CN111748555A - 一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域。本发明提供了一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10。本发明的sgRNA分值高、脱靶效率低，指导Cas9酶切靶标序列效率高。可以对CsPP2B15基因进行修饰和表达调控，其突变的CsPP2B15基因显著增加了转基因柑橘对黄龙病的抗性，黄龙病症状明显减缓，病原菌含量显著下降。

Description

一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法。

背景技术

柑橘黄龙病是一种***性的病害，所造成的危害是毁灭性的，并且病菌几乎能侵染所有柑橘品种。据统计，柑桔黄龙病已在我国19省区蔓延，受害面积占柑桔总栽培面积的80％以上，产量占总产量的85％左右。柑桔黄龙病病原为韧皮部杆菌属革兰氏阴性细菌，包括亚洲种、非洲种和南美洲种。目前，柑橘生产上尚无从根本上解决柑橘黄龙病病害的技术措施，只能采取销毁发病植株或发病果园等一系列破坏性措施，来彻底清除柑橘黄龙病。对果农来说，经济损失非常严重。

由于柑橘黄龙病问题采用传统手段无法完全解决，因此需要寻找更好的方法。利用抗性种质资源，结合植物基因工程手段挖掘抗病基因，并培育抗病品种增强柑橘对黄龙病的抗性，是最为经济，同时也是从根本上解决这一难题的最为有效的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，从根本上解决黄龙病的威胁，彻底清除柑橘黄龙病。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种改良柑橘的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10。

作为优选，所述sgRNA序列在改良柑橘时作用于柑橘CsPP2B15基因。

本申请还提供了一种改良柑橘的sgRNA在改良柑橘黄龙病抗性中的应用。

本申请还提供了一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，包括如下步骤：

(1)利用sgRNA序列构建CRISPR/Cas9编辑用表达载体；

(2)将步骤(1)构建的表达载体导入到柑橘中，筛选出转基因植株；

(3)从步骤(2)获得的转基因植株中筛选出CsPP2B15突变体植株；

(4)从步骤(3)获得的CsPP2B15突变体植株中筛选出柑橘黄龙病抗性植株。

作为优选，所述步骤(1)中构建载体时所用的载体为pCas9-CsPP2B15sgRNA。

作为优选，所述步骤(1)中构建载体时所用的酶为BamHI/SalI酶。

作为优选，所述导入的方法为根癌农杆菌介导法和电击转化法。

作为优选，所述步骤(2)中所述的转基因柑橘植株筛选方法为抗性筛选、GUS组织化学染色和PCR验证。

作为优选，所述步骤(3)中筛选突变体植株的方法为Sanger测序法和重测序技术。

作为优选，所述步骤(4)中黄龙病抗性植株筛选方法为嫁接传毒、温室症状和切片观察、定量PCR检测。

本发明提供了一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10。本发明的sgRNA分值高、脱靶效率低，指导Cas9酶切靶标序列效率高。可以对CsPP2B15基因进行修饰和表达调控，其突变的CsPP2B15基因显著增加了转基因柑橘对黄龙病的抗性，黄龙病症状明显减缓，病原菌含量显著下降。

附图说明

图1为sgRNA活性体外检测的电泳图；

图2为pGN-CsPP2B15植物表达载体T-DNA结构示意图；

图3为pCas9-PP2B15sgRNA载体T-DNA结构示意图；

图4为OEPP2B5转基因植株PCR检测和植株表型图；

图5为Cas9转基因植株的PCR鉴定结果图；

图6为plGN-CsPP2B15转基因株系中CsPP2B15基因的表达水平；

图7为Cas9介导的CsPP2B15编辑情况测序分析；

图8为超量表达CsPP2B15的转基因柑橘感病后6个月症状情况；

图9为超量表达CsPP2B15的转基因柑橘感病后第6个月和12个月病原菌含量的qPCR分析；

图10为突变体的转基因柑橘感病后6个月症状情况；

图11为突变体的转基因柑橘感病后第6个月和12个月病原菌含量的qPCR分析。

具体实施方式

在本发明中，未做具体说明的试剂药品均为普通市售,材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1 DNA的提取

