旋转。接种容器的刀(16)适于通过以1-50m/s的尖端速度旋转(若刀(16)是可旋转搅拌器叶片结构的一部分)或通过施加剪切力(若刀(16)是刀式研磨机结构的一部分)在接种室(21)内将源自根生物量的根材料切成长度约2-30mm的根碎片。接种容器的刀(16)由金属制成，优选由钢制成，最优选由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的金属刀(16)可以通过高压灭菌进行消毒，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。
可以安装到接种容器的至少一个出口的螺帽由聚丙烯制成。可以安装到接种容器的至少一个出口的旋转密封件由聚四氟乙烯(PTFE)制成。有利地，由于高温耐久性，可以通过高压灭菌来对螺帽和/或旋转密封件进行灭菌。
可以安装到接种容器的剩余出口的连接器提供最小流动限制，并且具有10mm的最小内径。连接器可以是插头连接(plug junction)。连接器由聚碳酸酯、聚丙烯或金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI316L,(A4L)”制成。有利地，可以通过高压灭菌对连接器进行灭菌。合适的示例性连接器是KleenpakTM无菌连接器(Pall Cooperations，见US 6 655 655 B1)和三夹连接器(tri-clamp connector)。
如本文所用，术语“提供最小流动限制”是指具有最小内径10mm的连接器，该内径在所述连接器的长度上的变化不能改变超过+/-30％。此外，连接器的内径必须不小于连接到连接器的任何管的内径的70％。
如本文所用，术语“施加流动路径的最小横截面降低”是指具有最小内径10mm和自由横截面面积的连接器，该自由横截面面积在流过连接器的方向上在所述连接器的整个长度上不能改变超过-50％和/或+70％。
可以连接到连接器的管由硅树脂制成，并且具有10mm的最小内径。有利地，硅树脂管将不含可浸出物，可由于高温耐久性进行高压灭菌，并且具有良好的机械稳定性和弹性，这在连接它们时(例如连接到蠕动泵时)是重要的。
如本文所用，术语“根生物量入口”是指将根材料(任选地悬浮于生长或清洗介质中)从根生物量转移到接种容器中。
如本文所用，术语“接种物出口”是指将在接种容器的接种室(21)内制备的接种物从所述接种室转移，优选转移到生物反应器中。
如本文所用，术语“通风”和“充气”是指将具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2的组成的灭菌空气引入本发明的接种容器和/或生物反应器中。可以通过使用气体喷雾器进行充气。如本文所用，术语“气体喷雾器”指将具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2的组成的灭菌空气起泡通过本发明的接种容器和/或生物反应器的装置。喷射增加气液界面。气泡越小，充气越温和，这对于防止对培养的根的损害是有利的
如本文所用，术语“出口”“端口/口”是指接种容器或生物反应器中的开口，其可以装配有连接器、螺帽或旋转真空密封件。
在接种容器和/或生物反应器的端口、出口、管、连接器、插头连接或其他组件具有10mm最小内径的任何地方，这允许大小范围2至30mm的根块无阻碍流过该组件。
接种容器可以用于制备接种物的方法，其作为也由本发明提供的生产根的方法的一部分。从活根生物量制备用于根器官培养物的接种物的方法包括以下步骤：
1)在无菌环境中，通过3-5个出口之一将根生物量引入作为本发明装置一部分的接种容器中；
2)用接种容器的刀(16)切割根生物量；
3)任选地使用用于培养基入口和培养基出口的接种容器的3-5个出口中的一个或多个用清洗介质来清洗切割的根生物量；和
4)使用用于接种物出口(17)的3-5个出口之一将切割的，且任选地清洗的接种物从接种容器转移到生物反应器；
其中步骤2和3在接种容器内进行，并且其中步骤2至4不需要无菌环境。因此，本发明的接种容器和制备接种物的方法使得能够在一个容器中将切割，任选清洗和转移结合起来，该容器可缩放至工业体积要求，而无需昂贵且难于缩放的无菌条件，例如洁净室。
优选地，在刀(16)是可旋转的搅拌器叶片结构的一部分时通过以1-50m/s的尖端速度旋转接种容器的刀(16)，或在它是刀式研磨机结构的一部分时通过用接种容器的刀(16)施加剪切力来切割根材料。切割步骤在0-35℃的温度进行。优选地，切割步骤在冷却条件下，即在0-26℃的温度下进行，以减少对根材料的损害和存活力丧失。
优选地，用于清洗根生物量的根材料的清洗介质是盐水、生长培养基或缓冲溶液。在清洗步骤中，通过接种容器的出口之一，优选通过专用培养基入口出口添加清洗介质，以重悬根生物量的根材料。然后通过接种容器的出口之一，优选通过专用于培养基出口的出口，将清洗介质除去，该出口优选位于接种容器的底部。清洗介质的除去优选通过倾倒、泵送、重力或施加超压发生，最优选通过泵送发生。
转移步骤通过无菌连接器进行，该无菌连接器提供了最小的流动限制和/或不施加流动路径的横截面减小并且具有10mm的最小内径。
通过上述本发明方法制备的接种物以悬浮于生长培养基中的0.1-2.5g/L，优选0.5g/L干质量或1.5-40g/L，优选8g/L湿质量的浓度含有长度2mm至约30mm的根块。
如本文所用，术语“生物反应器”是指适于在其中培养根器官培养物的容器。本发明的生物反应器(见图2)包含培养室(2)；位于生物反应器底部的快速可旋转刀或转子定子(6)；接种口(1)，其中所述接种口的内径≥10mm；收获口(5)，其中所述收获口的内径≥10mm，并且其中所述收获口位于所述生物反应器的底部；和两个通风出口(3、4)，其中一个通风出口用于气体入口，并且另一个通风出口用于气体出口。
生物反应器还任选地包含气体喷雾器(7)，其中用于气体入口的通风出口连接到气体喷雾器。任选地，生物反应器包含第二气体喷雾器，并且备选地或进一步包含1-4个用于汲取管(8)的出口，其中1-4汲取管用于碱添加、进料添加、酸添加和/或取样。任选地，生物反应器备选地或进一步包含1-3个用于探针(9)的端口，其中探针用于测量pH、溶解氧和/或电导率。
包括所有配件、盖、端口和出口的本发明的生物反应器由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的生物反应器可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。
培养室(2)是在生物反应器内进行培养步骤的室。培养室(2)的容积为1-100000L，优选为10-100000L，更优选为1000-100000L，最优选为10000-100000L。
