BR112020012546B1 - Biorreator para o cultivo de culturas de raízes em cabeleira, e,método para produção e colheita asséptica de raízes em cabeleira - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a biorreatores para culturas de órgãos radiculares que permitem que grandes partes da inoculação ou transferência de biomassa, cultivo e colheita das culturas sejam realizadas fora de um ambiente asséptico. A presente invenção refere-se adicionalmente a métodos para produzir e colher assepticamente raízes e métodos para produzir culturas de raízes usando os biorreatores acima mencionados isoladamente ou como parte de um aparelho que compreende adicionalmente um vaso de inoculação ou pelo menos um biorreator adicional.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a biorreatores para culturas de órgãos radiculares que permitem que grandes partes da inoculação ou transferência de biomassa, cultivo e colheita das culturas sejam realizadas fora de um ambiente asséptico. A presente invenção refere-se adicionalmente a métodos para produzir e colher assepticamente raízes e métodos para produzir culturas de órgão radiculares usando os biorreatores acima mencionados isoladamente ou como parte de um aparelho que compreende adicionalmente um vaso de inoculação ou pelo menos um biorreator adicional.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A produção de culturas de órgãos radiculares oferece acesso a compostos derivados de tecidos vegetais, superando as desvantagens comuns do abastecimento de compostos derivados de plantas a partir do campo. Em um biorreator, todos os fatores ambientais podem ser controlados em faixas estreitas. Este benefício permite que colheitas flexíveis, reproduzíveis e previsíveis de biomassa derivem compostos economicamente relevantes, por exemplo, metabólitos vegetais secundários. As culturas de órgãos radiculares são geralmente independentes da fotossíntese e sequestram todos os nutrientes necessários do meio. No entanto, as culturas de órgãos radiculares se diferenciavam em raízes em cabeleira e raízes adventícias.

[003] Raízes em cabeleira são derivadas de material vegetal transformado com Agrobacterium rhizogenes. Após a transformação, o tecido vegetal cresce em raízes finas, sem diferenciação adicional em diferentes tipos de tecido. Culturas de raízes em cabeleira podem ser usadas para produzir metabólitos vegetais secundários de alto valor em culturas líquidas, usando seu conjunto de vias metabólicas ou origem vegetal. Entre os metabólitos e outros produtos valiosos estão corantes, flavorizantes, pesticidas e produtos farmacêuticos. As culturas de órgãos radiculares em geral são culturas de longo prazo geneticamente estáveis, e culturas de raiz em cabeleira são especialmente vantajosas devido ao rápido crescimento exibido por raízes em cabeleira que é frequentemente comparável às taxas de crescimento de culturas de células eucarióticas não vegetais em suspensão. É importante ressaltar que, ao contrário dessas outras culturas em suspensão, as culturas de raízes em cabeleira não requerem a adição de fatores reguladores de crescimento à cultura.

[004] No entanto, culturas de raízes em cabeleira em larga escala apresentam vários problemas devido à morfologia dessas raízes. Especificamente, as raízes em cabeleira têm as principais características morfológicas das raízes vegetais normais, o que significa que elas são adotadas para o crescimento em meios sólidos. Por conseguinte, elas se fixam um ao outro quando cultivadas em culturas líquidas e formam aglomerados de raízes densas após crescimento prolongado em meio líquido. Devido a esses aglomerados de raízes, as dificuldades no manuseio de culturas de raízes em cabeleira já surgem durante a inoculação, a primeira etapa dos processos de produção em biorreatores.

[005] As culturas de suspensão celular de organismos procarióticos ou outros organismos eucarióticos podem ser facilmente transferidas entre vasos para inoculação, onde a transferência entre vasos ou compartimentos de vasos através de tubos e canos é quase independente da concentração de biomassa respectiva. Por outro lado, os agrupamentos de raízes em cabeleira aumentam de tamanho à medida que a biomassa da cultura continua a crescer. Portanto, uma maior concentração de biomassa no inóculo usado para inocular culturas maiores afeta os aspectos técnicos do projeto de vasos e biorreatores de inoculação adequados em termos de tubos, canos e portas de inoculação. Consequentemente, a morfologia do crescimento limita massivamente o espaço do projeto de equipamentos técnicos para processos de produção à base de raízes em cabeleira durante a expansão das culturas de escala de laboratório para escala industrial

[006] Esses desafios foram apenas parcialmente abordados até o momento. O procedimento padrão usado em culturas de raízes em cabeleira em escala de laboratório é a dissecção manual dos aglomerados de raízes, seguida subsequentemente pela transferência manual dos pedaços de raízes resultantes para um biorreator. Portanto, o vaso de inoculação e o biorreator são comumente abertos dentro de um ambiente asséptico, por exemplo, em uma câmara de fluxo laminar, para transferir manualmente os pedaços de raiz sem contaminar a cultura. No entanto, essa abordagem dificilmente pode ser dimensionada para volumes de produção industrial.

[007] As primeiras etapas em direção a uma solução escalonável para inoculação de biorreator com culturas de raízes em cabeleira foram realizados por Ramakrishnan et al. (1994, Biotechnology techniques 8(9):639- 644). Eles usaram um misturador esterilizado para homogeneizar as raízes de uma pré-cultura para preparar um inóculo. A pasta resultante foi então filtrada, transferido para um papel tratado quimicamente para análise (blotted) e transferida através de um vaso de transferência de 4 L para um biorreator de 16,68 L por deslocamento positivo usando ar comprimido. No entanto, as etapas de corte, filtragem, blotting e enchimento do vaso de transferência tiveram que ser realizadas em um ambiente asséptico, que, como a transferência manual, limita a escalabilidade dessa abordagem.

[008] Wilson et al. (1990, Progress in Plant Cellular and Molecular Biology, pp. 700-705; e WO 89/10958) foi capaz de inocular um biorreator em escala piloto de 500 L usando um vaso de inoculação dedicado formando um bico em toda a volta na parte superior do biorreator de 500 L. No entanto, a inoculação deste vaso de inoculação menor também teve que ser realizada em um ambiente asséptico com pedaços de raiz dissecados também em um ambiente asséptico. Além disso, a questão de aumentar de 500 L para volumes de cultura em escala industrial permanece indescritível, e não há relatos de soluções escalonáveis para inoculação ou transferência de cultura de raiz em cabeleira para fins de inoculação de reator.

[009] A colheita de culturas de raízes em cabeleira após a inoculação em um biorreator e o cultivo da cultura de raízes em cabeleira no dito biorreator enfrenta um conjunto semelhante de problemas em relação à escalabilidade. As características morfológicas das culturas de raízes em cabeleira pré-determinam as especificações necessárias do reator. Como já mencionado, as raízes em cabeleira se emaranham e formam aglomerados com o aumento do comprimento associado ao crescimento e ramificação das raízes. Com o crescimento, os aglomerados de raízes tornam-se maiores e mais densos, até o ponto em que as raízes mais externas do aglomerado restringem a troca de nutrientes, metabólitos e oxigênio com as partes internas dos aglomerados. O resultado é uma diminuição no crescimento observado de biomassa causado pela morte pela inanição de raízes geralmente viáveis. Consequentemente, os reatores do estado da técnica geralmente compartilham algum tipo de matriz de fixação sólida para o crescimento de raízes em cabeleira. Essas matrizes aumentam a distribuição de biomassa sobre o volume do reator. Com uma melhor distribuição de biomassa, a densidade do aglomerado de raízes é diminuída e a morte das raízes é minimizada (ver, por exemplo, WO 89/10958).

[0010] No entanto, problemas relacionados à escalabilidade desses sistemas de reatores surgem com volumes superiores a 100-500L, considerados como “escala piloto” na engenharia de bioprocessos. Para a colheita e a transferência do reator para reatores de maior produção (chamados de seed train), a biomassa primeiro deve ser desprendida da matriz de fixação e, posteriormente, deve ser movida para um reator maior. Durante estas etapas necessárias, qualquer contaminação deve ser evitada, isto é, essas etapas devem ser realizadas em condições assépticas, por exemplo, usando fluxo laminar, o que torna demorado, difícil e caro de alcançar.

[0011] Todos os reatores da técnica anterior adequados para culturas de raízes em cabeleira requerem o fornecimento de um ambiente asséptico para sua operação, por exemplo, pelo uso da tecnologia de sala limpa, a fim de manter a esterilidade na colheita, uma vez que grandes aberturas no vaso do reator devem ser abertas para a colheita manual da cultura de raízes. Uma transferência asséptica automatizada da cultura de raízes em cabeleira colhida para um vaso reator maior (seed train) ou para extração dos metabólitos secundários desejáveis não foi descrita.

[0012] Além disso, o projeto do reator de 500 L de Wilson et al. descrito acima foi encerrado no início dos anos 2000 como resultado de problemas de esterilidade.

[0013] Para resumir, ao tentar obter culturas de raízes em cabeleira em larga escala, existem dois problemas centrais: inocular um biorreator, isto é, cortar, lavar opcionalmente e transferir biomassa viável de raízes em cabeleira para uma cultura de larga escala, e produzir e colher assepticamente raízes em cabeleira a partir de uma grande variedade cultura em escala, ou seja, desprendendo raízes em cabeleira de uma matriz de fixação, cortando-as e, opcionalmente, transferindo-as para uma cultura de maior volume, requer trabalho manual sob condições assépticos caros e em larga escala, impraticáveis, por exemplo, sala limpa.

[0014] Por conseguinte, há a necessidade de vasos e biorreatores de inoculação alternativos para culturas de raízes em cabeleira de todas as escalas que permitam a automação dos processos acima mencionados e não requerem um ambiente asséptico.

[0015] Raízes adventícias, como raízes em cabeleira, são tecidos vegetais que podem ser usados em culturas de órgãos radiculares para a produção de metabólitos secundários industrialmente relevantes. Embora ambos compartilhem o crescimento de raiz fenotípico, esse crescimento é induzido por diferentes gatilhos. Como descrito acima, as raízes em cabeleira são estabelecidas usando Agrobacterium rhizogenes para transformar o tecido vegetal e estimular o crescimento típico de raiz em cabeleira. As raízes adventícias, em contraste com as raízes em cabeleira, são estabelecidas e mantidas através do uso de hormônios de crescimento de plantas no meio de cultura. Para o mesmo organismo vegetal, as taxas de crescimento de raízes em cabeleira e adventícias podem ser comparáveis na faixa de aprox. 0,01 - 0,5 d-1. Embora as características fenotípicas e morfológicas sejam bastante comparáveis entre raízes adventícias e em cabeleira da mesma espécie vegetal, as características fisiológicas diferem bastante. Por exemplo, raízes adventícias requerem o suplemento contínuo de hormônios de crescimento de plantas, enquanto raízes em cabeleira são consideradas geneticamente estáveis. Além disso, após o corte da biomassa radicular, as taxas de crescimento de raízes em cabeleira demonstraram declínio (Krombholz et al., Planta Medica 58 (34): 328-333, 1o de agosto de 1992). Por outro lado, a taxa de crescimento de raízes adventícias demonstrou aumentar após o corte das raízes em pedaços (Krombholz et al., Planta Medica 58 (34): 328-333 (1o de agosto de 1992); Sung et al., Plant Cell, Tissue, and Organ Culture 62(3): 187-193 (1o de janeiro de 2000); Paek et al., Plant cell, Tissue and Organ Culture 81(3): 287-300 (1o de junho 2005)).

[0016] Embora a fisiologia seja diferente, o fenótipo de raízes em cabeleira cultivadas em meio líquido se assemelha ao fenótipo de culturas de raízes adventícias. Em ambas as culturas, as raízes se alongam e se ramificam ao longo do período de crescimento e, portanto, apresentam uma grande tendência a se emaranhar e, consequentemente, formar aglomerados. Essa tendência de formação de aglomerados aumenta com o tempo de cultivo e o teor de biomassa. Esses agrupamentos densamente compactados dificultam bastante o processamento automatizado. Esses aglomerados podem atingir uma densidade compactada em que a desintegração dos aglomerados não pode ser alcançada sem o uso de energia mecânica externa (por exemplo, homogeneização). Além disso, a remoção de metabólitos e o meio, bem como as trocas gasosas, são altamente restritos na porção central dos aglomerados, prejudicando o crescimento da biomassa. Esta formação de aglomerados e as implicações correlatas são denominadores comuns para culturas de raízes em cabeleira e adventícias, embora o efeito da homogeneização nas taxas de crescimento tenha mostrado divergir entre raízes em cabeleira e raízes adventícias. Daqui resulta que as raízes em cabeleira são mais difíceis de cultivar do que as raízes adventícias devido à sua sensibilidade ao estresse por cisalhamento. Por conseguinte, qualquer método ou vaso adequado para o cultivo de raízes em cabeleira também é adequado para o cultivo de raízes adventícias, mas o mesmo não se aplica ao inverso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0017] Os inventores desenvolveram biorreatores que são adequados para culturas de órgãos radiculares em larga escala, permitem a inoculação, produção e colheita asséptica da biomassa da cultura de órgãos radiculares sem exigir um ambiente asséptico. Os inventores desenvolveram adicionalmente um aparelho compreendendo esse biorreator e um vaso de inoculação ou pelo menos um biorreator adicional que permite os processos de corte e lavagem opcional de raízes dentro do vaso, é adequado adicionalmente para transferir o inóculo assim preparado para um biorreator e não requer um ambiente asséptico para nenhuma dessas etapas.

[0018] O objetivo da presente invenção é resolvido pelo objeto das reivindicações independentes. As modalidades preferidas são evidentes a partir das reivindicações dependentes.