选取柑橘叶脉0.1～1g，使用Aidlab公司试剂盒(cat.No.DN15)提取柑橘基因组DNA，提取出的DNA于-20℃保存，备用。

实施例2 RNA的提取及cDNA的合成

选取柑桔叶叶脉0.1g用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab，cat.No.RN09)提取叶片总RNA，用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。cDNA第一链的合成按照BIO-RAD iScriptTM cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD，cat.No.170-8891)说明书进行。合成的cDNA于-20保存，备用。

实施例3基因组序列的PCR扩增

(1)25μL的扩增体系为：

(2)扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1.5min，35个循环；72℃延伸10min。

实施例4 DNA片段的回收、连接以及大肠杆菌DH5α的转化

在紫外灯下，用洁净的刀片切下实施例2中的含目的片段的琼脂糖凝胶块，胶回收方法参照试剂盒(购自Omega公司)的使用说明书进行。回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。

酶切体系的建立和反应条件均参考TaKaRa公司限制性内切酶试剂盒的说明书进行。酶切回收的片段，或者扩增获得的回收片段按连接酶试剂盒说明书克隆到pGEM-T/pGEM-T Easy(Promega)载体上。连接反应体系如下：

反应体系中载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比＝1:3；

16℃连接1h，之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，37℃培养。

实施例5 CsPP2B15基因的克隆

CsPP2B15序列从华中农大甜橙基因组数据库CAP(http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/orange/)中获得(Xu,et al.,2013)，Gene ID Cs3g14680.1。根据基因序列设计CsPP2B15基因引物SEQ ID No.11和SEQ ID No.12，分别以感染黄龙病柑橘叶脉cDNA和DNA为模板，PCR扩增CsPP2B15的编码序列CDS(SEQ ID No.13)和基因组序列(SEQ ID No.14)。回收PCR产物，连接pGEM-T easy载体并转化大肠杆菌E.coli DH5^α。挑取阳性克隆进行测序确认。

实施例6 sgRNA体外活性分析

(1)用于检测sgRNA活性的目的片段扩增。

以晚锦橙基因组DNA为模板，以引物CsPP2-f和CsPP2-r扩增目的片段，其中CsPP2-f的序列为SEQ ID No.15，CsPP2-r的序列为SEQ ID No.16，扩增片段长度为890bp，该片段包含目标sgRNA序列。对扩增成功的目的片段进行电泳纯化。

(2)sgRNA活性检测

按如下体系进行sgRNA活性检测。

20μL体外酶切反应体系如下：

用RNase Free Water补足20μL的酶切体系；

37℃反应1h再加入1μL蛋白酶K去除Cas9蛋白酶，在37℃条件下反应20min。酶切产物在1.2％琼脂糖凝胶中120V的电压条件下电泳30min。在UV条件下，用Biospectrum300Imaging system对电泳图谱进行拍照，结果如图1，结果显示十条sgRNA均能指导Cas9酶切靶标序列。

实施例7表达载体的构建

以pGN载体(Zou et al.,2017)为基本骨架，BamH I和Spe I将CsPP2B15基因从pGEM-T easy载体上切下，连入相同酶切处理的pGN载体，转化大肠杆菌，经PCR和酶切验证获得超量表达CsPP2B15的植物表达载体pGN-CsPP2B15，由超量表达启动子35S控制CsPP2B15的表达，所述pGN-CsPP2B15植物表达载体T-DNA结构图如图2所示。其中35S为组成型强启动子；GUS:NPTII为转基因柑橘筛选用标记基因；nos为转录终止序列；LB为T-DNA左臂；RB为T-DNA右臂

选取SEQ ID No.2，SEQ ID No6，SEQ ID No9和SEQ ID No10四条sgRNA构建Cas9表达载体。首先根据选取的sgRNA序列设计引物送公司合成，引物稀释到10mmol·L-1浓度(即常用PCR浓度)，然后每对引物各取10μL混匀退火，使其形成双链DNA。退火程序为：65℃变性30min，然后放置至室温，在避光条件下退火2h，随后，将退火产物连入BbsI酶切回收后的载体puc119-sgRNA，转化大肠杆菌，阳性克隆经PCR和测序验证。获得正确的sgRNA载体后，BamHI/SalI酶切sgRNA载体和pGN-proCas9载体，回收sgRNA表达框片段连入pGN-proCas9载体，转化大肠杆菌，阳性克隆经酶切和测序确认。获得的pCas9-CsPP2B15sgRNA，所述pCas9-CsPP2B15sgRNA如图3所示。其中，35S为组成型强启动子；GUS:NPTII为转基因柑橘筛选用标记基因；nos为转录终止序列；AtU6为拟南芥U6启动子；TTTTT为三型转录终止序列；LB为T-DNA左臂；RB为T-DNA右臂。