生物反应器的快速可旋转刀(6)位于生物反应器的底部，可以以1-50m/s的尖端速度旋转，并且由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的快速可旋转刀(6)可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。
生物反应器的转子定子(6)位于生物反应器的底部，并且由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的转子定子(6)可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。
优选地，接种口(1)位于接种容器的上半部中，并且可以连接到无菌连接器，该无菌连接器施加最小的流动限制和/或施加最小的横截面减小，并且继而可以连接到通往接种容器的管或导管。根接种物通过该端口(1)转移到生物反应器的培养室(2)中以开始根器官培养。接种口(1)具有10mm的最小内径。
收获口(5)位于接种容器的底部，这允许收获切成2-30mm大小并通过重力而悬浮于生长培养基中的根材料，并且具有10mm的最小内径。
气体喷雾器(7)可以是以下类型中的任何一种：喷射管、烧结不锈钢喷雾器、多孔不锈钢元件、蜘蛛式喷雾器(spider type sparger)、环形喷雾器。气体喷雾器(7)用于向生物反应器的培养室(2)内的根器官培养物充气。气体喷雾器(7)由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的气体喷雾器(7)可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。
如本文所用，术语“通风”和“充气”是指将具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2组成的灭菌空气泵入本发明的接种容器和/或反应器中和/或泵出本发明的接种容器和/或反应器。
在接种容器和/或生物反应器的端口、出口、管、连接器、插头连接或其他组件具有10mm最小内径的任何地方，这允许大小范围2至30mm的根块无阻碍流过该组件。
如本文所用，术语“汲取管”是指可浸入生物反应器的培养室(2)内的根器官培养物中的管。它们可用于(例如)添加碱或酸以调节培养物pH和/或溶解多糖附着基质，在分批补料培养物中添加新鲜培养基(“补料”)和/或用于采集培养过程中根器官培养物的样品。
本发明的生物反应器也可以用于生产和无菌收获本发明的根的方法中。生产和无菌收获根的方法包括以下步骤：
1)在本发明的生物反应器内部的生长培养基中培养根器官培养物；
2)任选地从生物反应器内部的附着基质(9a，9b或9c)分离根器官培养物的根；
3)让根沉降；
4)使用所述生物反应器底部的所述快速可旋转刀或所述转子定子(6)切割所述生物反应器内部沉降的根；和
5)使用收获口(5)取出切割的根；
其中在生物反应器内部进行步骤1-4，并且其中步骤1-5不需要无菌环境。因此，本发明的生物反应器以及生产和无菌收获根材料的方法使得能够在一个容器中进行培养，任选地分离，切割和取出根材料的组合，该容器可以按比例缩放至工业体积要求，而无需昂贵且难于缩放的无菌条件，例如洁净室。
培养步骤优选进行1-12周，并且可以作为浸没培养来完成，例如作为分批培养、补料分批培养或分批培养，然后补料分批培养或作为滴流床培养。在一个实施方案中，培养是浸没培养，其是3-4周的分批培养，然后是8周的补料分批培养。
在一个实施方案中(见图3)，生物反应器还包括附着基质(10a)、可旋转的附着基质架(12)、用于根分离的垂直剪切刀片(11b)和用于剪切刀片的支持环(13)，其中附着基质(10a)上的附着点垂直排列，并且其中附着基质(10a)在可旋转附着基质架(12)上可垂直旋转，并且垂直剪切刀片(11b)是静止的。附着基质(10a)由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的附着基质(10a)可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。附着基质(10a)可由穿孔的金属片或金属网格制成，其中片或格栅中的孔充当培养物根的附着点。优选地，附着基质(10a)是网孔。更优选地，网孔大小是2x2mm至50x50mm，例如2x2mm、3x3mm、4x4mm、5x5mm、6x6mm、7x7mm、8x8mm、9x9mm、10x10mm、11x11mm、12x12mm、13x13mm、14x14mm、15x15mm、16x16mm、17x17mm、18x18mm、19x19mm、20x20 mm、21x21mm、22x22mm、23x23mm、24x24mm、25x25mm、26x26mm、27x27mm、28x28mm、29x29mm、30x30mm、31x31mm、32x32mm、33x33mm、34x34mm、35x35mm、36x36mm、37x37mm、38x38mm、39x39mm、40x40mm、41x41mm、42x42mm、43x43mm、44x44mm、45x45mm、46x46mm、47x47mm、48x48mm、49x49mm、或50x50mm。最优选的网孔大小将取决于接种培养物的根片段的平均大小。垂直剪切刀片(11a)由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的垂直剪切刀片(11a)可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。当使用该实施方案的生物反应器时，生产和无菌收获根的方法包括通过使用由旋转基质(10a)上的剪切刀片(11a)施加的剪切力来分离根。具体地，在该实施方案的生物反应器中，接种物的根材料将附着于附着基质(10a)的附着点并在培养期期间开始生长。一旦在培养物中达到合适的根材料密度，然后可以旋转附着基质(10a)，并且静态剪切刀(11a)将通过在旋转的附着基质(10a)表面上施加剪切力来切开根材料。因此，朝着培养室(2)的中心生长的根和朝着培养室(2)的外部生长的根都将被分离并通过重力在生物反应器的底部沉降。
在另一个实施方案中，生物反应器不包含附着基质(见图2)。当使用本实施方案的生物反应器时，生产和无菌收获根的方法包括在整个培养步骤中通过使用气体喷雾器(7)以0.2-50sL/L/h对根器官培养物充气来诱导培养基的连续运动。用具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2组成的灭菌空气进行充气。具体而言，根将在悬浮液中自由生长，培养基的运动防止沉降和/或上升以及形成过多的成团。一旦在培养物中达到合适的根材料密度，就停止充气，并且根物质将通过重力在生物反应器的底部沉降。