[0019] Em uma modalidade, a invenção provê um biorreator para o cultivo de culturas de órgãos radiculares, compreendendo: uma câmara de cultivo (2); uma faca rotativa rápida ou um rotor-estator (6) localizado na parte inferior do biorreator; uma porta de inoculação (1), em que o diâmetro interno da porta de inoculação (1) é > 10 mm; uma porta de colheita (5), em que o diâmetro interno da porta de colheita (5) é > 10 mm e em que a porta de colheita (5) está localizada na parte inferior do biorreator; e duas saídas de aeração (3, 4), em que uma saída de aeração é para entrada de gás e a outra saída de aeração é para saída de gás.

[0020] Em uma modalidade, o biorreator compreende adicionalmente um aspersor de gás (7). Em uma modalidade, o biorreator compreende adicionalmente uma a quatro saídas para tubos de imersão (8), em que os um a quatro tubos de imersão (8) são para adição de base, adição de alimentação, adição de ácido e/ou amostragem. Em uma modalidade, o biorreator compreende adicionalmente uma a três portas para sondas (9), em que as sondas são para medir pH, oxigênio dissolvido e/ou condutividade. Em uma modalidade, o volume da câmara de cultivo (2) é de 1-100000 L.

[0021] Em uma modalidade, o biorreator compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10a); uma montagem de matriz de fixação rotativa (12); uma lâmina de cisalhamento vertical (11a) para desprendimento de raiz; e um anel de suporte para a lâmina de cisalhamento (13); em que os pontos de fixação na matriz de fixação (10a) são dispostos verticalmente e em que a matriz de fixação (10a) é verticalmente rotativa no suporte da matriz de fixação rotativa (12) e a lâmina de cisalhamento vertical (11a) é estática.

[0022] Em uma modalidade, o biorreator não compreende uma matriz de fixação.

[0023] Em ainda outra modalidade, o biorreator compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10b), em que a matriz de fixação é composta de esferas, as ditas esferas compreendendo um polissacarídeo e um meio de crescimento. Em uma modalidade, o polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em alginato, agarose e gelano. Em uma modalidade, as esferas têm um diâmetro de 1 a 5 mm.

[0024] Em ainda outra modalidade, o biorreator compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10c); um eixo rotativo central e vertical; e múltiplas facas de desprendimento dispostas horizontalmente (11b); em que a matriz de fixação (10c) é composta por múltiplos discos de suporte de raiz horizontal e em que os ditos discos de suporte de raiz são espaçados em distâncias regulares de > 7 cm, e em que as facas de desprendimento (11b) são montadas horizontalmente no eixo rotativo vertical, de modo que uma faca de desprendimento está localizada a uma distância de 0,05-5 mm de cada disco de suporte de raiz e em que o número de facas de desprendimento (11b) é igual ou maior que o número ou discos de suporte de raiz. Em uma modalidade, os múltiplos discos de raiz são treliças de aço inoxidável ou placas perfuradas de aço inoxidável. Em uma modalidade, o biorreator compreende adicionalmente um tubo cilíndrico de sucção (14), em que os discos de suporte de raiz horizontais são montados dentro do tubo de sucção (14), em que o tubo cilíndrico de sucção (14) consiste em um cilindro que está totalmente aberto nas extremidades superior e inferior e em que o aspersor de gás (7) consiste em dois elementos de aspersão utilizáveis independentemente, um dos quais (7a) está localizado abaixo do centro do tubo de sucção e o outro (7b) é um aspersor de anel localizado abaixo ou fora do tubo de sucção na metade inferior da câmara de cultivo.

[0025] A invenção provê também um método de produção e colheita asséptica de raízes, compreendendo as etapas de 1) cultivar uma cultura de órgãos de raízes em um meio de crescimento dentro de um biorreator da invenção; 2) desprender opcionalmente as raízes da cultura de órgãos radiculares a partir da matriz de fixação (10a, 10b, ou 10c) dentro do biorreator; 3) opcionalmente deixar as raízes assentarem; 4) cortar as raízes dentro do biorreator usando a faca rotativa rápida ou o rotor-estator (6) na parte inferior do biorreator; e 5) remover as raízes cortadas usando a porta de colheita (5); 6) que as etapas 1 a 4 são realizadas dentro do biorreator e em que as etapas 1 a 5 não requerem um ambiente asséptico.

[0026] Em uma modalidade, a etapa de cultivo é realizada por 1-12 semanas.

[0027] Em uma modalidade, a etapa de desprendimento é realizada pelo uso da força de cisalhamento exercida pela lâmina de cisalhamento (11a) na matriz rotativa (10a) do biorreator.

[0028] Em uma modalidade, a etapa de cultivo compreende induzir o movimento do meio de cultura por gaseamento da cultura de órgãos radiculares a 0,2-50 sL/L/h ao longo da etapa de cultivo através do uso do aspersor de gás (7). Em uma modalidade, o gaseamento é feito com ar estéril com uma composição de 21-30% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2.

[0029] Em uma modalidade, a etapa de desprendimento é realizada dissolvendo as esferas da matriz de fixação (10b) do biorreator. Em uma modalidade, as esferas da matriz de fixação (10b) são dissolvidas por adição de ácido cítrico ou uma enzima de clivagem de polissacarídeos. Em uma modalidade, o ácido cítrico é ácido cítrico 10 mM com um pH de 5-6. Em outra modalidade, a enzima de clivagem de polissacarídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em alginato-liase, gelano-liase e beta-agarase.

[0030] Em uma modalidade, a etapa de desprendimento é realizada pelo uso da força de cisalhamento exercida pelas lâminas de desprendimento (11b) girando acima dos discos de suporte de raiz do biorreator.

[0031] Em uma modalidade, a etapa de corte é realizada girando a faca rotativa rápida (6) a uma velocidade na extremidade de 1-50 m/s ou o rotor-estator (6) na parte inferior do biorreator. Em uma modalidade, a etapa de corte é realizada a uma temperatura de 0-35°C,Em uma modalidade, a etapa de remoção é realizada usando uma bomba peristáltica ou uma bomba picadora, ou uma rosca transportadora ou realizando enxágue com meio de crescimento.

[0032] A invenção provê adicionalmente um aparelho para inoculação, produção e colheita de culturas de raízes em cabeleira, compreendendo um biorreator da invenção conectado a um vaso de inoculação ou pelo menos um biorreator adicional da invenção.

[0033] Em uma modalidade, o aparelho compreende um primeiro biorreator da invenção e pelo menos um biorreator adicional da invenção, em que o dito primeiro biorreator está conectado ao dito pelo menos um biorreator adicional.

[0034] Esse aparelho pode ser usado em um método de produção de raízes, compreendendo

[0035] um método de preparação de um inóculo para uma cultura de órgãos radiculares a partir de biomassa radicular viável, compreendendo as seguintes etapas: 1) introduzir biomassa radicular viável no primeiro biorreator do aparelho através da porta de inoculação (1) em um ambiente asséptico; 2) cultivar opcionalmente a biomassa radicular introduzida na presença de um meio de crescimento 3) cortar opcionalmente a biomassa radicular com a faca rotativa rápida ou rotor-estator (6) do primeiro biorreator, opcionalmente, em que a etapa de corte é realizada a uma temperatura de 0-35°C, 4) transferir o inóculo cortado a partir do primeiro biorreator ao pelo menos um biorreator adicional usando a porta de colheita (5) do primeiro biorreator e a porta de inoculação (1) do pelo menos um biorreator adicional, opcionalmente, em que a etapa de transferência ocorre através de um conector estéril, em que o conector estéril provê restrições mínimas de fluxo e/ou em que o conector impõe uma redução mínima na seção transversal do caminho do fluxo, opcionalmente em que o método compreende adicionalmente uma etapa de lavagem do primeiro biorreator por recirculação do meio de crescimento a partir do pelo menos um biorreator adicional até o primeiro biorreator em que as etapas 2 e 3 são realizadas dentro do primeiro biorreator e em que as etapas 2 a 4 não requerem um ambiente asséptico; seguido pelo método de produção e colheita asséptica de raízes da invenção realizada utilizando o pelo menos um biorreator adicional; em que o primeiro biorreator e pelo menos um biorreator adicional estão compreendidos no aparelho acima.

[0036] Em outra modalidade, o aparelho compreende um vaso de inoculação e um biorreator. Nessa modalidade, o vaso de inoculação é para preparar um inóculo para uma cultura de órgãos radiculares a partir de biomassa radicular viável, e compreende: uma câmara de inoculação (21) uma faca (16), em que a faca faz parte de uma construção de lâmina de agitador rotativo ou de uma construção de moinho tipo faca e em que a faca está localizada dentro da câmara; entre três e cinco saídas da câmara, em que as saídas são para entrada de biomassa radicular (15), saída de inóculo (17), aeração, entrada de meio (18, 19) e saída de meio, e em que o diâmetro interno das saídas é > 10 mm.

[0037] Em uma modalidade, a entre três e cinco saídas do vaso de inoculação são usadas para o menor número de entrada de biomassa radicular, saída de inóculo, aeração, entrada de meio e saída de meio possível. Em uma modalidade, pelo menos uma das três a cinco saídas do vaso de inoculação pode ser ajustada com uma tampa de rosca ou vedação rotativa estéril (20), e as saídas restantes podem ser ajustadas com conectores estéreis sem restrições de fluxo, em que os conectores estéreis podem ser conectados a tubos. Em uma modalidade, em que a saída para saída de inóculo (17) e/ou saída de meio está localizada no fundo do vaso de inoculação. Em uma modalidade, em que o volume da câmara de inoculação (21) é de 0,2-50 L, preferencialmente de 0,2-2L. A invenção fornece adicionalmente um método de produção de culturas de órgãos radiculares, compreendendo um método de preparação de um inóculo seguido por um método de produção e colheita asséptica de raízes da invenção, em que um vaso de inoculação e um biorreator da invenção estão compreendidos no aparelho da invenção.

[0038] Tal aparelho pode ser usado em um método de produção de raízes, compreendendo um método de preparação de um inóculo para uma cultura de órgãos radiculares a partir de biomassa radicular viável, compreendendo as seguintes etapas: 1) introduzir a biomassa radicular viável em um vaso de inoculação que é parte aparelho da invenção, através de uma das três a cinco saídas em um ambiente asséptico; 2) cortar a biomassa radicular com a faca (16) do vaso de inoculação; 3) lavar opcionalmente a biomassa radicular cortada com um meio de lavagem usando uma ou mais das três a cinco saídas do vaso de inoculação para entrada e saída de meio; e 4) transferir o inóculo cortado e opcionalmente lavado, do vaso de inoculação a um biorreator usando uma das três a cinco saídas para saída do inóculo (17); 5) que as etapas 2 e 3 são realizadas dentro do vaso de inoculação, e em que as etapas 2 a 4 não requerem um ambiente asséptico, seguido por um método para produzir e colher assepticamente as raízes da invenção.

[0039] Em uma modalidade, a etapa de corte deste método é realizada por girar a faca (16) da construção de lâmina do agitador rotativo com uma velocidade na extremidade de 1 - 50 m/s, ou girar a faca da construção do moinho do tipo faca para exercer força de cisalhamento. Em uma modalidade, a etapa de corte é realizada a uma temperatura de 0-35°C.

[0040] Em uma modalidade, em que o meio de lavagem é selecionado a partir do grupo de uma solução salina, um meio de crescimento e uma solução tampão. Em uma modalidade, em que o meio de lavagem é adicionado ao vaso de inoculação para ressuspender a biomassa radicular cortada através de uma das três a cinco saídas e em que o meio de lavagem é removido do meio de inoculação através de uma das três a cinco saídas. Em uma modalidade, a remoção do meio de lavagem ocorre por espargimento, bombeamento, gravitação ou aplicação de sobrepressão.

[0041] Em uma modalidade, a etapa de transferência ocorre através de um conector estéril, em que o conector estéril provê restrições mínimas de fluxo e/ou em que o conector impõe uma redução mínima na seção transversal do caminho do fluxo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0042] A Figura 1 mostra um vaso de inoculação para a preparação de um inóculo de raiz a partir de biomassa viável de raízes em cabeleira, compreendendo uma entrada de biomassa de raízes em cabeleira (15), uma faca (16), uma saída de inóculo (17), saídas para entrada de meio, aeração (18,19) e saída de meio, um suporte de vedação rotativa (20) com uma saída para o eixo do agitador rotativo da faca e uma câmara de inoculação (21).

[0043] A Figura 2 mostra um biorreator para produzir e colher assepticamente raízes, compreendendo uma porta de inoculação (1), uma câmara de cultivo (2), duas saídas de aeração (3, 4), uma porta de colheita (5), uma faca rotativa rápida (6), um aspersor de gás (7), quatro saídas para tubos de imersão (8) e três portas para sondas (9).

[0044] A Figura 3 mostra um biorreator para produzir e colher assepticamente raízes, compreendendo uma porta de inoculação (1), uma câmara de cultivo (2), duas saídas de aeração (3, 4), uma porta de colheita (5), uma faca rotativa rápida (6), um aspersor de gás (7), quatro saídas para tubos de imersão (8), três portas para sondas (9), uma matriz de fixação rotativa (10a), uma faca de cisalhamento vertical (11a), uma montagem de matriz de fixação rotativa (12) e um anel de suporte para a lâmina de cisalhamento (13).

[0045] A Figura 4 mostra um biorreator para produzir e colher assepticamente raízes, compreendendo uma porta de inoculação (1), uma câmara de cultivo (2), duas saídas de aeração (3, 4), uma porta de colheita (5), uma faca rotativa rápida (6), um aspersor de gás (7), quatro saídas para tubos de imersão (8), três portas para sondas (9) e uma matriz de fixação composta por esferas (10b).