实施例8表达载体的导入

1.参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，用电击法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌EHA105。

2.通过根癌农杆菌介导的方法进行柑橘的遗传转化，柑橘遗传转化用培养基成分如表1所示。

表1 根癌农杆菌介导的柑橘遗传转化用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962

3.表达载体通过农杆菌介导上胚轴的方法导入晚锦橙。具体方法如下：

(1)锦橙实生苗上胚轴的获得

取新鲜晚锦橙洗净，用70％酒精表面消毒，在无菌的条件下取出种子，剥掉种皮，接种在MS固体培养基上萌发，28℃下暗培养2周，然后在16h/d的光周期下培养1周。取萌发幼苗上胚轴切成1cm左右的茎段，用于农杆菌介导的遗传转化。

(2)转化农杆菌的制备

用于转染的农杆菌菌液加入30％的无菌甘油保存于-70℃超低温冰箱中。转染前，在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基(0.5％蔗糖(W/V)，0.1％细菌用酵母提取物(W/V)，1％细菌用胰化蛋白胨(W/V)，0.05％MgSO₄·7H₂O(W/V)，pH7.0的1.5％的琼脂粉(W/V)上划线培养。挑农杆菌单菌落，接种于5mL含相同抗生素的LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养过夜。待长出单菌落后，挑取单菌落于50mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；待菌液的OD600达到1时，用不含有卡那霉素的LB液体培养基稀释至0.2，继续振荡培养3h左右；待菌液达到对数生长期(OD为0.5)时，于5000r/min离心10min，弃上清，再悬浮将农杆菌悬浮于ph为5.4的MS液体培养基中用于转染。

(3)晚锦橙上胚轴茎段的转化

将切成1cm左右的晚锦橙上胚轴茎段在农杆菌中浸泡10～15min，然后用无菌的滤纸将上胚轴表明的菌液吸干；将外植体转移到共培养基中，26℃暗培养2d。

(4)转化子的筛选

共培养完成后，将上胚轴转移到筛选培养基中，28℃暗培养7d。然后，将外植体在28℃，16h光照下培养，每两周继代一次。

(5)转化子的成苗培养

待幼芽长到1cm以上时，将其离体嫁接到无菌锦橙实生苗上，在成苗培养基中进行培养；待幼苗长到5cm左右时将其嫁接到枳实生苗上，在温室中进行培养。获得的转基因柑橘在表型和生长发育上与野生型的对照没有明显区别。

实施例9外源基因整合的PCR检测

取柑橘叶片100mg，按照Aidlab公司新型植物基因组DNA快速提取试剂盒说明书操作方法(cat.No.DN15)，提取GUS染色为阳性的转基因植株叶片的总DNA，以引物Cas9-f和Cas9-r，对阳性植株总DNA中的目的基因进行PCR扩增，Cas9-f的序列为SEQ ID No.17，Cas9-r的序列为SEQ ID No.18，鉴定Cas9转基因植株扩增的目标基因为大小约为900bp的Cas9特异片段；35S-f和PP2-r为引物鉴定超量表达CsPP2B15(OPP2B15)转基因植株，扩增片段长为1520bp，5S-f的序列为SEQ ID No.19，PP2-r的序列为SEQ ID No.20。反应体积50μL，PCR反应条件:94℃3min；94℃30s,58℃30s，72℃1min，35次循环；72℃3min。结果见图4和图5。获得超量表达CsPP2B15转基因植株7株，Cas9转基因植株6株。图4中，M为DNA marker，P为质粒，WT为野生型对照，1～7为转基因植株；图5中M为DNA marker，P为质粒，WT为野生型对照，1～6为转基因植株。