在又一个实施方案中，生物反应器还包含附着基质(10b)，其中附着基质(10b)由珠组成，所述珠包含多糖和生长培养基。(见图4)。优选地，多糖选自藻酸盐、琼脂糖和胶凝糖。优选地，珠的直径为1-5mm。当使用本实施方案的生物反应器时，生产和无菌收获根的方法包括在整个培养步骤中通过使用气体喷雾器(7)以0.2-50sL/L/h对根器官培养物充气来诱导培养基的连续运动，并且分离步骤包括溶解附着基质(10b)珠。用具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2组成的灭菌空气进行充气。附着基质(10b)珠的溶解通过添加柠檬酸，优选10mM的pH 5-6的柠檬酸或多糖切割酶来完成。多糖切割酶将取决于所使用的多糖。对于藻酸盐珠，添加藻酸盐裂合酶。对于胶凝糖珠，添加胶凝糖裂合酶；对于琼脂糖，添加β-琼脂糖酶。具体而言，接种物的根将附着在附着基质(10b)珠，所述珠由于生长培养基中充气诱导的培养基运动而在悬浮液中自由漂浮。根然后生长，最终形成珠间团块。一旦在培养物中达到合适的根材料密度，就停止充气，并且珠通过重力沉降到生物反应器的底部。通过溶解珠，仅根材料仍然在生物反应器底部沉降。
在又一个实施方案中，生物反应器(见图5)还包括附着基质(10c)、中心垂直旋转轴；和多个水平排列的分离刀(11b)；其中附着基质(10c)由多个水平的根支持盘构成，且并且其中所述根支持盘以≥7cm的规则距离隔开，并且其中分离刀(11b)水平安装在垂直旋转轴上，因此一个分离刀(11b)位于距每个根支持盘0.05-5mm的距离处，并且其中分离刀(11b)的数目等于或大于根支持盘的数目。在一个实施方案中，根支持盘具有30-360°，优选地45-320°，更优选地60-270°的圆形扇区的面积。根支持盘的开放部分越大，培养基可以在根支持盘周围和之间循环得越好。分离刀(11b)的高度是相邻根支持盘之间距离的高达10％、高达20％、高达30％、高达40％、高达50％、高达60％、高达70％、高达80％、高达90％或高达100％。优选地，分离刀(11b)的高度是相邻根支持盘之间距离的高达100％。附接基质(10c)的中央垂直旋转轴、分离刀(11b)和根支持盘由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的这些组分可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。多个根盘是格或不锈钢穿孔板，格和/或板中的孔充当培养物根的附着点。优选地，多个根支持盘是网格。更优选地，网格大小是2x2mm至50x50mm，例如2x2mm、3x3mm、4x4mm、5x5mm、6x6mm、7x7mm、8x8mm、9x9mm、10x10mm、11x11mm、12x12mm、13x13mm、14x14mm、15x15mm、16x16mm、17x17mm、18x18mm、19x19mm、20x20 mm、21x21mm、22x22mm、23x23mm、24x24mm、25x25mm、26x26mm、27x27mm、28x28mm、29x29mm、30x30mm、31x31mm、32x32mm、33x33mm、34x34mm、35x35mm、36x36mm、37x37mm、38x38mm、39x39mm、40x40mm、41x41mm、42x42mm、43x43mm、44x44mm、45x45mm、46x46mm、47x47mm、48x48mm、49x49mm、或50x50mm。最优选的网格大小将取决于接种培养物的根片段的平均大小。当使用该实施方案的生物反应器时，通过利用在根支持盘上方旋转的分离刀片(11b)施加的剪切力来完成生产和无菌收获根的方法的分离步骤。具体地，接种物的根将附着在附着基质(10c)的根支持盘的附着点处，并在培养步骤期间开始生长。一旦在培养物中达到合适的根材料密度，就旋转分离刀(11b)，并剪掉在根支持盘顶部生长的根。若分离刀(11b)的高度接近或者是相邻根支持盘之间的距离的100％，则旋转分离刀还将剪切下一个较高支持盘下方生长的根。从根支持盘上方和下方分离的根然后通过重力沉降在生物反应器底部。当使用本实施方案的生物反应器时，生产和无菌收获根的方法可包括在整个培养步骤中通过使用气体喷雾器(7)以0.2-50sL/L/h对根器官培养物充气来诱导培养基的连续运动。用具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2组成的灭菌空气进行充气。
在一个优选的实施方案中，上述实施方案的生物反应器(见图5)可以进一步包含圆柱形的引流管(14)，其中水平根支持盘安装在圆柱形引流管(14)的内部。引流管由圆柱体组成，所述圆柱体在其顶端和底端完全开放。引流管(14)由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，本发明的引流管(14)可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。若根器官培养是浸没培养，则优选地，在培养期间将引流管完全浸没在培养基中，以改善培养物中生物量的分布均匀性并增加可收获的总生物量的百分比。在该实施方案中，气体喷雾器(7)由两个独立可用的喷射元件组成，其中之一(7a)位于所述引流管的中心下方，并且其中另一个(7b)是位于所述培养室的下半部中的所述引流管下方或外部的环形喷雾器。当使用该实施方案的生物反应器时，生产和无菌收获根的方法包括在整个培养步骤中通过使用气体喷雾器(7a)以0.2-50sL/L/h对根器官培养物充气来诱导培养基的连续运动。用具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2组成的灭菌空气进行充气。
在本发明的所有生物反应器以及生产和无菌收获根的方法中，一旦培养物的根在生物反应器的底部沉降，通过以1-50m/s的顶部速度旋转快速可旋转刀(6)或通过运行转子定子(6)来完成切割步骤。切割步骤在0-35℃的温度进行。优选地，切割步骤在冷却条件下，即在0-20℃的温度下进行，以减少对根材料的损害和存活力丧失。要收获的切割的根块可具有2-30mm的大小。
在本发明的所有生物反应器以及生产和无菌收获根的方法中，使用蠕动泵或螺旋输送机或通过用生长培养基冲洗来完成取出步骤。