[0046] A Figura 5 mostra um biorreator para produzir e colher assepticamente raízes, compreendendo uma porta de inoculação (1), uma câmara de cultivo (2), duas saídas de aeração (3, 4), uma porta de colheita (5), uma faca rotativa rápida (6), um aspersor de gás (7) que consiste em dois elementos de aspersão utilizáveis independentemente, um dos quais (7a) está localizado abaixo do centro do tubo de sucção e o outro (7b) é um aspersor de anel localizado fora do tubo de sucção na metade inferior da câmara de cultivo, quatro saídas para tubos de imersão (8), três portas para sondas (9), uma matriz de fixação composta por discos de suporte de raiz horizontais (10c), facas de desprendimento dispostas horizontalmente (11a), um eixo rotativo central e vertical (12) e um tubo cilíndrico de sucção (14).

[0047] A Figura 6 mostra um protótipo de vaso de inoculação em escala de laboratório para preparar um inóculo de raiz de 3 L a partir de biomassa radicular viável, compreendendo uma entrada de biomassa radicular (15), uma faca (16), saídas para saída de inóculo (17), entrada de meio, saída de meio (19) e aeração (18), um suporte de vedação rotativa (20) para a faca, uma câmara de inoculação (21), um tubo de transferência de meio (22), um tubo de saída (23) conectado ao biorreator a ser inoculado através de conector estéril (25) sem nenhuma restrição de caminho de fluxo e um filtro estéril (24).

[0048] A Figura 7 mostra avaliações de crescimento de fragmentos de raízes em cabeleira cortados manualmente de 2 ou 12 mm de comprimento após 12 ou 20 dias de cultivo em meio de cultura sólido. A, C e E representam o crescimento da ponta da parte aérea. B, D e F representam o crescimento do fragmento médio. A, B: taxa média de crescimento em mm/d (N = 12). C, D: fragmentos viáveis como % do total de fragmentos. E, F: taxa média de crescimento de fragmentos viáveis apenas em mm/d.

[0049] A Figura 8 mostra a avaliação do tamanho dos fragmentos de diferentes experimentos de homogeneização automatizada de raiz em cabeleira. As barras de erro representam o desvio padrão de três réplicas técnicas. A: Distribuição dos tamanhos de fragmento (em mm) na menor entrada potência testada, de 0,0008 kWh/g. B: Distribuição dos tamanhos de fragmento (em mm) na entrada potência média testada, de 0,0016 kWh/g. C: Distribuição dos tamanhos de fragmento (em mm) na maior entrada potência testada, de 0,003 kWh/g. D: Densidade óptica a 600 nm da fase líquida das culturas homogeneizadas nas três entradas de potência testadas.

[0050] A Figura 9 mostra representações esquemáticas de elementos interiores de diferentes biorreatores. Todos os biorreatores tinham um volume operacional de 3L e uma câmara de cultivo, uma porta de inoculação com um diâmetro interno de 10 mm; uma porta de colheita (5) com um diâmetro interno de 10 mm localizado na parte inferior do biorreator e duas saídas de aeração. As configurações 2-6 uma faca rotativa rápida ou um rotor-estator localizado na parte inferior do biorreator. A configuração 2 apresentou adicionalmente uma matriz de fixação e um cano de submersão com um filtro (frit) de aspersor de metal sinterizado. A configuração 3 não apresentava matriz de fixação, mas um tubo de sucção que se estendia acima do nível do meio de cultura durante a cultura. A configuração 4 apresentou um tubo de sucção que se estende acima do nível do meio de cultura durante a cultura, uma matriz de fixação composta por três discos de suporte de raiz horizontais separando o espaço dentro do tubo de sucção em quatro compartimentos e um filtro (frit) de aspersor de metal sinterizado na parte inferior do reator. A configuração 5 apresentou um tubo de sucção completamente submerso no meio de cultura durante a cultura, uma matriz de fixação composta por três discos de suporte de raiz horizontais separando o espaço dentro do tubo de sucção em quatro compartimentos, três facas de desprendimento montadas horizontalmente em eixo rotativo central e vertical e um filtro (frit) de aspersor de metal sinterizado na parte inferior do reator. A configuração 6 apresentou um tubo de sucção completamente submerso no meio de cultura durante a cultura, uma matriz de fixação composta por três discos de suporte de raiz horizontais separando o espaço dentro do tubo de sucção em quatro compartimentos, três facas de desprendimento montadas horizontalmente em eixo rotativo central e vertical e um anel abaixo da extremidade inferior do tubo de sucção.

[0051] A Figura 10 mostra o rendimento de biomassa e a análise percentual de biomassa colhível de culturas de raízes em cabeleira cultivadas nos diferentes biorreatores mostrados na Figura 9. As culturas foram inoculadas com 8-20 g de peso fresco de biomassa, consistindo em fragmentos de raiz em cabeleira cortados e cultivados por 15-42 dias. Onde os biorreatores continham um aspersor, a vazão de ar durante a inoculação e cultura foi ajustada para 10-15 sL/h. A: Rendimento total de biomassa calculado a partir da biomassa final no final da cultura (peso fresco; em gramas) dividido pela sacarose metabolizada (em gramas) mostrada como barras pretas, biomassa colhível em % da biomassa total no final da cultura mostrada como linha cinza. As barras de erro para as configurações 4 e 6 mostram o desvio padrão para três réplicas técnicas. B: Rendimento de biomassa eficaz calculado multiplicando o rendimento total de biomassa e a biomassa colhível de A.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0052] A presente invenção, tal como descrita ilustrativamente a seguir, pode ser convenientemente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações, não especificamente aqui divulgados.

[0053] A presente invenção será descrita com respeito a modalidades particulares, mas a invenção não está limitada desta forma, mas apenas pelas reivindicações.

[0054] Quando o termo “compreendendo” é usado na presente descrição e reivindicações, ele não exclui outros elementos. Para os propósitos da presente invenção, o termo “consistindo em” é considerado uma modalidade preferida do termo “compreendendo”. Se, a seguir, um grupo é definido compreendendo pelo menos um certo número de modalidades, isto também deve ser entendido como divulgando um grupo que de preferência consiste apenas nestas modalidades.

[0055] Onde um artigo indefinido ou definido é usado quando se refere a um substantivo singular, por exemplo, “um/uma” ou “o/a”, isto inclui um plural desse substantivo, a menos que algo diferente seja especificamente indicado.

[0056] O termo “ambiente asséptico”, conforme usado aqui, refere-se a condições que evitam a contaminação por microrganismos por estarem livres de microrganismos ou terem um número reduzido de microrganismos em comparação com o ambiente ao redor, com o número máximo de unidades formadoras de colônias por metro cúbico (UFC/m3) sendo 200 (consulte as diretrizes de GMP da UE, classificação de sala limpa). Um ambiente asséptico pode ser, por exemplo, uma sala limpa, uma câmara de fluxo laminar ou um espaço estéril.

[0057] O termo “raiz”, conforme usado aqui, refere-se a qualquer raiz de planta adequada para a cultura estável de órgãos radiculares. As raízes especialmente preferidas são as em cabeleira e as adventícias.

[0058] O termo “raiz em cabeleira”, conforme aqui utilizado, refere- se a raízes derivadas de material vegetal transformado com Agrobacterium rhizogenes. Após a transformação, o tecido vegetal cresce em raízes finas que parecem cabelo, sem diferenciação adicional em diferentes tipos de tecido.

[0059] O termo “raiz adventícia”, conforme aqui utilizado, refere-se a raízes derivadas de material vegetal através do uso de hormônios de crescimento de plantas. Para manter o crescimento de raízes adventícios em uma cultura in vitro, o meio de cultura deve ser continuamente suplementado com e/ou conter continuamente hormônios de crescimento de planta. O tecido da planta cresce então em raízes finas sem diferenciação adicional em diferentes tipos de tecido no meio de cultura.

[0060] Os termos “cultura”, “cultivar” e “cultivo”, conforme aqui utilizados, referem-se à produção de material radicular por incubação em condições adequadas para provocar um aumento na biomassa e para garantir a viabilidade do material radicular. Preferencialmente, todos os nutrientes necessários são fornecidos às raízes em um meio de crescimento líquido. O meio de crescimento líquido pode ser aplicado ao material radicular intermitentemente a partir de cima, por exemplo, por pulverização ou gotejamento, ou o material radicular pode ser intermitentemente submergido continuamente. Por conseguinte, uma cultura líquida de material radicular pode ser, por exemplo, uma cultura de submersão ou uma cultura em leito gotejante. As culturas de órgãos radiculares de acordo com a presente invenção são mantidas dentro de biorreatores. A duração da cultura pode durar de 1 a 12 semanas. Em algumas modalidades, a cultura é uma cultura descontínua, uma cultura semi-contínua ou uma cultura descontínua seguida pela cultura semi-contínua alimentada.

[0061] O termo “cultura de submersão”, conforme aqui utilizado, refere-se à cultura de raízes, submergindo-as inteiramente em meio de crescimento líquido durante toda a duração da cultura.

[0062] O termo “cultura em leito gotejante”, conforme usado aqui, refere-se à cultura de raízes, gotejando o meio de crescimento líquido sobre as raízes de cima, de modo que o meio cubra as raízes e depois goteja para baixo ainda mais. Desta maneira, as raízes são revestidas contínua ou intermitentemente com uma fina película de meio de crescimento líquido. Isso permite uma melhor troca gasosa do que a submersão em grandes volumes de meio de crescimento líquido.

[0063] O termo “biomassa radicular”, conforme aqui utilizado, refere- se a quaisquer raízes viáveis. Preferencialmente, a biomassa radicular é uma pré-cultura radicular. O termo “pré-cultura”, conforme aqui utilizado, refere- se a uma cultura em pequena escala do material radicular, na qual o material radicular é passado para o meio de crescimento fresco várias vezes para aumentar a biomassa total e/ou para aumentar a densidade da biomassa

[0064] Os termos “meio de crescimento” e “meio de cultura”, conforme aqui utilizados, referem-se a um meio de cultura adequado para facilitar o crescimento de culturas de órgãos radiculares. O meio de crescimento da presente invenção é tipicamente um meio de crescimento líquido, mas em certas modalidades também pode ser solidificado ou semissolidificado por adição de polissacarídeos. O meio de crescimento da presente invenção compreenderá os constituintes listados na Tabela 1 em concentrações iguais ou maiores que a concentração mínima e menores ou iguais à concentração máxima listada na Tabela 1. Os meios de crescimento preferidos são o meio Schenk e Hildebrandt (“meio SH”), meio Woody Plant (“WPM”), meio B5, meio Murashige-Skoog (“meio MS”), meio Strullu e Romand (“meio SR”), meio Strullu e Romand modificado (“meio MSR”), e meio mínimo de Becard e Fortin (“meio M”).Tabela 1

[0065] O termo “inóculo”, conforme usado aqui, refere-se ao material radicular preparado a partir de biomassa radicular viável que foi cortada em pedaços de raiz de cerca de 2 mm a cerca de 30 mm de comprimento, opcionalmente lavada com meio de lavagem e ressuspensa em meio de crescimento fresco a uma concentração de 0,1 - 2,5 g/L, preferencialmente de 0,5 g/L, massa seca ou de 1,5 - 40 g/L, preferencialmente de 8 g/L de massa úmida. O inóculo pode ser usado para inocular, isto é, iniciar, uma cultura de órgão radicular em um biorreator.

[0066] O termo “preparação de um inóculo”, conforme usado aqui, refere-se ao processo de corte em pedaços de cerca de 2 mm a cerca de 30 mm de comprimento, opcionalmente lavado e ressuspenso em meio de crescimento fresco a uma concentração de 0,1 - 2,5 g/L, preferencialmente 0,5 g/L, de massa seca ou de 1,5 - 40 g L, prefereniclamente de 8 g/L de massa úmida de material radicular viável a partir de uma biomassa radicular viável.

[0067] O termo “meio de lavagem”, conforme aqui utilizado, refere- se a, por exemplo, uma solução salina, um meio de crescimento ou uma solução tampão e é adequado para lavar o material radicular de uma biomassa radicular durante o processo de preparação de um inóculo. O termo “solução tampão”, conforme usado aqui, é uma solução aquosa compreendendo uma mistura de um ácido fraco e sua base conjugada, ou vice-versa. As soluções tampão são usadas como um meio de manter o pH a um valor quase constante em uma ampla variedade de condições e com a adição de uma ampla variedade de substâncias.

[0068] O termo “vaso de inoculação”, conforme aqui utilizado, refere- se a um vaso adequado para a preparação de um inóculo para uma cultura de órgão radicular no mesmo. O vaso de inoculação (ver Figura 1) opcionalmente compreendido no aparelho da presente invenção compreende uma câmara de inoculação (21), uma faca (16), em que a faca (16) faz parte de uma construção de lâmina de agitador rotativo ou de uma construção de moinho tipo faca e em que a faca (16) está localizada dentro da câmara de inoculação (21) e entre três e cinco saídas, em que as saídas são para entrada de biomassa radicular (15), saída de inóculo (17), aeração, entrada de meio (18, 19) e saída de meio, e em que o diâmetro interno é > 10 mm. Preferencialmente, o vaso de inoculação tem quatro saídas, mais preferencialmente o vaso de inoculação tem cinco saídas. Cada saída é usada para o menor número de entrada de biomassa radicular (15), saída de inóculo (17), aeração, entrada de meio (18, 19) e saída de meio possível; isto é, cada saída é usada apenas para dois, preferencialmente um, dos processos acima. Pelo menos uma das saídas do vaso de inoculação pode ser ajustada com uma tampa de rosca estéril ou vedação rotativa estéril. As saídas restantes do vaso de inoculação podem ser ajustadas com conectores estéreis sem restrições de fluxo. Os conectores estéreis ajustados nas saídas do vaso de inoculação podem ser conectados aos tubos. Preferencialmente, a saída usada para saída do inóculo e/ou saída do meio (17) está localizada no fundo do vaso de inoculação, permitindo a saída do inóculo e/ou meio por gravidade, aplicação de pressão ou enxágue com o meio.