本发明进一步提供了用于接种、培养和收获根器官培养物的装置，其包括本发明的第一生物反应器和本发明的至少一个另外的生物反应器，其中所述第一生物反应器连接至所述至少一个另外的生物反应器。装置可以是例如种子列。
本发明的上述装置可用于产生根的方法中，包括从活的根生物量制备用于根器官培养的接种物的方法，其包括以下步骤：
1)在无菌环境中通过接种口(1)将活的根生物量引入装置的第一生物反应器中；
2)任选地在生长培养基的存在下培养引入的根生物量
3)任选地用第一生物反应器的快速可旋转刀或转子定子(6)切割根生物量，
任选地，其中切割步骤是在0-35℃的温度进行的，
4)使用第一生物反应器的收获口(5)和至少一个另外的生物反应器的接种口(1)将切割的接种物从第一生物反应器转移到至少一个另外的生物反应器，
任选地，其中转移步骤通过无菌连接器发生，其中无菌连接器提供最小的流动限制和/或其中连接器施加流动路径的最小横截面减小，任选地其中方法还包括通过将生长培养基从至少一个另外的生物反应器再循环到第一生物反应器冲洗第一生物反应器的步骤。
其中步骤2和3在第一生物反应器内进行，并且其中步骤2至4不需要无菌环境；
接着是本发明的生产和无菌收获根的方法；
其中第一生物反应器和至少一个另外的生物反应器包含在上述装置中。
最后，本发明还提供了装置，该装置包括如上所述的接种容器和本发明的生物反应器两者，它们是连接的。该连接可以包括装配到接种容器的3-5个出口之一的无菌连接器、装配到生物反应器的接种口(15)的无菌连接器和附接到这些无菌连接器的管或导管，其中无菌连接器、管和/或导管施加最小的流动限制和/或施加流体路径的最小横截面减小，并且具有10mm的最小内径。无菌连接器和导管由金属制成，优选地由钢制成，最优选地由奥氏体不锈钢，例如“WNr.1.4404(X2CrNiMo17-12-2),AISI 316L,(A4L)”制成。有利地，装置的无菌连接器和导管可以通过高压灭菌进行灭菌，并且由于含有氯化物的清洗介质或生长培养基中的氯化物而具有高的耐腐蚀性。管由硅树脂制成，并且具有10mm的最小内径。有利地，硅树脂管将不含可浸出物，可由于高温耐久性而进行高压灭菌，并具有良好的机械稳定性和弹性，这在将它们连接到例如蠕动泵时是重要的。
本发明的上述装置可以用于生产发根的方法，该方法包括如上所述的制备接种物的方法，然后是生产和无菌收获本发明的根的方法。
本发明还提供了以下实施方案：
1.用于从活发根生物量制备用于发根培养物的接种物的接种容器，其包含：
接种室(21)；
刀(16)，其中所述刀(16)是可旋转搅拌器叶片结构或刀式研磨机结构的一部分，并且其中所述刀(16)位于所述室内；
自所述室的3-5个出口，其中所述出口用于发根生物量入口(15)、接种物出口(17)、通气、培养基入口和培养基出口，并且其中所述出口的内径≥10mm。
2.实施方案1的接种容器，其中所述3-5个出口用于尽可能少的发根生物量入口(15)、接种物出口(17)、通气、培养基入口和培养基出口。
3.实施方案1或2的接种容器，其中所述3-5个出口中的至少一个可以装有无菌螺帽或无菌旋转密封件，并且其中剩余的出口可装有没有流动限制的无菌连接器，且其中所述无菌连接器可以连接到管。
4.前述实施方案中任一项的接种容器，其中用于接种物出口和/或培养基出口(17)的出口位于所述接种容器的底部。
5.前述实施方案中任一项的接种容器，其中所述接种室(17)体积为0.2-50L，优选为0.2-2L。
6.用于从活的发根生物量制备用于发根培养的接种物的方法，其包括以下步骤：
1)在无菌环境中通过所述3-5个出口之一将活发根生物量引入实施方案1-5中任一项的接种容器中；
2)用所述接种容器的刀(16)切割所述发根生物量；
3)任选地使用用于培养基入口和培养基出口的所述接种容器的3-5个出口中的一个或多个，用清洗介质清洗切割的发根生物量；和
4)使用用于接种物出口的3-5个出口(17)之一，将切割的，任选清洗的接种物从接种容器转移至生物反应器；
其中步骤2和3在接种容器内进行，并且其中步骤2至4不需要无菌环境。
7.实施方案6的方法，其中所述切割如下进行：
以1-50m/s的尖端速度旋转可旋转搅拌器叶片结构的刀(16)，或者
旋转刀式研磨机结构的刀(16)以施加剪切力。
8.实施方案6或7的方法，其中所述切割步骤在0-20℃的温度进行。
9.实施方案6至8中任一项的方法，其中所述清洗介质选自盐溶液、生长培养基和缓冲溶液的组。
10.实施方案6-9中任一项的方法，其中将所述清洗介质添加到所述接种容器以通过所述3-5个出口之一重悬所述切割的发根生物量，并且其中通过3-5个出口之一从所述接种培养基中除去所述清洗介质。
11.实施方案10的方法，其中通过倾倒、泵送、重力或施加超压来进行所述清洗介质的除去。
12.实施方案6-11中的任一项的方法，其中所述转移步骤通过无菌连接器发生，其中所述无菌连接器提供最小的流动限制和/或其中所述连接器施加最小的流动路径横截面减小。
13.实施方案6-12中任一项的方法，其中所述方法进一步包含通过将生长培养基从生物反应器再循环到接种容器来冲洗接种容器的步骤。
14.用于培养发根培养物的生物反应器，其包含：
培养室(2)；
位于所述生物反应器底部的快速可旋转刀或转子定子(6)；
接种口(1)，其中所述接种口(1)的内径≥10mm；
收获口(5)，其中所述收获口(5)的内径≥10mm，并且其中所述收获口(5)位于所述生物反应器的底部；和
两个通风出口(3、4)，其中一个通风出口用于气体入口，并且另一个通风出口用于气体出口。
15.实施方案14的生物反应器，还包括1至4个用于汲取管(8)的出口，其中所述1至4个汲取管用于碱添加、进料添加、酸添加和/或取样。
16.实施方案14或15的生物反应器，还包括1至3个用于探针(9)的端口，其中所述探针用于测量pH、溶解氧和/或电导率。
17.实施方案14-16中任一项的生物反应器，其中所述培养室(2)的体积为1-100000L。
18.实施方案14-17中任一项的生物反应器，其还包含
附着基质(10a)；
可旋转的附着基质架(12)；
用于根分离的垂直剪切刀片(11a)；和
用于所述剪切刀片(13)的支持环；
其中所述附着基质(10a)上的附着点垂直排列，并且其中所述附着基质(10a)在所述可旋转的附着基质架(12)上可垂直旋转，并且所述垂直剪切刀片(11a)是静止的。
19.实施方案14-17中任一项的生物反应器，其中所述生物反应器不包含附着基质。
20.实施方案14-17中任一项的生物反应器，其还包含
附着基质(10b)，
其中所述附着基质(10b)由珠组成，所述珠包含多糖和生长培养基。
21.实施方案20的生物反应器，其中所述多糖选自藻酸盐、琼脂糖和胶凝糖。
22.实施方案20或21的生物反应器，其中所述珠具有1-5mm的直径。
23.实施方案14-17中任一项的生物反应器，其还包含
附着基质(10c)；
中央垂直旋转轴；和
多个水平排列的分离刀(11b)；
其中所述附着基质(10c)由多个水平的根支持盘构成，并且其中所述根支持盘以≥10cm的规则距离隔开，并且其中所述分离刀(11b)水平安装在所述垂直旋转轴上，使得一个分离刀(11b)位于距每个根支持盘的0.05-5mm的距离处，并且其中分离刀(11b)的数目等于或大于根支持盘的数目。
24.实施方案23的生物反应器，其中所述多个根盘是不锈钢网格或不锈钢穿孔板。
25.权利要求23或24的生物反应器，进一步包含
圆柱形引流管(14)
其中所述水平根支持盘安装在所述圆柱形引流管(14)的内部，其中所述圆柱形引流管(14)由在其顶端和底端完全开放的圆柱体组成，并且其中所述气体喷雾器(7)由一个喷射元件组成，任选地由两个独立可用的喷射元件组成，其中之一(7a)位于所述引流管的中心下方，并且其中另一个(7b)是位于所述引流管的底部开口外部和上方的环形喷雾器。
26.生产和无菌收获发根的方法，包括以下步骤：
1)在实施方案14-25中任一项的生物反应器内的生长培养基中培养发根培养物；
2)任选地将所述根器官培养物的根与所述生物反应器内部的附着基质分离；
3)任选地让所述根沉降；
4)使用所述生物反应器底部的所述快速可旋转刀或所述转子定子(6)切割所述生物反应器内部的所述根；并且
5)使用所述收获口(5)取出切割的根；
其中步骤1-4在生物反应器内部进行，并且其中步骤1-5不需要无菌环境。
27.实施方案26的方法，其中所述培养步骤进行1-12周。
28.实施方案26的方法，其中所述生物反应器是实施方案18的生物反应器，并且其中所述分离步骤通过使用由旋转基质上的剪切刀片(11a)施加的剪切力来完成。
29.实施方案26的方法，其中所述生物反应器是实施方案19-22中任一项的生物反应器，其中所述培养步骤包括通过在整个培养步骤中以0.2-50sL/L/h对发根器官培养物充气来诱导湍流。
30.实施方案29的方法，其中用具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2的组成的无菌空气进行所述充气。
31.实施方案26的方法，其中所述生物反应器是实施方案20-22中任一项的生物反应器，并且其中所述分离步骤通过溶解所述附着基质(10b)珠来完成。
32.实施方案31的方法，其中通过添加柠檬酸或多糖裂解酶来溶解所述附着基质(10b)珠。
33.实施方案32的方法，其中柠檬酸是10mM的pH5-6的柠檬酸。
34.实施方案33的方法，其中所述多糖切割酶选自藻酸盐裂合酶、胶凝糖裂合酶和β-琼脂酶。
35.实施方案26的方法，其中所述生物反应器是根据实施方案23至25中任一项的生物反应器，其中所述分离步骤通过利用由在所述根支持盘上方旋转的分离刀片(11b)施加的剪切力来完成。
36.实施方案26-35中任一项的方法，其中切割步骤通过在生物反应器底部以1-50m/s的尖端速度旋转快速可旋转刀(6)或旋转转子定子(6)来完成。
37.实施方案26-36中任一项的方法，其中所述切割步骤在0-20℃的温度进行。
38.实施方案26-37中任一项的方法，其中使用蠕动泵或螺旋输送器或通过用生长培养基冲洗来完成所述取出步骤。
39.用于接种、培养和收获发根培养物的装置，其包含实施方案1-5中任一项的接种容器和实施方案14-25中任一项的生物反应器，其中所述接种容器连接至所述生物反应器。
40.生产发根的方法，其包括制备实施方案6-13中任一项的接种物的方法，随后是实施方案26-38中任一项的生产和无菌收获的方法，并且其中接种容器和生物反应器包含在实施方案39的装置中。
尽管已经在附图和前面的描述中详细显示和描述了本发明，但是此类显示和描述应应当认为是说明性或示例性的而不是限制性的。本发明不限于所公开的实施方案。通过研究附图、公开内容和从属权利要求，本领域技术人员在实践要求保护的发明时可以理解和实现所公开的实施方案的其他变型。
详细描述本质上仅是示例性的，并不旨在限制应用和使用。下列实施例进一步说明了本发明，然而，本发明的范围不限于此。基于本发明的描述，本领域技术人员可以做出各种改变和修改，并且这些改变和修改也包括在本发明中。
实施例
1.制备实验室规模的发根或不定根接种物
图6显示了用于制备3L发根或不定根接种物的实验室规模接种容器原型和用接种物接种生物反应器，其通过使用一个容器以进行切割，任选地清洗和转移发根或不定根接种物的组合过程步骤来进行。
通过顶端开口(15)将未切割的发根或不定根培养物转移到接种容器中。接种容器随后配备有顶部安装的旋转密封件(20)，该密封件充当可旋转刀(16)的搅拌器轴的轴承。可以使用旋转泵和培养基转移管(22)通过培养基入口(18)将培养基、盐溶液或无菌水添加到烧瓶中。为了清洗的目的，出口管(23)可用于倾析培养基，并通过培养基入口(18)用新鲜培养基重悬发根或不定根。无菌过滤器(24)用于无菌压力补偿的目的，以避免由于将培养基泵入烧瓶而引起的过压。在切割并清洗发根或不定根材料后，连接到接种物出口(17)的出口管(23)通过无菌连接器(25)进一步连接到要接种的生物反应器，所述无菌连接器(25)施加最小的流动路径限制。因此，生物反应器接种口必须配备有相同类型的无菌连接器。为了进行接种，利用重力将悬浮在培养基中的切割且清洗的接种物转移到反应器中。为了便于处理，可通过无菌过滤器(24)供给压缩空气。可以用来自反应器的新鲜培养基重新填充容器，通过培养基入口端口(18)泵入容器中，以重悬浮和冲洗剩余的发根或不定根。通常在2-4个再填充/冲洗循环后完成转移。
详细地，通过使用本生灯对镊子在其整个长度上进行灭菌，并使用顶部开口(15)，用无菌镊子将发根或不定根预培养物从预培养摇瓶转移到接种容器中以在层流下将接种容器加载。接下来，组装搅拌器轴/可旋转刀轴承(16)并***顶部安装的旋转密封件(20)中，测试紧密配合。现在不再需要层流或其他无菌环境。通过为接种容器配备搅拌器轴并驱动器并以2500rpm旋转可旋转刀(16)30秒钟来实现均质化。为了用新鲜的清洗介质清洗培养物，使用培养基转移管(22)和蠕动泵将新鲜的高压灭菌的清洗介质泵入接种容器中。然后通过使用连接到出口管(23)的接种物出口(17)将清洗介质倒出接种容器，从而倾倒发根或不定根。然后将出口管(23)盖上无菌铝箔。为了转移培养物，将培养基转移管(22)连接至生物反应器并安装在蠕动泵上。接下来，将无菌插头连接(25)连接到生物反应器的接种口。然后使用蠕动泵将切割且清洗的根重悬于来自反应器的300ml生长培养基中。然后，停止泵，并通过倾斜接种容器，通过接种物出口(17)、出口管(23)和无菌插头连接(25)将切割的根接种物倒入反应器中。然后，在根段仍然在接种容器中的情况下，用来自生物反应器的新鲜生长培养基填充接种容器。根据需要，经常重复进行最后两个步骤，以将接种物的发根或不定根段完全转移到生物反应器中。然后，将所有管(22、23和通向24的管)都捏掉，并将接种容器与生物反应器断开。