[0069] A câmara de inoculação (21) do vaso de inoculação tem um volume de câmara de 0,2-50 L, preferencialmente de 0,2-25 L, mais preferencialmente de 0,2-10 L, ainda mais preferencialmente de 0,2-5 L, mais preferencialmente de 0,2-2 L.

[0070] O vaso de inoculação é feito de vidro. Mais preferencialmente, o vaso de inoculação é feito de vidro de borossilicato. Mais preferencialmente, o vaso de inoculação é feito de vidro de borossilicato 3.3 (“Duran”) ou “Pyrex”. Vantajosamente, o vaso de inoculação de vidro possui alta durabilidade mecânica e durabilidade de temperatura, permitindo a esterilização por autoclavagem. Além disso, o vaso de inoculação de vidro é transparente e qualquer material radicular do inóculo remanescente no vaso de inoculação após a transferência para um biorreator é claramente visível. Da mesma forma, a transparência permite que o usuário veja depois de tantos ciclos de enxágue recirculando o meio de crescimento do biorreator através do vaso de inoculação, todo o material radicular restante foi transferido para o biorreator.

[0071] A faca (16) da câmara de inoculação faz parte de uma construção de lâmina de agitador rotativo ou de uma construção de moinho do tipo faca. Preferencialmente, a faca (16) pode ser inserida na câmara de inoculação através de uma das saídas e é montada em uma vedação rotativa estéril (20), que pode ser ajustada na saída pela qual a faca (16) é inserida. A faca (16) pode ser girada automaticamente. Preferencialmente, a faca (16) da construção de lâmina de agitador rotativo gira com uma velocidade na extremidade de 1-50 m/s. A faca (16) do vaso de inoculação é adequada para cortar o material radicular derivado da biomassa radicular em pedaços de raiz com cerca de 2-30 mm de comprimento dentro da câmara de inoculação (21) girando com uma velocidade de extremidade de 1-50 m/s (se a faca (16) fizer parte de uma construção de lâmina de agitador rotativo) ou exercendo força de cisalhamento (se a faca (16) fizer parte de uma construção de moinho do tipo faca). A faca (16) do vaso de inoculação é feita de metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, a faca de metal (16) da invenção pode ser esterilizada por autoclavagem e tem alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto.

[0072] As tampas de rosca, que podem ser ajustadas em pelo menos uma das saídas do recipiente de inoculação, são feitas de polipropileno. As vedações rotativas, que podem ser ajustadas em pelo menos uma das saídas do recipiente de inoculação, são feitas de politetrafluoretileno (PTFE). Vantajosamente, as tampas de rosca e/ou vedações rotativas podem ser esterilizadas por autoclavagem devido à durabilidade em alta temperatura.

[0073] Os conectores, que podem ser ajustados nas saídas restantes do vaso de inoculação, proveem restrições mínimas de fluxo e têm um diâmetro interno mínimo de 10 mm. Os conectores podem ser junções de plugues. Os conectores são feitos de policarbonato, polipropileno ou metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, os conectores podem ser esterilizados por autoclavagem. Exemplos de conectores adequados são os conectores estéreis KleenpakTM (Pall Cooperations, ver US 6 655 655 B1) e os conectores “triclamp”.

[0074] O termo “fornece restrições mínimas de fluxo”, conforme usado aqui, refere-se a conectores com um diâmetro interno mínimo de 10 mm, cujo diâmetro interno não pode mudar ao longo do comprimento do dito conector em mais de +/- 30%. Além disso, o diâmetro interno do conector não deve ser inferior a 70% do diâmetro interno de todos os tubos conectados aos conectores.

[0075] O termo “impõe uma redução mínima na seção transversal do caminho do fluxo”, conforme usado aqui, refere-se a conectores com um diâmetro interno mínimo de 10 mm e uma área de seção transversal livre que não pode mudar ao longo do comprimento do dito conector na direção do fluxo através do conector em mais de -50% e/ou + 70%.

[0076] Os tubos que podem ser conectados aos conectores são feitos de silicone e têm um diâmetro interno mínimo de 10 mm. Vantajosamente, o tubo de silicone não contém lixiviáveis, pode ser autoclavado devido à durabilidade a altas temperaturas e possui boa estabilidade e elasticidade mecânica, o que é importante ao conectá-los, por exemplo a bombas peristálticas.

[0077] O termo “entrada de biomassa radicular”, conforme aqui utilizado, refere-se à transferência de material radicular, opcionalmente suspenso no meio de crescimento ou lavagem, de uma biomassa radicular para o vaso de inoculação.

[0078] O termo “saída de inóculo”, conforme aqui utilizado, refere-se à transferência do inóculo preparado dentro da câmara de inoculação (21) do vaso de inoculação da dita câmara de inoculação, preferencialmente em um biorreator.

[0079] Os termos “aeração” e “gaseamento”, conforme usados aqui, se referem à introdução de ar esterilizado com uma composição de 21-30% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2 no vaso de inoculação e/ou biorreator da invenção. O gaseamento pode ser feito através do uso de um aspersor de gás. O termo “aspersor de gás”, conforme usado aqui, refere-se a um dispositivo que borbulha ar esterilizado com uma composição de 21-30% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2 através do meio no vaso de inoculação e/ou biorreator da invenção. A aspersão aumenta a interface gás- líquido. Quanto menores as bolhas, mais suave o gaseamento, o que é vantajoso para evitar danos às raízes da cultura.

[0080] Os termos “uma saída”, “saídas”, “porta” e “portas”, conforme usados aqui, referem-se a uma abertura em um vaso de inoculação ou biorreator, que pode ser ajustado com um conector, uma tampa de rosca ou uma vedação rotativa a vácuo.

[0081] Sempre que uma porta, saída, tubo, conector, junção de plugue ou outro componente do vaso de inoculação e/ou biorreator tiver um diâmetro interno mínimo de 10 mm, isso permitirá o fluxo desobstruído de peças de raiz com tamanho de 2-30 mm por esse componente.

[0082] O vaso de inoculação pode ser usado em um método de preparação de um inóculo como parte de um método de produção de raízes, que também é provido pela invenção. O método de preparação de um inóculo para uma cultura de órgãos radiculares a partir de biomassa radicular viável compreende as etapas: 1) introduzir a biomassa radicular em um vaso de inoculação que é parte aparelho da invenção, através de uma das três a cinco saídas em um ambiente asséptico; 2) cortar a biomassa radicular com a faca (16) do vaso de inoculação; 3) lavar opcionalmente a biomassa radicular cortada com um meio de lavagem usando uma ou mais das três a cinco saídas do vaso de inoculação para entrada e saída de meio; e 4) transferir o inóculo cortado e opcionalmente lavado, do vaso de , inoculação a um biorreator usando uma das três a cinco saídas para saída do inóculo (17); em que as etapas 2 e 3 são realizadas dentro do vaso de inoculação, e em que as etapas 2 a 4 não requerem um ambiente asséptico. Portanto, o vaso de inoculação inventivo e o método de preparação de um inóculo permitem a combinação de corte, lavagem opcional e transferência em um vaso que pode ser dimensionado para requisitos de volume industrial, sem a necessidade de condições assépticas, por exemplo, sala limpa, caras e difíceis de expandir.

[0083] Preferencialmente, o material radicular é cortado girando a faca (16) do vaso de inoculação com uma velocidade de extremidade de 1-50 m/s se a faca (16) faz parte de uma construção de lâmina de agitador rotativo ou exercendo força de cisalhamento com a faca (16) do vaso de inoculação, se ele fizer parte de uma construção de moinho do tipo faca. A etapa de corte é realizada em temperaturas de 0 a 35°C. Preferencialmente, a etapa de corte é realizada sob condições de resfriamento, isto é, a temperaturas de 0 a 26°C, para reduzir os danos e a perda de viabilidade do material radicular.

[0084] Preferencialmente, o meio de lavagem para lavar o material radicular da biomassa radicular é solução salina, meio de crescimento ou uma solução tampão. Na etapa de lavagem, o meio de lavagem é adicionado através de uma das saídas do vaso de inoculação, preferencialmente através de uma saída de entrada de meio dedicado, para ressuspender o material radicular da biomassa radicular. O meio de lavagem é então removido através de uma das saídas do vaso de inoculação, preferencialmente através de uma saída dedicada à saída de meio, a qual está preferencialmente localizada no fundo do recipiente de inoculação. A remoção do meio de lavagem ocorre preferencialmente por espargimento, bombeamento, gravitação ou aplicação de sobrepressão, mais preferencialmente por bombeamento.

[0085] A etapa de transferência ocorre através de um conector estéril, que provê restrições mínimas de fluxo e/ou não impõe redução na seção transversal do caminho do fluxo e tem um diâmetro interno mínimo de 10 mm.

[0086] O inóculo preparado pelo método inventivo acima contém pedaços de raiz de 2 mm a cerca de 30 mm de comprimento a uma concentração de 0,1 - 2,5 g/L, preferencialmente de 0,5 g/L, de massa seca ou de 1,5 - 40 g/L, preferencialmente de 8 g/L de massa úmida em suspensão em meio de crescimento.

[0087] O termo “biorreator”, conforme aqui utilizado, refere-se a um vaso adequado para cultivar uma cultura de órgão radicular no mesmo. O biorreator da presente invenção (ver Figura 2) compreende uma câmara de cultivo (2); uma faca rotativa rápida ou um rotor-estator (6) localizado na parte inferior do biorreator; uma porta de inoculação (1), em que o diâmetro interno da porta de inoculação é > 10 mm; uma porta de colheita (5), em que o diâmetro interno da porta de colheita é >10 mm e em que a porta de colheita está localizada na parte inferior do biorreator; e duas saídas de aeração (3, 4), em que uma saída de aeração é para entrada de gás e a outra saída de aeração é para saída de gás.

[0088] O biorreator compreende adicionalmente opcionalmente um aspersor de gás (7), em que a saída de aeração para entrada de gás está conectada a um aspersor de gás. Opcionalmente, o biorreator compreende um segundo aspersor de gás e, alternativamente ou adicionalmente, compreende uma a quatro saídas para tubos de imersão (8), em que os um a quatro tubos de imersão são para adição de base, adição de alimentação, adição de ácido e/ou amostragem. Opcionalmente, o biorreator compreende adicionalmente ou adicionalmente uma a três portas para sondas (9), em que as sondas são para medir pH, oxigênio dissolvido e/ou condutividade.

[0089] O biorreator da invenção, incluindo todos os encaixes, tampas, portas e saídas, é feito de metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, o biorreator da invenção pode ser esterilizado por autoclavagem e tem alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto.

[0090] A câmara de cultivo (2) é uma câmara dentro do biorreator no qual a etapa de cultura é realizada. O volume da câmara de cultivo (2) é de 1100000 L, preferencialmente de 10 - 100000L, mais preferencialmente de 1000-100000 L, mais preferencialmente de 10000-100000L. A faca rotativa rápida (6) do biorreator está localizada na parte inferior do biorreator, pode ser girada a uma velocidade de extremidade de 1-50 m/s e é feita de metal, preferencialmente de aço, preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, a faca rotativa rápida (6) da invenção pode ser esterilizada por autoclavagem e tem alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento.

[0091] O rotor-estator (6) do biorreator está localizado na parte inferior do biorreator e é feito de metal, preferencialmente de aço, preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, o rotor-estator (6) da invenção pode ser esterilizado por autoclavagem e tem alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto.

[0092] A porta de inoculação (1) está preferencialmente localizada na metade superior do vaso de inoculação e pode ser conectada a um conector estéril, o qual impõe restrições mínimas de fluxo e/ou impõe reduções mínimas na seção transversal e, por sua vez, pode ser conectada a um tubo ou cano que leva a um vaso de inoculação. Um inóculo radicular é transferido por essa porta (1) para a câmara de cultivo (2) do biorreator para iniciar uma cultura de órgão radicular. A porta de inoculação (1) tem um diâmetro interno mínimo de 10 mm.

[0093] A porta de colheita (5) está localizada na parte inferior do vaso de inoculação, o que permite a colheita de material radicular cortado em um tamanho de 2-30 mm e suspenso em meio de crescimento por gravidade, e tem um diâmetro interno mínimo de 10 mm.

[0094] O aspersor de gás (7) pode ser de qualquer um dos seguintes tipos: tubo de aspersão, aspersor de aço inoxidável sinterizado, elemento de aço inoxidável poroso, aspersor de tipo aranha, aspersor de anel. O aspersor de gás (7) é usado para gaseificar a cultura de órgão radicular dentro da câmara de cultivo (2) do biorreator. O aspersor de gás (7) é feito de metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, o aspersor de gás (7) da invenção pode ser esterilizado por autoclavagem e tem alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto.

[0095] Os termos “aeração” e “gaseamento”, conforme usados aqui, se referem a bombear ar esterilizado com uma composição de 21-30% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2 no vaso de inoculação e/ou biorreator da invenção.

[0096] Sempre que uma porta, saída, tubo, conector, junção de plugue ou outro componente do vaso de inoculação e/ou biorreator tiver um diâmetro interno mínimo de 10 mm, isso permitirá o fluxo desobstruído de peças de raiz com tamanho de 2-30 mm por esse componente.

[0097] O termo “tubo de imersão”, conforme usado aqui, refere-se a um tubo que pode ser submerso na cultura de órgãos radiculares dentro da câmara de cultivo (2) do biorreator. Eles podem ser usados, por exemplo, para a adição de bases ou ácidos para ajustar o pH da cultura e/ou para dissolver uma matriz de fixação de polissacarídeos, para a adição de meio fresco (“alimentação”) em uma cultura semi-contínua e/ou para obter amostras da cultura de órgãos radiculares durante o cultivo.