2.手动切割后测定发根的存活力和生长
已经显示切割发根导致生长抑制(Krombholz et al.,Planta Medica 58(34):328-333,1August 1992)。然而，切割，特别是机械切割，极大地改善接种的容易程度和效率，以及根器官培养物，特别是可缩放根器官培养物的收获。因此，发明人设计了一项研究，以测定发根是否可以容忍切成一定片段大小的切割，并且若如此的话，发根的最小活片段长度是多少。
为此目的，将发根培养物手动切成2mm或12mm长的片段，然后在填充有固化培养基的培养皿上培养这些片段。在固化培养基上的培养允许监测整个培养长度中的每个片段。片段根据从其在最初培养物中获得的较大的前代发根内的起源分为芽尖端和中间片段。例如，可将20mm的前代根切成2个芽尖片段(对应于涵盖前代根尖端的那些片段)和8个中段，大小各为2mm。在固化培养基上培养12天后，以及在固化培养基上培养20天后第二次，手动评估片段的长度。
图7显示了这项研究的结果，图7A、C和E描绘了芽尖的生长，并且图7B，D和F描绘了中片段的生长。无论前代根内片段的起源如何，12mm片段的平均生长速率大于2mm片段的平均生长速率(见图7A，B)。此外，2mm块的存活力的范围仅为6％至12％，而12mm块的存活力的范围为60％至75％(见图7C，D)。值得注意的是，12mm中片段的各片段(图7D)具有最高的活片段比例(73-75％)。因此，将发根片段切成2mm实质性损害它们的存活力，而将它们切成12mm的块保留足够量的活片段。
出人意料的是，对2mm的活片段观察到最高生长速率(见图7E，F)，然而，当切成片段至2mm大小时获得的大量死生物量导致将发根生物量切成2mm或以下长度的片段，其不适合实现高生物量生产力(确认先前的观察结果，即切割导致发根的生长受损)，这是因为在液体培养中和/或通过自动切割，无法对活片段进行分选是可能的，并且因为对于大规模固体培养物，投入大量精力进行手动切割和分选是不可行的。然而，重要的是，切成较大的片段，例如12mm及以上，产生适合于液体培养接种到任何规模的生物反应器中的发根生物量。
3.根据各种自动切割方案测定发根片段的长度
在实施例2中测定切割发根片段的最小可行长度后，发明人着手测定在接种容器或生物反应器中使用快速可旋转刀或转子定子均质器的自动切割方案，其将通过在无菌环境中进行上述手动切割以改善可缩放性、容易程度和效率。具体而言，发明人试图测定是否并且如何可以使用自动切割装置(例如快速可旋转刀或转子定子均质器)将发根切成片段以达到长度在2mm以上的片段。
实验装置对应于图6，即包含快速可旋转刀均质器的接种容器(见图6)，在其中填充有悬浮在200ml生长培养基中的5g鲜重(FW)的发根块等分试样。在进行预实验以建立用于这些发根团的片段化的最小功率之后，在三重均质化，即0.0008kWh/g、0.0016kWh/g和0.003kWh/g中测试三种不同的均质化方案，以它们的总功率输入(例如均质化时间)区分。分析这些均质化方案的所得的片段大小，并评估片段大小分布。因为2mm长度或以下的片段由于片段的较高数目而无法通过手动计数可靠定量，所以还测量均质化后液相的光密度(OD)。在600nm处的该OD测量值用来估计悬浮液中释放的细胞和/或小颗粒的量，即，充当由于均质化而遭受的根的组织损伤的估计值。OD越高，已经从根生物量分离并且进入悬浮液中的小组织颗粒和/或细胞越多。认为这些小组织颗粒和/或释放的细胞不是适合于根器官培养接种的活生物量。因此，较高的OD值意味着受损的培养物生长。
对于所有均质化方案均成功实现片段化，并且尽管发根团的不同质性质，获得的片段大小分布是高度可重现的(见图3A-C)。较低的总能量输入方案导致较大的片段大小(见图3A-C)和较低的光密度(见图3D)，这意味着较小的组织损伤量以及较高的根存活力。当将功率输入增加到方案2的功率输入之上时，没有观察到大小的进一步减小(将图3B与图3C进行比较)，但是上清液的光密度确实增加(见图3D)，表明获得的片段的进一步降低的存活力。
因此，最低的能量输入均质化方案(总能量输入<8*10^-4kWh/g BM FW)导致适合于发根培养物接种/收获的活发根片段，这证明根器官培养之前、期间或之后的机械均质化对于发根培养是可行的。
4.比较本发明的不同生物反应器与常规生物反应器
将本发明的生物反应器与标准生物反应器进行比较，以评估总生物量产率和有效生物量产率的改善，即在不使用无菌环境来防止生物量的污染的情况下通过自动化可收获的生物量产率。
测试了六个不同的生物反应器(关于6个生物反应器的内部元件的示意图，见图9)，其中设置1是标准生物反应器，并且设置2-6是本发明的生物反应器。所有生物反应器具有3L的工作容积，并且特征在于培养室、内径为10mm的接种口；位于生物反应器底部的内径为10mm的收获口(5)和两个通风出口。设置2-6特征还在于位于生物反应器底部的快速可旋转刀或转子定子。
设置2特征还在于附着基质和浸没管，其在浸入端处具有烧结的金属喷雾器熔块。附着基质由管状钢网孔(316L不锈钢，穿孔：Rv 4-6DIN 24041)组成。附着基质圆柱体的高度为450mm，并且直径为65mm。用螺钉将其放置在生物反应器的底部，其与所述螺钉同心地附着为与生物反应器壁的间隔物(It was placed on the bottom of the bioreactorwith screws concentrically attached as spacers from the bioreactor wall)。通过浸没管和烧结金属喷雾器熔块从附着基质圆柱体的底侧引入空气。
设置3特征在于没有附着基质，但具有培养过程中延伸到培养基水平之上的引流管。引流管将发根片段与所有另外的生物反应器***物(例如浸没管、喷射熔块等)分开。引流管的目的是在主培养室内模拟单独的培养室，其中其他反应器***物不能干扰发根生物量。引流管由聚碳酸酯管(PC)组成(高度：450mm，外径：70mm，壁厚：3mm)，带有三排钻孔(距顶端200mm)和覆盖孔的钢网孔(50μm网孔大小)。钻孔用于从引流管内部的培养体积到位于引流管外部的另外的生物反应器***物的培养基循环。网孔大小不允许根片段通过钻孔或附着在钻孔上。因此，设置3不含附着基质。将管放置在反应器底部，达到液位以上。通过烧结的金属喷雾器熔块经由中央出口从容器底部引入空气。