[0098] O biorreator da invenção também pode ser utilizado em um método de produção e colheita asséptica de raízes da invenção. O método de produção e colheita asséptica de raízes compreende as etapas de: 1) cultivar uma cultura de órgãos de raízes em um meio de crescimento dentro de um biorreator da invenção; 2) desprender opcionalmente as raízes da cultura de órgãos radiculares a partir da matriz de fixação (9a, 9b, ou 9c) dentro do biorreator; 3) deixar as raízes assentarem; 4) cortar as raízes assentadas dentro do biorreator usando a faca rotativa rápida ou o rotor-estator (6) na parte inferior do biorreator; e 5) remover as raízes cortadas usando a porta de colheita (5); em que as etapas 1 a 4 são realizadas dentro do biorreator e em que as etapas 1 a 5 não requerem um ambiente asséptico. Portanto, o biorreator inventivo e o método de produção e colheita asséptica de material radicular permitem a combinação de cultivo, desprendimento opcional, corte e remoção de material radicular em um vaso que pode ser dimensionado para requisitos de volume industrial, sem a necessidade de condições assépticas, por exemplo, sala limpa, caras e difíceis de expandir.

[0099] A etapa de cultivo é preferencialmente realizada durante 1-12 semanas e pode ser realizada como cultura de submersão, por exemplo, como cultura descontínua, cultura semi-contínua ou cultura descontínua seguida de cultura semi-contínua ou como cultura em leito de gotejante. Numa modalidade, a cultura é uma cultura de submersão que é uma cultura descontínua por 3-4 semanas, seguida por 8 semanas de cultura semi- contínua.

[00100] Em uma modalidade (ver Figura 3), o biorreator compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10a), uma montagem de matriz de fixação rotativa (12), uma lâmina de corte cisalhamento vertical (11b) para desprendimento de raiz e um anel de suporte para a lâmina de cisalhamento (13), em que os pontos de fixação na matriz de fixação (10a) são dispostos verticalmente e em que a matriz de fixação (10a) é verticalmente rotativa na montagem da matriz de fixação rotativa (12) e em que a lâmina de cisalhamento vertical (11b) é estática. A matriz de fixação (10a) é feita de metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, a matriz de fixação (10a) da invenção pode ser esterilizada por autoclavagem e tem alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto. A matriz de fixação (10a) pode ser feita a partir de uma chapa de metal perfurada ou de uma grade de metal, onde os orifícios na chapa ou na grade servem como pontos de fixação para as raízes da cultura. Preferencialmente, a matriz de fixação (10a) é uma malha. Mais preferencialmente, o tamanho da malha é de 2x2mm a 50x50mm, por exemplo, 2x2mm, 3x3mm, 4x4mm, 5x5mm, 6x6mm, 7x7mm, 8x8mm, 9x9mm, 10x10mm, 11x11mm, 12x12mm, 13x13mm, 14x14mm, 15x15mm, 16x16mm, 17x17mm, 18x18mm, 19x19mm, 20x20 mm, 21x21mm, 22x22mm, 23x23mm, 24x24mm, 25x25mm, 26x26mm, 27x27mm, 28x28mm, 29x29mm, 30x30mm, 31x31mm, 32x32mm, 33x33mm, 34x34mm, 35x35mm, 36x36mm, 37x37mm, 38x38mm, 39x39mm, 40x40mm, 41x41mm, 42x42mm, 43x43mm, 44x44mm, 45x45mm, 46x46mm, 47x47mm, 48x48mm, 49x49mm, ou 50x50mm. O tamanho de malha mais preferido dependerá do tamanho médio dos fragmentos de raiz com os quais a cultura é inoculada. A lâmina de cisalhamento vertical (11a) é feita de metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, a lâmina de cisalhamento vertical (11a) da invenção pode ser esterilizada por autoclavagem e tem alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto. Ao usar o biorreator desta modalidade, o método de produção e colheita asséptica de raízes compreende o desprendimento das raízes pelo uso da força de cisalhamento exercida pela lâmina de cisalhamento (11a) na matriz rotativa (10a). Especificamente, no biorreator desta modalidade, o material radicular do inóculo será fixado aos pontos de fixação da matriz de fixação (10a) e começará a crescer durante o período de cultivo. Uma vez atingida uma densidade adequada do material radicular na cultura, a matriz de fixação (10a) pode ser girada e a faca de cisalhamento estática (11a) solta o material radicular, exercendo força de cisalhamento pela superfície da matriz de fixação rotativa (10a) Tanto as raízes que crescem em direção ao centro da câmara de cultivo (2) quanto as raízes que crescem em direção ao exterior da câmara de cultivo (2) serão assim desprendidas e assentadas por gravidade na parte inferior do biorreator.

[00101] Em uma modalidade, o biorreator não compreende uma matriz de fixação (ver a figura 2). Ao usar o biorreator desta modalidade, o método de produção e colheita asséptica de raízes compreende a indução de movimento do meio de cultura contínuo por gaseamento da cultura de órgãos radiculares a 0,2-50 sL/L/h durante toda a etapa de cultivo através do uso do aspersor de gás (7). O gaseamento é feito com ar esterilizado com uma composição de 21-30% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2. Especificamente, as raízes crescerão livremente em suspensão, com o movimento do meio de cultura impedindo o assentamento e/ou o aumento, bem como a formação de aglomeração excessiva. Uma vez alcançada uma densidade adequada de material radicular na cultura, o gaseamento é interrompido, e o material radicular assenta através da gravidade na parte inferior do biorreator.

[00102] Em ainda outra modalidade, o biorreator compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10b), em que a matriz de fixação (10b) é composta de esferas, as ditas esferas compreendendo um polissacarídeo e um meio de crescimento. (Ver figura 4). Preferencialmente, o polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em alginato, agarose e gelano. Preferencialmente, as esferas têm um diâmetro de 1 a 5 mm. Ao usar o biorreator desta modalidade, o método de produção e colheita asséptica de raízes compreende a indução de movimento contínuo do meio de cultura por gaseamento da cultura de órgãos radiculares a 0,2-50 sL/L/h durante toda a etapa de cultivo através do uso do aspersor de gás (7), e a etapa de desprendimento compreende dissolver as esferas da matriz de fixação (10b). O gaseamento é feito com ar esterilizado com uma composição de 2130% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2.. A dissolução das esferas de matriz de fixação (10b) é feita por adição de ácido cítrico, preferencialmente ácido cítrico 10 mM com um pH de 5-6, ou de uma enzima de clivagem de polissacarídeos. A enzima de clivagem de polissacarídeos dependerá do polissacarídeo usado. Para esferas de alginato, é adicionada alginato-liase; para as esferas de gelano, é adicionado gelano-liase; e para agarose, é adicionado beta-agarase. Especificamente, as raízes do inóculo se fixam às esferas da matriz de fixação (10b), que flutuam livremente em suspensão devido ao movimento do meio de cultura induzido por gaseamento no meio de crescimento. As raízes crescem e, finalmente, formam aglomerados entre esferas. Uma vez alcançada uma densidade adequada de material radicular na cultura, o gaseamento é interrompido e as esferas afundam para o fundo do biorreator por gravidade. Ao dissolver as esferas, apenas o material radicular permanece assentado no fundo do biorreator.

[00103] Em ainda outra modalidade, o biorreator (ver Figura 5) compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10c), um eixo rotativo central e vertical; e múltiplas facas de desprendimento dispostas horizontalmente (11b); em que a matriz de fixação (10c) é composta por múltiplos discos de suporte de raiz horizontal e em que os ditos discos de suporte de raiz são espaçados em distâncias regulares de > 7 cm, e em que as facas de desprendimento (11b) são montadas horizontalmente no eixo rotativo vertical, de modo que uma faca de desprendimento (11b) está localizada a uma distância de 0,05-5 mm de cada disco de suporte de raiz e em que o número de facas de desprendimento (11b) é igual ou maior que o número ou discos de suporte de raiz. Em uma modalidade, os discos de suporte de raiz têm uma área de setores circulares de 30-360°, preferencialmente de 45-320°, mais preferencialmente de 60-270°. Quanto maior a seção aberta dos discos de suporte de raiz, melhor o meio pode circular ao redor e entre os discos de suporte de raiz. A altura das facas de desprendimento (11b) é de até 10%, até 20%, até 30%, até 40%, até 50%, até 60%, até 70%, até 80%, até 90% ou até 100% da distância entre os discos de suporte de raiz ao redor Preferencialmente, a altura das facas de desprendimento (11b) é de até 100% da distância entre os discos de suporte de raiz ao redor. O eixo rotativo vertical e central, as facas de desprendimento (11b) e os discos de suporte de raiz da matriz de fixação (10c) são feitos de metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, esses componentes da invenção podem ser esterilizados por autoclavagem e têm alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto. Os múltiplos discos de raiz são treliças ou placas perfuradas de aço inoxidável, com os orifícios nas treliças e/ou placas que servem como pontos de fixação para as raízes da cultura. Preferencialmente, os vários discos de suporte raiz são malhas. Mais preferencialmente, o tamanho da malha é de 2x2mm a 50x50mm, por exemplo, 2x2mm, 3x3mm, 4x4mm, 5x5mm, 6x6mm, 7x7mm, 8x8mm, 9x9mm, 10x10mm, 11x11mm, 12x12mm, 13x13mm, 14x14mm, 15x15mm, 16x16mm, 17x17mm, 18x18mm, 19x19mm, 20x20 mm, 21x21mm, 22x22mm, 23x23mm, 24x24mm, 25x25mm, 26x26mm, 27x27mm, 28x28mm, 29x29mm, 30x30mm, 31x31mm, 32x32mm, 33x33mm, 34x34mm, 35x35mm, 36x36mm, 37x37mm, 38x38mm, 39x39mm, 40x40mm, 41x41mm, 42x42mm, 43x43mm, 44x44mm, 45x45mm, 46x46mm, 47x47mm, 48x48mm, 49x49mm, ou 50x50mm. O tamanho de malha mais preferido dependerá do tamanho médio dos fragmentos de raiz com os quais a cultura é inoculada. Ao usar o biorreator desta modalidade, a etapa de desprendimento do método de produção e colheita asséptica de raízes é realizada pelo uso da força de cisalhamento exercida pelas lâminas de desprendimento (11b) girando acima dos discos de suporte de raiz. Especificamente, as raízes do inóculo se fixam nos pontos de fixação dos discos de suporte de raiz da matriz de fixação (10c) e começam a crescer durante a etapa de cultivo. Uma vez alcançada uma densidade adequada de material radicular na cultura, as facas de desprendimento (11b) são giradas e arrancam as raízes que crescem sobre os discos de suporte de raiz. Se a altura das facas de desprendimento (11b) se aproximar ou for 100% da distância entre os discos de suporte de raiz ao redor, as facas de desprendimento rotativas também arrancarão as raízes que crescem abaixo do próximo disco de suporte mais alto. As raízes desprendidas, tanto de cima como de baixo dos discos de suporte de raiz, assentam por gravidade na parte inferior do biorreator. Ao usar o biorreator desta modalidade, o método de produção e colheita asséptica de raízes pode compreender a indução de movimento contínuo do meio de cultura por gaseamento da cultura de órgãos radiculares a 0,2-50 sL/L/h durante toda a etapa de cultivo através do uso do aspersor de gás (7). O gaseamento é feito com ar esterilizado com uma composição de 2130% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2.

[00104] Em uma modalidade preferida, o biorreator (ver Figura 5) da modalidade acima pode compreender adicionalmente um tubo de sucção cilíndrico (14), em que os discos de suporte de raiz horizontais são montados dentro do tubo de sucção cilíndrico (14). O tubo de sucção consiste em um cilindro totalmente aberto nas extremidades superior e inferior. O tubo de sucção (14) é feito de metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, o tubo de sucção (14) da invenção pode ser esterilizado por autoclavagem e tem alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto. Se a cultura de órgãos radiculares é uma cultura de submersão, preferencialmente, o tubo de sucção é totalmente submerso no meio de cultura durante a cultura para melhorar a uniformidade da distribuição da biomassa na cultura e aumentar a porcentagem de biomassa total que é colhível. Nesta modalidade, o aspersor de gás (7) consiste em dois elementos de aspersão utilizáveis independentemente, um dos quais (7a) está localizado abaixo do centro do tubo de sucção e o outro (7b) é um aspersor de anel localizado abaixo ou fora do tubo de sucção na metade inferior da câmara de cultivo. Ao usar o biorreator desta modalidade, o método de produção e colheita asséptica de raízes compreende a indução de movimento do meio contínuo por gaseamento da cultura de órgãos radiculares a 0,2-50 sL/L/h durante toda a etapa de cultivo através do uso do aspersor de gás (7a). O gaseamento é feito com ar esterilizado com uma composição de 21-30% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2.

[00105] Em todos os biorreatores e métodos de produção e colheita asséptica de raízes da invenção, a etapa de corte é realizada girando a faca rotativa rápida (6) a uma velocidade de extremidade de 1-50 m/s ou executando o rotor-estator (6 ) quando as raízes da cultura assentaram na parte inferior do biorreator. A etapa de corte é realizada em temperaturas de 0 a 35°C. Preferencialmente, a etapa de corte é realizada sob condições de resfriamento, isto é, a temperaturas de 0 a 20°C, para reduzir os danos e a perda de viabilidade do material radicular. Os pedaços de raízes cortadas a serem colhidas terão um tamanho de 2-30 mm.

[00106] Em todos os biorreatores e métodos de produção e colheita asséptica de raízes da invenção, a etapa de remoção é realizada usando uma bomba peristáltica ou uma rosca transportadora ou realizando enxágue com meio de crescimento.

[00107] A invenção provê adicionalmente um aparelho para inoculação, cultivo e colheita de culturas de órgãos radiculares, compreendendo um primeiro biorreator da invenção e pelo menos um biorreator adicional da invenção, em que o dito primeiro biorreator está conectado ao dito pelo menos um biorreator adicional. Este aparelho pode ser, por exemplo, um seed train.

[00108] O aparelho acima da invenção pode ser usado em um método de produção de raízes, compreendendo um método de preparação de um inóculo para uma cultura de órgãos radiculares a partir de biomassa radicular viável, compreendendo as seguintes etapas: 1) introduzir biomassa radicular viável no primeiro biorreator do aparelho através da porta de inoculação (1) em um ambiente asséptico; 2) cultivar opcionalmente a biomassa radicular introduzida na presença de um meio de crescimento 3) cortar opcionalmente a biomassa radicular com a faca rotativa rápida ou rotor-estator (6) do primeiro biorreator, 4) opcionalmente, em que a etapa de corte é realizada a uma temperatura de 0-35°C, 5) transferir o inóculo cortado a partir do primeiro biorreator ao pelo menos um biorreator adicional usando a porta de colheita (5) do primeiro biorreator e a porta de inoculação (1) do pelo menos um biorreator adicional, opcionalmente, em que a etapa de transferência ocorre através de um conector estéril, em que o conector estéril provê restrições mínimas de fluxo e/ou em que o conector impõe uma redução mínima na seção transversal do caminho do fluxo, opcionalmente em que o método compreende adicionalmente uma etapa de lavagem do primeiro biorreator por recirculação do meio de crescimento a partir do pelo menos um biorreator adicional até o primeiro biorreator em que as etapas 2 e 3 são realizadas dentro do primeiro biorreator e em que as etapas 2 a 4 não requerem um ambiente asséptico; seguido pelo método de produção e colheita asséptica de raízes da invenção; em que o primeiro biorreator e pelo menos um biorreator adicional estão compreendidos no aparelho acima.

[00109] Finalmente, a invenção também provê um aparelho que compreende um vaso de inoculação como descrito acima e um biorreator da invenção, os quais estão conectados. A conexão pode compreender um conector estéril ajustado em uma das três a cinco saídas do vaso de inoculação, um conector estéril ajustado na porta de inoculação (15) do biorreator e um tubo ou cano fixado a esses conectores estéreis, em que os conectores, tubos e/ou canos estéreis impõem restrições mínimas de fluxo e/ou impõem uma redução mínima na seção transversal do caminho do fluxo e têm um diâmetro interno mínimo de 10 mm. Os conectores e tubos estéreis são feitos de metal, preferencialmente de aço, mais preferencialmente de aço inoxidável austenítico, por exemplo, “WNr. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L) “. 1.4404 (X2CrNiMo17-12-2), AISI 316L, (A4L)”. Vantajosamente, os conectores e cano estéreis do aparelho podem ser esterilizados por autoclavagem e têm alta resistência à corrosão devido ao cloreto nos meios de lavagem ou crescimento contendo cloreto. O tubo é feito de silicone e tem um diâmetro interno mínimo de 10 mm. Vantajosamente, o tubo de silicone não contém lixiviáveis, pode ser autoclavado devido à durabilidade a altas temperaturas e possui boa estabilidade e elasticidade mecânica, o que é importante ao conectá-los, por exemplo a bombas peristálticas.

[00110] O aparelho acima da invenção pode ser usado em um método de produção de raízes em cabeleira, que compreende um método de preparação de um inóculo como descrito acima, seguido por um método de produção e colheita asséptica de raízes da invenção.

[00111] 1. A invenção fornece provê adicionalmente as seguintes modalidades: um vaso de inoculação para preparar um inóculo para uma cultura de raízes em cabeleira a partir de biomassa de raízes em cabeleira, compreendendo: uma câmara de inoculação (21); uma faca (16), em que a faca (16) faz parte de uma construção de lâmina de agitador rotativo ou de uma construção de moinho tipo faca e em que a faca (16) está localizada dentro da câmara; entre três e cinco saídas da câmara, em que as saídas são para entrada de biomassa de raízes em cabeleira (15), saída de inóculo (17), aeração, entrada de meio e saída de meio, e em que o diâmetro interno das saídas é > 10 mm, 2. O vaso de inoculação da modalidade 1, em que as entre três e cinco saídas são usadas para o menor número de entrada de biomassa de raízes em cabeleira (15), saída de inóculo (17), aeração, entrada de meio e saída de meio possível.

[00112] 3. O vaso de inoculação da modalidade 1 ou 2, em que pelo menos uma das três a cinco saídas pode ser ajustada com uma tampa de rosca ou vedação rotativa estéril, e em que as saídas restantes podem ser ajustadas com conectores estéreis sem restrições de fluxo e em que o conector estéril pode ser conectado a tubos.

[00113] 4. O vaso de inoculação de qualquer uma das modalidades anteriores, em que a saída para saída de inóculo e/ou saída de meio (17) está localizada na parte inferior do vaso de inoculação.

[00114] 5. O vaso de inoculação de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o volume da câmara de inoculação (17) é de 0,2-50 L, preferencialmente 0,2-2L.

[00115] 6. Método de preparação de um inóculo para uma cultura de raízes em cabeleira a partir de biomassa de raízes em cabeleira viável, compreendendo as seguintes etapas: 1) introduzir biomassa de raízes em cabeleira viável no vaso de inoculação de qualquer uma das modalidades 1 a 5 por meio de uma das três a cinco saídas em um ambiente asséptico; 2) cortar a biomassa de raízes em cabeleira com a faca (16) do vaso de inoculação; 3) lavar opcionalmente a biomassa de raízes em cabeleira cortada com um meio de lavagem usando uma ou mais das três a cinco saídas do vaso de inoculação para entrada e saída de meio; e 4) transferir o inóculo cortado, opcionalmente lavado, do vaso de inoculação a um biorreator usando uma das três a cinco saídas (17) para saída do inóculo, em que as etapas 2 e 3 são realizadas dentro do vaso de inoculação, e em que as etapas 2 a 4 não requerem um ambiente asséptico.

[00116] 7. O método da modalidade 6, em que o corte é realizado por girar a faca (16) da construção de lâmina do agitador rotativo com uma velocidade na extremidade de 1 - 50 m/s, ou girar a faca (16) da construção do moinho do tipo faca para exercer força de cisalhamento.

[00117] 8. O método da modalidade 6 ou 7, em que a etapa de corte é realizada a uma temperatura de 0-20°C.

[00118] 9. O método de qualquer uma das modalidades 6 a 8, em que o meio de lavagem é selecionado a partir do grupo de uma solução salina, um meio de crescimento e uma solução tampão.

[00119] 10. O método de qualquer uma das modalidades 6 a 9, em que o meio de lavagem é adicionado ao vaso de inoculação para ressuspender a biomassa de raízes em cabeleira cortada através de uma das três a cinco saídas e em que o meio de lavagem é removido do meio de inoculação através de uma das três a cinco saídas.

[00120] 11. O método da modalidade 10, em que a remoção do meio de lavagem ocorre por espargimento, bombeamento, gravitação ou aplicação de sobrepressão.

[00121] 12. O método de qualquer uma das modalidades 6 a 11, em que a etapa de transferência ocorre através de um conector estéril, em que o conector estéril provê restrições mínimas de fluxo e/ou em que o conector impõe uma redução mínima na seção transversal do caminho do fluxo.

[00122] 13. O método de qualquer uma das modalidades 6-12, em que o método compreende adicionalmente uma etapa de lavagem do vaso de inoculação recirculando o meio de crescimento do biorreator para o vaso de inoculação.

[00123] 14. Biorreator para o cultivo de culturas de raízes em cabeleira, compreendendo: uma câmara de cultivo (2); uma faca rotativa rápida ou um rotor-estator (6) localizado na parte inferior do biorreator; uma porta de inoculação (1), em que o diâmetro interno da porta de inoculação (1) é > 10 mm; uma porta de colheita (5), em que o diâmetro interno da porta de colheita (5) é > 10 mm e em que a porta de colheita (5) está localizada na parte inferior do biorreator; e duas saídas de aeração (3, 4), em que uma saída de aeração é para entrada de gás e a outra saída de aeração é para saída de gás.

[00124] 15. O biorreator da modalidade 14, compreendendo adicionalmente uma a quatro saídas para tubos de imersão (8), em que os um a quatro tubos de imersão são para adição de base, adição de alimentação, adição de ácido e/ou amostragem.

[00125] 16. O biorreator da modalidade 14 ou 15, compreendendo adicionalmente uma a três portas para sondas (9), em que as sondas são para medir pH, oxigênio dissolvido e/ou condutividade.

[00126] 17. O biorreator de qualquer uma das modalidades 14-16, em que o volume da câmara de cultivo (2) é de 1-100000 L.

[00127] 18. O biorreator de qualquer uma das modalidades 14-17, compreendendo adicionalmente uma matriz de fixação (10a); uma montagem de matriz de fixação rotativa (12); uma lâmina de cisalhamento vertical (11a) para desprendimento de raiz; e um anel de suporte para a lâmina de cisalhamento (13); em que os pontos de fixação na matriz de fixação (10a) são dispostos verticalmente e em que a matriz de fixação (10a) é verticalmente rotativa no suporte da matriz de fixação rotativa (12) e a lâmina de cisalhamento vertical (11a) é estática.

[00128] 19. O biorreator de qualquer uma das modalidades 14-17, em que o biorreator não compreende uma matriz de fixação.

[00129] 20. O biorreator de qualquer uma das modalidades 14-17, compreendendo adicionalmente uma matriz de fixação (10b), em que a matriz de fixação (10b) é composta por esferas, as ditas esferas compreendendo um polissacarídeo e um meio de crescimento.

[00130] 21. O biorreator da modalidade 20, em que o polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em alginato, agarose e gelano.

[00131] 22. O biorreator da modalidade 20 ou 21, em que as esferas têm um diâmetro de 1 a 5 mm.

[00132] 23. O biorreator de qualquer uma das modalidades 14-17, compreendendo adicionalmente uma matriz de fixação (10c); um eixo rotativo central e vertical; e múltiplas facas de desprendimento dispostas horizontalmente (11b); em que a matriz de fixação (10c) é composta por múltiplos discos de suporte de raiz horizontal e em que os ditos discos de suporte de raiz são espaçados em distâncias regulares de > 10 cm, e em que as facas de desprendimento (11b) são montadas horizontalmente no eixo rotativo vertical, de modo que uma faca de desprendimento (11b) está localizada a uma distância de 0,05-5 mm de cada disco de suporte de raiz e em que o número de facas de desprendimento (11b) é igual ao número ou discos de suporte de raiz.

[00133] 24. O biorreator da modalidade 23, em que os múltiplos discos de raiz são treliças de aço inoxidável ou placas perfuradas de aço inoxidável.

[00134] 25. O biorreator de acordo com a reivindicação 23 ou 24, compreendendo adicionalmente um tubo cilíndrico de sucção (14) em que os discos de suporte de raiz horizontais são montados dentro do tubo cilíndrico de sucção (14), em que o tubo cilíndrico de sucção (14) consiste em um cilindro que está totalmente aberto nas extremidades superior e inferior e em que o aspersor de gás (7) consiste em um elemento de aspersão, opcionalmente, em dois elementos de aspersão utilizáveis independentemente, um dos quais (7a) está localizado abaixo do centro do tubo de sucção e o outro (7b) é um aspersor de anel localizado fora e acima da abertura inferior do tubo de sucção.

[00135] 26. Método de produção e colheita asséptica de raízes em cabeleira, compreendendo as etapas de 1) cultivar uma cultura de raízes em cabeleira em um meio de crescimento dentro do biorreator de qualquer uma das modalidades 14 a 25; 2) desprender opcionalmente as raízes em cabeleira da cultura de raízes em cabeleira a partir da matriz de fixação dentro do biorreator; 3) deixar as raízes em cabeleira assentarem; 4) cortar as raízes em cabeleira assentadas dentro do biorreator usando a faca rotativa rápida ou o rotor-estator (6) na parte inferior do biorreator; e 5) remover as raízes em cabeleira cortadas usando a porta de colheita (5); 6) em que as etapas 1 a 4 são realizadas dentro do biorreator e em que as etapas 1 a 5 não requerem um ambiente asséptico.

[00136] 27. O método da modalidade 26, em que a etapa de cultivo é realizada por 1-12 semanas.

[00137] 28. O método da modalidade 26, em que o biorreator é o biorreator da modalidade 18 e em que a etapa de desprendimento é realizada pelo uso da força de cisalhamento exercida pela lâmina de cisalhamento (11a) na matriz rotativa.

[00138] 29. O método da modalidade 26, em que o biorreator é o biorreator de qualquer uma das modalidades 19-22, em que a etapa de cultivo compreende a indução de turbulência por gaseamento da cultura de raízes em cabeleira a 0,2-50 sL/L/h durante toda a etapa de cultivo.

[00139] 30. O método da modalidade 29, em que o gaseamento é feito com ar estéril com uma composição de 21-30% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2.

[00140] 31. O método da modalidade 26, em que o biorreator é o biorreator de qualquer uma das modalidades 20-22, e em que a etapa de desprendimento é realizada dissolvendo as esferas da matriz de fixação (10b).

[00141] 32. O método da modalidade 31, em que as esferas da matriz de fixação (10b) são dissolvidas por adição de ácido cítrico ou uma enzima de clivagem de polissacarídeos.

[00142] 33. O método da modalidade 32, em que o ácido cítrico é ácido cítrico 10 mM com um pH de 5-6.

[00143] 34. O método da modalidade 33, em que a enzima de clivagem de polissacarídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em alginato- liase, gelano-liase e beta-agarase.