设置4的特征在于在培养过程中延伸到培养基水平上方的引流管、由将引流管内的空间分成四个室的三个水平根支持盘组成的附着基质和在反应器底部的烧结金属喷射器熔块。三个根支持盘彼此等距分隔，并由穿孔钢板组成(不锈钢316L，64x64mm，厚度：1.5mm，网孔大小：5x5mm)。它们通过引流管中的缝隙安装，所述缝隙在其它方面与设置3中一样构建。根支持盘延伸贯穿引流管的整个直径，从而形成根片段附着的平台和表面。如设置3中一样将引流管放置在生物反应器底部上，超过液位的顶部。因此，引流管内的空间被分成四个大小相等的室，其用来将生物量更均匀地分布在培养体积上。从生物反应器底部的中央烧结金属喷雾器供应空气。对于此设置，进行了3个重复实验。
设置5的特征在于在培养过程中完全浸没在培养基中的引流管、由将引流管内的空间分成四个室的三个水平根支持盘组成的附着基质、三个水平安装在中央垂直旋转轴上的分离刀和反应器底部的烧结金属喷射器熔块。附着基质的引流管和根支持盘的构造如设置4中一样构建，不同之处在于引流管在培养过程中不延伸到培养基水平以上。既在接种过程中使用分离刀以改善由于其旋转引起的生物量分布，又在培养结束时使用分离刀以从根支持盘分离根。
设置6的特征在于在培养过程中完全浸没在培养基中的引流管、由将引流管内的空间分成四个室的三个水平根支持盘组成的附着基质、三个水平安装在中央垂直旋转轴上的分离刀和由两个喷射元件组成的喷雾器，其中一个是位于引流管中央下方的中央熔块，并且其中一个是位于喷射熔块上方且位于引流管底端下方的环喷雾器。通过经由环喷雾器充气，在生物反应器中实现了不同的流动模式，从而增加整个培养物中生物量的分布。引流管、附着基质的根支持盘和分离刀与设置5相同，只是引流管中缺乏钻孔。对于此设置，进行了3个重复实验。
用300ml接种物接种培养物并培养15-42天，该接种物包含8-20g鲜重的生物量，该生物量由切割的发根片段组成。在生物反应器含有喷雾器的情况下，接种和培养期间的空气流动速率设置为10-15sL/h。
在培养结束时，以克计测量最终生物量鲜重和在培养过程中代谢的总蔗糖。此外，将最终生物量鲜重分为可收获和不可收获生物量。附着到附着基质的生物量和悬浮液中的生物量被(机械地)认为是可收获的生物量，而附着于附着基质以外的反应器内置组件，例如喷雾器，壁等的生物质被认为不是可收获的，因为必须开放生物反应器以进行手动收获，这需要无菌环境。生物量产率，即总最终生物量(鲜重；以克计)除以代谢蔗糖(以克计)在生物反应器之间存在变化，设置1和4显示最高产率(见图10A，黑条)。相反，对于装置1(标准生物反应器)，可机械收获的生物量为零，并且对于本发明的生物反应器，在总生物量产率的20-100％之间变化(见图10A，灰色线)。就可收获生物量而言，设置5和6尤其有利，两者均实现了总产率的100％的机械收获。
最后，通过将总生物量产率和可收获生物量百分比相乘来计算有效生物量产率，即机械可收获的生物量产率(鲜重)除以代谢的蔗糖。与设置1的标准生物反应器相比，根据本发明的所有生物反应器显示更高的有效生物量产率，其中设置4-6是最有效的(见图10B)。
Claims (39)
1.用于培养发根的生物反应器，其包含：
培养室(2)；
位于所述生物反应器底部的转子定子；
接种口(1)，其中所述接种口(1)的内径≥10mm；
收获口(5)，其中所述收获口(5)的内径≥10mm，并且其中所述收获口(5)位于所述生物反应器的底部；和
两个通风出口(3、4)，其中一个通风出口用于气体入口，并且另一个通风出口用于气体出口。
2.权利要求1的生物反应器，其还包含
气体喷雾器(agas sparger)(7)，其中所述用于气体入口的一个通风出口连接到所述气体喷雾器(7)，
1至4个用于汲取管的出口(8)(one to fouroutlets fordip tubes(8))，其中所述1至4个汲取管用于碱添加、进料添加、酸添加和/或取样，和/或
1至3个用于探针的端口(9)(one to threeports forprobes(9))，其中所述探针用于测量pH、溶解氧和/或电导率。
3.权利要求1或2的生物反应器，其中所述培养室(2)的体积为1-100000L。
4.权利要求1或2的生物反应器，其还包含
附着基质(10a)；
可旋转的附着基质架(12)；
用于根分离的垂直剪切刀片(11a)；和
用于所述剪切刀片的支持环(13)；
其中所述附着基质(10a)上的附着点垂直排列，并且其中所述附着基质(10a)在所述可旋转的附着基质架(12)上可垂直旋转，并且所述垂直剪切刀片(11a)是静止的。
5.权利要求1或2的生物反应器，其中所述生物反应器不包含附着基质。
6.权利要求1或2的生物反应器，其还包含
附着基质(10b)，
其中所述附着基质(10b)由珠构成，所述珠包含多糖和生长培养基。
7.权利要求6的生物反应器，其中所述多糖选自下组：藻酸盐、琼脂糖和胶凝糖，和/或其中所述珠具有1-5mm的直径。
8.权利要求1或2的生物反应器，其进一步包含
附着基质(10c)；
中央垂直旋转轴；
多个水平排列的分离刀(11b)；
其中所述附着基质(10c)由多个水平的根支持盘构成，并且其中所述根支持盘以≥10cm的规则距离隔开，并且其中所述分离刀(11b)水平安装在所述垂直旋转轴上，使得一个分离刀(11b)位于距每个根支持盘的0.05-5mm的距离，并且其中分离刀(11b)的数目等于或大于根支持盘的数目。
9.权利要求8的生物反应器，其中所述多个根支持盘是不锈钢网格或不锈钢穿孔板。
10.权利要求8的生物反应器，其进一步包含
圆柱形引流管(14)
其中所述水平根支持盘安装在所述圆柱形引流管(14)的内部，其中所述圆柱形引流管(14)由在其顶端和底端完全开放的圆柱体组成，并且其中所述生物反应器的气体喷雾器(7)由一个喷射元件组成或由两个独立可用的喷射元件组成，其中之一(7a)位于所述引流管的中心下方，并且其中另一个(7b)是位于所述培养室的底部半部中的所述引流管下方或外部的环形喷雾器。
11.生产和无菌收获发根的方法，其包括以下步骤：
1)在权利要求1-10中任一项的生物反应器内部的生长培养基中培养发根培养物；
2)使用所述生物反应器底部的所述转子定子切割所述生物反应器内部的所述发根；并且
3)使用所述收获口(5)以取出切割的发根；
其中在所述生物反应器内部进行步骤1-2，并且其中步骤1-3不需要无菌环境。
12.权利要求11的方法，其进一步包括以下的步骤：
1.1)将所述发根培养物的发根与所述生物反应器内部的附着基质分离；和
1.2)让所述发根沉降；
其中步骤1.1)和1.2)在步骤1)之后且步骤2)之前在所述生物反应器内部进行且不需要无菌环境。
13.权利要求11或12的方法，其中将步骤1)进行1-12周。