[00144] 35. O método da modalidade 26, em que o biorreator é o biorreator de qualquer uma das modalidades 23 a 25, em que a etapa de desprendimento é realizada pelo uso da força de cisalhamento exercida pelas lâminas de desprendimento (11b) girando acima dos discos de suporte de raiz.

[00145] 36. O método de qualquer uma das modalidades 26-35, em que a etapa de corte é realizada girando a faca rotativa rápida (6) a uma velocidade na extremidade de 1-50 m/s ou o rotor-estator (6) na parte inferior do biorreator

[00146] 37. O método de qualquer uma das modalidades 26-36, em que a etapa de corte é realizada a uma temperatura de 0-20°C.

[00147] 38. O método de qualquer uma das modalidades 26-37, em que a etapa de remoção é realizada usando uma bomba peristáltica ou uma rosca transportadora ou realizando enxágue com meio de crescimento.

[00148] 39. Aparelho para inoculação, cultivo e colheita de culturas de raízes em cabeleira, compreendendo o vaso de inoculação de qualquer uma das modalidades 1-5 e o biorreator de qualquer uma das modalidades 14-25, em que o dito vaso de inoculação está conectado ao dito biorreator.

[00149] 40. Método de produção de raízes em cabeleira, compreendendo o método de preparação de um inóculo de qualquer uma das modalidades 6-13, seguido pelo método de produção e colheita asséptica de qualquer uma das modalidades 26-38, e em que o vaso de inoculação e o biorreator estão compreendidos no aparelho da modalidade 39.

[00150] Embora a invenção tenha sido ilustrada e descrita em detalhes nos desenhos e na descrição anterior, essa ilustração e descrição devem ser consideradas ilustrativas ou exemplificativas e não restritivas. A invenção não está limitada às modalidades descritas. Outras variações das modalidades descritas podem ser entendidas e efetuadas pelos versados na técnica na prática de uma invenção reivindicada, a partir de um estudo dos desenhos, da descrição e das reivindicações dependentes.

[00151] A descrição detalhada é meramente exemplificativa por natureza e não se destina a limitar a aplicação e os usos. Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente a presente invenção sem, contudo, limitar o escopo da invenção aos mesmos. Várias alterações e modificações podem ser feitas por aqueles versados na técnica com base na descrição da invenção, e essas alterações e modificações também estão incluídas na presente invenção.

EXEMPLOS 1. Preparação de inóculo de raiz em cabeleira ou adventícia em escala laboratorial

[00152] A Figura 6 mostra um protótipo de vaso de inoculação em escala laboratorial para preparar uma inóculo de raiz em cabeleira ou adventícia de 3 L e inoculação em biorreator com o inoculo usando um vaso para as etapas de processo combinadas de corte, lavagem opcional e transferência do inóculo de raiz em cabeleira ou adventícia.

[00153] A cultura de raiz em cabeleira ou adventícia não cortada é transferida para o vaso de inoculação através de uma abertura na extremidade superior (15). O vaso de inoculação é então equipado com uma vedação rotativa montada no topo (20), que serve como mancal para o eixo do agitador para uma faca rotativa (16). Meio, solução salina ou água estéril podem ser adicionados ao recipiente através da porta de entrada de meio (18) usando uma bomba rotativa e o tubo de transferência de meio (22). Para fins de lavagem, um tubo de saída (23) pode ser usado para decantar o meio e ressuspender as raízes em cabeleira ou adventícias com meio fresco através da porta de entrada de meio (18). Um filtro estéril (24) serve para fins de compensação de pressão estéril, a fim de evitar sobrepressão causada pelo bombeamento de meios para dentro do recipiente. Após o corte e a lavagem do material de raiz em cabeleira ou adventícia, o tubo de saída (23) conectado à saída de inóculo (17) é conectado também a um biorreator a ser inoculado através de um conector estéril (25), impondo restrições mínimas de caminho de fluxo. A porta de inoculação do biorreator deve, portanto, ser equipada com o mesmo tipo de conector estéril. Para inoculação, o inóculo cortado e lavado suspenso no meio é transferido para o reator usando a gravidade. Para facilitar o manuseio, o ar pressurizado pode ser fornecido através do filtro estéril (24). O vaso pode ser reabastecido com meio fresco a partir do reator, bombeado para dentro do vaso pela porta de entrada de meio (18), com o objetivo de ressuspender e enxaguar os pedaços de raízes em cabeleira ou adventícias restantes. A transferência geralmente é concluída após 2-4 ciclos de reabastecimento/enxágue.

[00154] Em detalhes, o vaso de inoculação é carregado sob fluxo laminar esterilizando as pinças por todo o seu comprimento usando um bico de Bunsen e transferindo uma pré-cultura de raiz em cabeleira ou adventícia a partir de um frasco de agitação de pré-cultura para o vaso de inoculação usando a abertura superior (15) com as pinças estéreis. Em seguida, o eixo do agitador/mancal da faca rotativo (16) é montado e inserido na vedação rotativa montada na parte superior (20) é testada para um ajuste apertado. O fluxo laminar ou outros ambientes assépticos não são mais necessários. A homogeneização é alcançada equipando o vaso de inoculação com o eixo e acionamento do agitador e girando a faca rotativa (16) a 2500 rpm por 30 segundos. Para lavagem da cultura com meio de lavagem fresco, um meio de lavagem fresco e autoclavado é bombeado para o recipiente de inoculação usando o tubo de transferência de meio (22) e uma bomba peristáltica. As raízes em cabeleira ou adventícias são então decantadas derramando o meio de lavagem do vaso de inoculação usando a saída de inóculo (17) conectada ao tubo de saída (23). O tubo de saída (23) é então tapado com papel de alumínio estéril. Para transferência da cultura, o tubo de transferência de meio (22) é fixado em um biorreator e montado em uma bomba peristáltica. Em seguida, a junção de plugue estéril (25) é fixada na porta de inoculação do biorreator. As raízes cortadas e lavadas são então ressuspensas em 300 ml de meio de crescimento do reator usando a bomba peristáltica. A bomba é então parada e o inóculo de raiz cortada é despejado no reator através da saída de inóculo (17), tubo de saída (23) e junção de plugue estéril (25), inclinando o vaso de inoculação. O vaso de inoculação é então abastecido com meio de crescimento fresco do biorreator no caso de pedaços de raiz remanescentes no vaso de inoculação. As duas últimas etapas são repetidas quantas vezes forem necessárias para a transferência completa dos pedaços de raiz em cabeleira ou adventícia do inóculo para o biorreator. Então, todos os tubos (22, 23 e o tubo que leva ao 24) são retirados e o vaso de inoculação é desconectado do biorreator.

2. Determinação da viabilidade e crescimento de raízes em cabeleira após corte manual

[00155] Foi demonstrado que o corte de raízes em cabeleira leva à inibição do crescimento (Krombholz et al., Planta Medica 58 (34): 328-333, 1o de agosto de 1992). No entanto, o corte, especialmente o corte mecânico, melhora consideravelmente a facilidade e a eficiência da inoculação, bem como a colheita de culturas de órgãos radiculares, especialmente de culturas de órgãos radiculares escalonáveis. Portanto, os inventores projetaram um estudo para determinar se o corte em certos tamanhos de fragmento poderia ser tolerado por raízes em cabeleira e, se sim, qual era o comprimento mínimo viável do fragmento para raízes em cabeleira.

[00156] Para este fim, uma cultura de raízes em cabeleira foi cortada manualmente em fragmentos de 2 mm ou 12 mm de comprimento antes do cultivo desses fragmentos em placas de Petri preenchidas com meio solidificado. O cultivo em meio solidificado permitiu o monitoramento de cada fragmento ao longo de todo o comprimento da cultura. Os fragmentos foram divididos em pontas de parte aérea e fragmentos médios, dependendo de sua origem nas raízes em cabeleira predecessoras maiores obtidas a partir da cultura inicial. Por exemplo, uma raiz predecessora de 20 mm pode ser cortada em 2 fragmentos da ponta de parte aérea (correspondentes aos fragmentos que abrangem as pontas da raiz predecessora) e 8 fragmentos médios, cada um com tamanho de 2 mm. Os comprimentos dos fragmentos foram avaliados manualmente, após 12 dias de cultivo em meio solidificado, e uma segunda vez após 20 dias de cultivo em meio solidificado.

[00157] A Figura 7 mostra os resultados deste estudo, com as Figuras 7A, C e E representando o crescimento da ponta de parte aérea e as Figuras 7B, D e F representando o crescimento do fragmento médio. As taxas médias de crescimento foram maiores para fragmentos de 12 mm do que para fragmentos de 2 mm, independentemente da origem dos fragmentos dentro das raízes predecessoras (ver Fig. 7A, B). Além disso, a viabilidade de pedaços de 2 mm variou de apenas 6% a 12%, enquanto a viabilidade de pedaços de 12 mm variou de 60 a 75% (ver Fig. 7C, D). Notavelmente, os fragmentos de fragmento médio de 12 mm (Figura 7D) têm a maior proporção de pedaços viáveis (73-75%). Por conseguinte, o corte de fragmentos de raízes em cabeleira em 2 mm prejudica substancialmente a sua viabilidade, enquanto o corte em pedaços de 12 mm preserva uma quantidade suficiente de fragmentos viáveis.

[00158] Surpreendentemente, as taxas de crescimento mais altas observadas foram para fragmentos viáveis de 2 mm (ver Fig. 7E, F); no entanto, a alta quantidade de biomassa morta obtida ao cortar fragmentos com tamanho de 2 mm torna o corte da biomassa de raiz em cabeleira em fragmentos de 2 mm ou menores inadequado para alcançar altas produtividades de biomassa (confirmando observações anteriores de que o corte leva ao comprometimento do crescimento das raízes em cabeleira), uma vez que na cultura líquida e/ou com corte automatizado, não é possível selecionar fragmentos viáveis, e já que o esforço considerável aplicado ao corte e seleção manual não é viável para culturas sólidas em maior escala. É importante, no entanto, cortar em fragmentos maiores, por exemplo, 12 mm e acima, produz biomassa de raiz em cabeleira adequada para inoculação de cultura líquida em biorreator de qualquer escala.

3. Determinação do comprimento do fragmento de raiz em cabeleira mediante vários regimes de corte automatizado

[00159] Tendo determinado o comprimento mínimo aceitável para o corte de fragmentos de raiz em cabeleira no Exemplo 2, os inventores decidiram determinar um regime de corte automatizado usando um homogeneizador de faca rotativa rápida ou rotor-estator dentro de um vaso de inoculação ou biorreator que melhoraria a escalabilidade, facilidade e eficácia por corte manual anterior em ambiente asséptico. Especificamente, os inventores procuraram determinar se e como as raízes em cabeleira podem ser cortadas em fragmentos usando um dispositivo de corte automático (por exemplo, homogeneizador de faca rotativa rápida ou rotor-estator) para obter fragmentos acima de 2 mm de comprimento.

[00160] A configuração experimental correspondeu à Figura 6, isto é, um vaso de inoculação compreendendo um homogeneizador de faca rotativa rápida (ver Figura 6), no qual foram preenchidas alíquotas de aglomerados de raízes em cabeleira de 5 g de peso fresco (FW) suspensos em 200 ml de meio de crescimento. Após o pré-experimento para estabelecer a potência mínima para fragmentação desses aglomerados de raízes em cabeleira, três regimes diferentes de homogeneização, distinguidos por sua entrada de potência total (por exemplo, tempo de homogeneização), foram testados em homogeneizações triplicadas, ou seja, 0,0008 kWh/g, 0,0016 kWh/g e 0,003 kWh/g. O tamanho do fragmento resultante para esses regimes de homogeneização foi analisado e a distribuição do tamanho do fragmento foi avaliada. Como fragmentos de 2 mm de comprimento ou menos não puderam ser quantificados com segurança por contagem manual, devido ao alto número de fragmentos, a densidade óptica (DO) da fase líquida após a homogeneização também foi medida. Esta medição de DO a 600 nm serviu para estimar a quantidade de células e/ou pequenas partículas liberadas na suspensão, isto é, serviu como uma estimativa do dano tecidual das raízes sofridas como consequência da homogeneização. Quanto maior a DO, menores partículas de tecido e/ou células foram separadas da biomassa radicular e foram suspensas. Essas pequenas partículas de tecido e/ou células liberadas não são consideradas biomassa viável adequada para inoculação de culturas de órgãos radiculares. Consequentemente, valores superiores de DO significam um crescimento prejudicado da cultura.

[00161] A fragmentação foi alcançada com sucesso para todos os regimes de homogeneização e a distribuição do tamanho do fragmento obtida foi altamente reproduzível, apesar da natureza não homogênea dos aglomerados de raízes em cabeleira (ver Figura 3A-C). Os regimes de entrada de energia total mais baixos levam a tamanhos de fragmentos maiores (veja a Fig. 3A-C) e densidades ópticas mais baixas (veja a Fig. 3D) - significando menor quantidade de dano ao tecido e maior viabilidade das raízes. Não houve mais diminuição no tamanho observado ao aumentar a entrada de potência acima da do regime 2 (compare a Fig. 3B com a Fig. 3C), mas a densidade óptica do sobrenadante aumentou (veja a Fig. 3D), indicando uma viabilidade diminuída adicional dos fragmentos obtidos.

[00162] Por conseguinte, o regime de homogeneização com entrada de energia mais baixa (entrada de energia total <8*10A-4 kWh/g FW (peso fresco) de BM (biomassa)) levou a fragmentos viáveis de raízes em cabeleira adequadas para inoculação/colheita de culturas de raízes em cabeleira, demonstrando que a homogeneização mecânica antes, durante ou após a cultura de órgãos radiculares é possível para culturas de raízes em cabeleira.

4. Comparação de diferentes biorreatores da invenção com biorreatores convencionais

[00163] Os biorreatores da invenção foram comparados com um biorreator padrão para avaliar melhorias no rendimento total de biomassa e no rendimento efetivo de biomassa, isto é, o rendimento de biomassa colhível por automação sem o uso de um ambiente asséptico para evitar a contaminação da biomassa.