14.权利要求12的方法，其中所述生物反应器是权利要求4的生物反应器，并且其中通过使用由旋转基质上的所述剪切刀片(11a)施加的剪切力来完成步骤1.1)。
15.权利要求11或12的方法，其中所述生物反应器是权利要求5-10中任一项的生物反应器，其中步骤1)包括通过在整个步骤1)中以0.2-50sL/L/h对所述发根培养物充气来诱导培养基运动，其中通过气体喷雾器(7)进行充气。
16.权利要求15的方法，其中用无菌空气进行充气，所述无菌空气具有21-30％O2、0.04-2％CO2和68-78.96％N2的组成。
17.权利要求12的方法，其中所述生物反应器是权利要求6的生物反应器，并且其中通过溶解所述附着基质(10b)珠来完成步骤1.1)。
18.权利要求17的方法，其中通过添加柠檬酸或多糖裂合酶溶解所述附着基质(10b)珠。
19.权利要求18的方法，其中所述柠檬酸是pH 5-6的10mM柠檬酸。
20.权利要求18的方法，其中所述多糖裂合酶选自下组：藻酸盐裂合酶、胶凝糖裂合酶和β-琼脂糖酶。
21.权利要求12的方法，其中所述生物反应器是权利要求8的生物反应器，其中通过使用由所述根支持盘上方旋转的所述分离刀(11b)施加的剪切力来完成步骤1.1)。
22.权利要求11或12的方法，其中通过旋转在所述生物反应器底部的所述转子定子来完成所述步骤2)。
23.权利要求22的方法，其中在0-35℃的温度进行所述步骤2)，和/或其中使用蠕动泵、切碎机泵或螺旋输送机或通过用生长培养基冲洗来完成所述步骤3)。
24.用于接种、培养和收获发根培养物的装置，其包含
第一生物反应器，其中所述第一生物反应器为权利要求1-10中任一项的生物反应器，和
至少一个另外的生物反应器，其中所述至少一个另外的生物反应器为权利要求1-10中任一项的生物反应器，其中所述第一生物反应器连接到所述至少一个另外的生物反应器。
25.用于接种、培养和收获发根培养物的装置，其包含
用于从活的发根生物质(biomass)制备用于发根培养物的接种物的接种容器，其包含：
接种室(21)；
刀(16)，其中所述刀(16)是可旋转的搅拌器叶片结构或刀式研磨机结构的一部分，并且其中所述刀(16)位于所述接种室(21)内；
自所述室的3-5个出口，其中所述出口用于根生物质入口(15)、接种物出口(17)、通风、培养基入口和培养基出口，和
权利要求1-10中任一项的生物反应器，其中所述接种容器与所述生物反应器连接。
26.权利要求25的装置，其中所述3-5个出口用于尽可能少的根生物质入口、接种物出口、通风、培养基入口和培养基出口，并且其中所述出口的内径≥10mm，和/或
其中所述3-5个出口中的至少一个可以装有无菌螺帽或无菌旋转密封件(20)，并且其中剩余出口可以装有无流动限制的无菌连接器，并且其中所述无菌连接器可以连接到管，和/或
其中用于接种物出口(17)和/或培养基出口的出口位于所述接种容器的底部，和/或
其中所述接种室(21)的体积为0.2-50L。
27.权利要求26的装置，其中所述接种室(21)为0.2-2L。
28.生产发根的方法，其包括
从活的发根生物质制备用于发根培养物的接种物的方法，其包括以下步骤：
1)在无菌环境中通过所述接种口(1)将活的发根生物质引入权利要求24的装置的第一生物反应器中；
2)使用所述第一生物反应器的收获口(5)和权利要求24的装置的至少一个另外的生物反应器的接种口(1)将切割的接种物从所述第一生物反应器转移到所述至少一个另外的生物反应器，
其中步骤2不需要无菌环境；
接着，使用所述至少一个另外的生物反应器进行权利要求11-23中任一项的生产和无菌收获发根的方法。
29.权利要求28的方法，其中所述从活的发根生物质制备用于发根培养物的接种物的方法进一步包括以下步骤：
1.1)在生长培养基的存在下培养引入的发根生物质，
1.2)用所述第一生物反应器的转子定子(6)切割所述发根生物质，
其中步骤1.1和1.2在步骤1之后且步骤2之前在所述第一生物反应器内部进行且不需要无菌环境。
30.权利要求29的方法，其中在0-35℃的温度进行步骤1.2。
31.权利要求28-30中任一项的方法，其中步骤2通过无菌连接器发生，其中所述无菌连接器提供最小的流动限制和/或其中所述无菌连接器施加流动路径的最小横截面减小。
32.权利要求31的方法，其中所述从活的发根生物质制备用于发根培养物的接种物的方法进一步包括通过将生长培养基从所述至少一个另外的生物反应器再循环到所述第一生物反应器来冲洗所述第一生物反应器的步骤。
33.生产发根的方法，其包括
从活的发根生物质制备用于发根培养物的接种物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在无菌环境中通过权利要求25-27中任一项的装置的3-5个出口之一将活的发根生物质引入权利要求25-27中任一项的装置的接种容器中；
2)用所述接种容器的刀(16)切割所述发根生物质，和
3)使用用于接种物出口(17)的3-5个出口之一，将切割的接种物从所述接种容器转移到生物反应器，
其中在所述接种容器内部进行步骤2，并且其中步骤2至3不需要无菌环境；
接着，进行权利要求11-23中任一项的生产和无菌收获发根的方法；
其中所述接种容器和生物反应器包含在权利要求25-27中任一项的装置中。
34.权利要求33的方法，其中在步骤2中
通过以1-50m/s的尖端速度旋转可旋转搅拌器叶片结构的刀(16)，或旋转刀式研磨机结构的刀以施加剪切力进行切割，和/或
在0-35℃的温度进行所述切割。
35.权利要求33或34的方法，其中所述从活的发根生物质制备用于发根培养物的接种物的方法进一步包括以下步骤：
2.1)使用用于培养基入口和培养基出口的所述接种容器的3-5个出口中的一个或多个用清洗介质来清洗所述切割的发根生物质，
其中步骤2.1在步骤2之后且步骤3之前在所述接种容器内部进行且不需要无菌环境。
36.权利要求35的方法，其中将所述清洗介质添加到所述接种容器以通过所述3-5个出口之一重悬所述切割的发根生物质，并且通过所述3-5个出口之一从接种培养基中除去所述清洗介质。
37.权利要求36的方法，其中所述清洗介质的除去通过倾倒、泵送、重力或施加超压发生，和/或所述清洗介质选自下组：盐溶液、生长培养基和缓冲溶液。
38.权利要求33或34的方法，其中步骤3通过无菌连接器发生，其中所述无菌连接器提供最小的流动限制和/或其中所述无菌连接器施加流动路径的最小横截面减小。
39.权利要求38的方法，其中所述从活的发根生物质制备用于发根培养物的接种物的方法进一步包括通过将生长培养基从所述生物反应器再循环到所述接种容器以冲洗所述接种容器的步骤。
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