[00164] Foram testados seis biorreatores diferentes (veja a Figura 9 para representações esquemáticas dos elementos internos dos 6 biorreatores), em que a Configuração 1 era um biorreator padrão e as Configurações 2-6 eram biorreatores da invenção. Todos os biorreatores tinham um volume operacional de 3L e uma câmara de cultivo, uma porta de inoculação com um diâmetro interno de 10 mm; uma porta de colheita (5) com um diâmetro interno de 10 mm localizado na parte inferior do biorreator e duas saídas de aeração. As configurações 2-6 uma faca rotativa rápida ou um rotor-estator localizado na parte inferior do biorreator.

[00165] A configuração 2 apresentou adicionalmente uma matriz de fixação e um cano de submersão com um filtro (frit) de aspersor de metal sinterizado fixado na extremidade submersa. A matriz de fixação consistia em uma malha de aço tubular (aço inoxidável 316L, perfuração: Rv 4-6 DIN 24041). O cilindro da matriz de fixação tinha 450 mm de altura e 65 mm de diâmetro. Ele foi colocado no fundo do biorreator com parafusos fixados concentricamente como espaçadores da parede do biorreator. O ar foi introduzido a partir do lado inferior do cilindro da matriz de fixação através do cano de submersão e do filtro (frit) de aspersor de metal sinterizado.

[00166] A configuração 3 não apresentava matriz de fixação, mas um tubo de sucção que se estendia acima do nível do meio de cultura durante a cultura. O tubo de sucção separou os fragmentos de raiz em cabeleira de todos os elementos adicionais do biorreator (por exemplo, tubo de submersão, filtro de aspersão, etc.). O objetivo do tubo de sucção era simular uma câmara de cultivo separada dentro da câmara de cultivo principal, na qual não poderia ocorrer interferência de outros elementos do reator na biomassa da raiz em cabeleira. O tubo de sucção consistia em um tubo de policarbonato (PC) (altura: 450 mm, diâmetro externo: 70 mm, espessura de parede: 3 mm) com furos em três linhas (200 mm a partir da extremidade superior) e uma malha de aço (malha de 50 μm) cobrindo os furos. Os furos serviram ao propósito de circulação de meio a partir do volume de cultura dentro do tubo de sucção para os outros elementos do biorreator localizados fora do tubo de sucção. O tamanho da malha não permitiu que fragmentos de raiz passassem pelos furos ou fixassem a eles. Portanto, a configuração 3 não continha uma matriz de fixação. O tubo foi colocado no fundo do reator, alcançando acima do nível do líquido. O ar foi introduzido a partir do fundo do vaso através de um filtro de aspersor de metal sinterizado através de uma saída central.

[00167] A configuração 4 apresentou um tubo de sucção que se estende acima do nível do meio de cultura durante a cultura, uma matriz de fixação composta por três discos de suporte de raiz horizontais separando o espaço dentro do tubo de sucção em quatro compartimentos e um filtro (frit) de aspersor de metal sinterizado na parte inferior do reator. Os três discos de suporte de raiz estavam igualmente espaçados entre si e consistiam em placas de aço perfuradas (aço inoxidável 316L, 64x64 mm, espessura: 1,5 mm, tamanho de malha: 5x5 mm). Eles foram montados através de fendas no tubo de sucção, que foi construído como na Configuração 3. Os discos de suporte de raiz atingiram todo o diâmetro do tubo de sucção, formando assim uma plataforma e uma superfície para fixação dos fragmentos de raiz. O tubo de sucção foi colocado na parte inferior do biorreator, como na Configuração 3, alcançando a parte superior do nível de líquido. Por conseguinte, o espaço dentro do tubo de sucção foi dividido em quatro compartimentos de tamanhos iguais, que serviram para distribuir a biomassa de maneira mais uniforme sobre o volume da cultura. O ar foi fornecido pelo aspersor central de metal sinterizado na parte inferior do biorreator. Para esta configuração, foram realizados três experimentos replicados.

[00168] A configuração 5 apresentou um tubo de sucção completamente submerso no meio de cultura durante a cultura, uma matriz de fixação composta por três discos de suporte de raiz horizontais separando o espaço dentro do tubo de sucção em quatro compartimentos, três facas de desprendimento montadas horizontalmente em eixo rotativo central e vertical e um filtro (frit) de aspersor de metal sinterizado na parte inferior do reator. O tubo de sucção e os discos de suporte da raiz da matriz de fixação foram construídos como na Configuração 4, com a diferença de que o tubo de sucção não se estendeu acima do nível do meio de cultura durante a cultura. As facas de desprendimento foram utilizadas tanto durante a inoculação, a fim de melhorar a distribuição da biomassa devido à sua rotação, quanto no final da cultura, para desprendimento das raízes dos discos de suporte das raízes.

[00169] A configuração 6 apresentou um tubo de sucção completamente submerso no meio de cultura durante a cultura, uma matriz de fixação composta por três discos de suporte de raiz horizontais separando o espaço dentro do tubo de sucção em quatro compartimentos, três facas de desprendimento montadas horizontalmente em eixo rotativo central e vertical, e um aspersor que consiste em dois elementos de aspersão, um dos quais era um filtro central localizado centralmente abaixo do tubo de sucção e um dos quais era um aspersor de anel localizado acima do filtro de aspersão e abaixo da extremidade inferior do tubo de sucção. Pelo gaseamento através do aspersor de anel, é alcançado um padrão de fluxo diferente no biorreator para aumentar a distribuição de biomassa em todo o volume da cultura. O tubo de sucção, os discos de suporte da raiz da matriz de fixação e as facas de deprendimento eram idênticos à Configuração 5, com exceção da ausência de furos no tubo de sucção. Para esta configuração, foram realizados três experimentos replicados.

[00170] As culturas foram inoculadas com um inóculo de 300 ml contendo 8-20 g de peso fresco de biomassa, consistindo em fragmentos de raiz em cabeleira cortados e cultivados por 15-42 dias. Onde os biorreatores continham um aspersor, a vazão de ar durante a inoculação e cultura foi ajustada para 10-15 sL/h.

[00171] No final da cultura, o peso fresco da biomassa final e a sacarose total metabolizada durante a cultura foram medidos em gramas. Além disso, o peso fresco da biomassa final foi dividido em biomassa colhível e não colhível. A biomassa anexada às matrizes de fixação e a biomassa em suspensão foi considerada (mecanicamente) biomassa colhível, enquanto a biomassa anexada aos componentes internos do reator que não sejam matrizes de fixação, por exemplo, aspersores, paredes, etc., não foram considerados colhíveis, pois os biorreatores precisam ser abertos para a colheita manual, exigindo um ambiente estéril. O rendimento da biomassa, isto é, a biomassa final total (peso fresco; em gramas) dividido pela sacarose metabolizada (em gramas) variou entre os biorreatores, com as configurações 1 e 4 mostrando os rendimentos mais altos (ver Fig. 10A, barras pretas). Em contraste, a biomassa colhível mecanicamente foi zero para a configuração 1 (o biorreator padrão) e variou entre 20 e 100% do rendimento total de biomassa para os biorreatores da invenção (ver Fig. 10A, linha cinza). As configurações 5 e 6 são especialmente favoráveis em termos de biomassa colhível, com ambas conseguindo uma colheita mecânica de 100% do rendimento total.

[00172] Finalmente, o rendimento efetivo de biomassa, isto é, o rendimento mecanicamente colhível de biomassa (peso fresco) dividido pela sacarose metabolizada, foi calculado multiplicando o rendimento total de biomassa e a porcentagem de biomassa colhível. Todos os biorreatores de acordo com a invenção mostram maiores rendimentos efetivos de biomassa do que o biorreator padrão da Configuração 1, sendo as Configurações 4-6 as mais eficientes (ver Fig. 10B).

Claims (12)

1. Biorreator para o cultivo de culturas de raízes em cabeleira, caracterizado pelo fato de que compreende: uma câmara de cultivo (2); um rotor-estator (6a) localizado na parte inferior do biorreator; uma porta de inoculação (1), em que o diâmetro interno da porta de inoculação (1) é > 10 mm; uma porta de colheita (5), em que o diâmetro interno da porta de colheita (5) é > 10 mm e em que a porta de colheita (5) está localizada na parte inferior do biorreator; e duas saídas de aeração (3, 4), em que uma saída de aeração é para entrada de gás e a outra saída de aeração é para saída de gás; opcionalmente compreendendo adicionalmente um aspersor de gás (7), em que a uma saída de aeração para entrada de gás está conectada ao aspersor de gás (7), uma a quatro saídas para tubos de imersão (8), em que os um a quatro tubos de imersão são para adição de base, adição de alimentação, adição de ácido e/ou amostragem e/ou uma a três portas para sondas (9), em que as sondas são para medir pH, oxigênio dissolvido e/ou condutividade; opcionalmente, em que o volume da câmara de cultivo (2) é de 1-100000 L.

2. Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10a); uma montagem de matriz de fixação rotativa (12); uma lâmina de cisalhamento vertical (11a) para desprendimento da raiz; e um anel de suporte para a lâmina de cisalhamento (13); em que os pontos de fixação na matriz de fixação (10a) são dispostos verticalmente e em que a matriz de fixação (10a) é verticalmente rotativa no suporte da matriz de fixação rotativa (12) e a lâmina de cisalhamento vertical (11a) é estática.

3. Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o biorreator não compreende uma matriz de fixação.

4. Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10b), em que a matriz de fixação (10b) é composta de esferas, as ditas esferas compreendendo um polissacarídeo e um meio de crescimento, opcionalmente em que o polissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em alginato, agarose e gelano e/ou opcionalmente em que as esferas têm um diâmetro de 1-5 mm.

5. Biorreator de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma matriz de fixação (10c); um eixo rotativo central e vertical; múltiplas facas de desprendimento (11b) dispostas horizontalmente; em que a matriz de fixação (10c) é composta por múltiplos discos de suporte de raiz horizontal e em que os ditos discos de suporte de raiz são espaçados em distâncias regulares de > 10 cm, e em que as facas de desprendimento (11b) são montadas horizontalmente no eixo rotativo vertical, de modo que uma faca de desprendimento (11b) está localizada a uma distância de 0,05-5 mm de cada disco de suporte de raiz e em que o número de facas de desprendimento (11b) é igual ao número ou discos de suporte de raiz, opcionalmente em que os vários discos de raiz são treliças de aço inoxidável ou placas perfuradas de aço inoxidável.

6. Biorreator de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um tubo cilíndrico de sucção (14) em que os discos de suporte de raiz horizontais são montados dentro do tubo cilíndrico de sucção (14), em que o tubo cilíndrico de sucção (14) consiste em um cilindro que está totalmente aberto nas extremidades superior e inferior e em que o aspersor de ar (7) consiste em um elemento de aspersão, opcionalmente, em dois elementos de aspersão utilizáveis independentemente, um dos quais está localizado abaixo do centro do tubo de sucção e o outro é um aspersor de anel localizado fora e acima da abertura inferior do tubo de sucção.

7. Método para produção e colheita asséptica de raízes em cabeleira, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de 1) cultivar uma cultura de raízes em cabeleira em um meio de crescimento dentro do biorreator como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; 2) desprender opcionalmente as raízes em cabeleira da cultura de raízes em cabeleira a partir da matriz de fixação dentro do biorreator; 3) deixar as raízes em cabeleira assentarem; 4) cortar as raízes em cabeleira assentadas dentro do biorreator usando o rotor-estator (6a) na parte inferior do biorreator; e 5) remover as raízes em cabeleira cortadas usando a porta de colheita (5);em que as etapas de 1 a 4 são realizadas no interior do biorreator e em que as etapas de 1 a 5 não requerem um ambiente asséptico, opcionalmente em que a etapa de cultivo é realizada por 1 a 12 semanas.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o biorreator é o biorreator como definido na reivindicação 2 e em que a etapa de desprendimento é realizada pelo uso da força de cisalhamento exercida pela lâmina de cisalhamento (11a) na matriz rotativa.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o biorreator é o biorreator como definido nas reivindicações 3, 4, 5 ou 6, em que a etapa de cultivo compreende induzir turbulência por gaseamento da cultura de raízes em cabeleira a 0,2-50 sL/L/h ao longo da etapa de cultivo, em que o gaseamento é feito pelo aspersor de gás (7), opcionalmente, em que o gaseamento é feito com ar estéril com uma composição de 21-30% de O2, 0,04-2% de CO2 e 68-78,96% de N2.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o biorreator é o biorreator como definido na reivindicação 4 e em que a etapa de desprendimento é realizada dissolvendo as esferas da matriz de fixação (10b), opcionalmente em que as esferas da matriz de fixação (10b) são dissolvidas por adição de ácido cítrico ou uma enzima de clivagem de polissacarídeos, opcionalmente em que o ácido cítrico é ácido cítrico 10 mM com um pH de 5-6 e opcionalmente em que a enzima de clivagem de polissacarídeos é selecionada a partir do grupo que consiste em alginato-liase, gelano-liase e beta-agarase.

11. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o biorreator é o biorreator como definido na reivindicação 5 ou 6, em que a etapa de desprendimento é realizada pelo uso da força de cisalhamento exercida pelas lâminas de desprendimento (11b) girando acima dos discos de suporte de raiz.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a etapa de corte é realizada pelo rotor- estator (6a) na parte inferior do biorreator, opcionalmente em que a etapa de corte é realizada a uma temperatura de 0-20 °C, e/ou opcionalmente em que a etapa de remoção é realizada usando uma bomba peristáltica, uma bomba picadora ou uma rosca transportadora ou realizando enxágue com meio de crescimento.