实施例10 OEPP2B5转基因植株中CsPP2B15表达的RT-qPCR分析

取柑橘叶片，然后用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab,cat.No.RN09)提取叶脉总RNA。cDNA第一链的合成按照BIO-RAD iScriptTM cDNA Synthesis Kit(BIO-RAD,cat.No.170-8891)说明书进行。用Real-time PCR试剂盒(BIO-RAD iQTM SYBR GreenSupermix,cat.No.170-8882AP)定量分析CsPP2B15基因的表达。检测的引物为qPP2B15-f和qPP2B15-r，qPP2B15-f的序列为SEQ ID No.21，qPP2B15-r的序列为SEQ ID No.22，内标基因actin表达的检测引物为qActin-f和qActin-r，qActin-f的序列为SEQ ID No.23，qActin-r的序列为SEQ ID No.24。反应体积20μL。反应条件：95℃3min，94℃10s；56℃10s，72℃10s，40次循环；72℃10min。试验重复3次，数据用Bio-Rad CFX Manager 2.0软件进行统计分析。采用2^-ΔΔCt法计算转基因植株中抗菌肽基因的相对表达量：定义水处理的样本为参照因子，即其抗菌肽基因的表达水平位1，然后计算黄龙病病原菌接种的同一样本相对于参照因子基因表达的倍数为2^-ΔΔCt，为期相对表达水平。检测结果如图6。结果显示，转基因植株CsPP2B15表达水平明显高于野生型对照，共获得3株(OPP2B15-3、OPP2B15-5、OPP2B15-7)相对表达量10倍以上转基因植株。

实施例11转基因植株的突变体鉴定

提取Cas9转基因植株叶片DNA，根据PP2B15的基因组DNA序列，设计包含不同sgRNA的引物PP2B15sgRNA-f和PP2B15sgRNA-r，所述PP2B15sgRNA-f的序列为SEQ ID No.25，PP2B15sgRNA-r的序列为SEQ ID No.26。PCR扩增出的目的片段进行回收，并将目的片段连接到T载体上，阳性克隆送公司进行sanger测序，筛选突变体。结果如图7所示，6个株系中，3株(mPP2B15-4，mPP2B15-5和mPP2B15-6)展示出较高的编辑效率：达到87.5％～93.3％；而且，三株突变均为S10 sgRNA指导。

实施例12转基因植株黄龙病抗性评价

参照吴柳等(吴柳et al.,2018)的方法，平均每个转基因株系扩繁3株，选取两年生健康转基因嫁接苗叶片为“砧木”、已验证的黄龙病病株叶片为“接穗”，选取相同成熟度已展开的成熟叶进行叶片嫁接。两种叶片均用无菌水冲洗数遍后自然晾干，在距离叶尖端约1.5cm处打孔，孔径大小为7mm，用相同的打孔机在病株叶片上打下同样大小的带黄龙病的叶圆片，将其嫁接到转基因嫁接苗叶片接口处，保证“接穗”叶圆片的中脉与“砧木”叶片的中脉对齐，且侧脉保持一致的生长趋势，用透明胶带将正反面粘贴固定。对照组“接穗”为两年生健康的野生型锦橙嫁接苗的叶片，其余处理同上。处理的植株置于温室培养，定期观察发病情况，提取转基因主脉DNA，以柑橘18S为内参，用定量PCR(qPCR)检测病原菌16S基因的含量，并参照(Zou et al.,2017)等方法计算病原菌含量，以此评价的增殖和扩散。结果如图8、图9、图10和图11所示。其中，WT为对照组，6MAI和12MAI表示传毒后第6月和12月。

结论：抑制CsPP2B15表达是增强柑橘黄龙病抗性的有效策略，超量表达CsPP2B15显著降低了转基因柑橘对黄龙病的抗性，症状加剧，病原菌含量显著上升；而突变CsPP2B15显著增加转基因柑橘对黄龙病的抗性，症状明显减缓，且病原菌含量显著下降。

由以上实施例可知，本发明提供了一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10。本发明的sgRNA分值高、脱靶效率低，指导Cas9酶切靶标序列效率高。可以对CsPP2B15基因进行修饰和表达调控，其突变的CsPP2B15基因显著增加了转基因柑橘对黄龙病的抗性，黄龙病症状明显减缓，病原菌含量显著下降。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catctcctag agatgcgtgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctttcgctt gtctcgtcga 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtgtgggag aaatttttgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ggccgattcc gacaatgtgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcgacgagac aagcgaaagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ccagcggcaa cactaatctt 20

<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgactgaagg aagggtttcc 20

<210> 8

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<212> DNA

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ggtttccagg tccaatagag 20

<210> 9

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<212> DNA

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aagagaactt tcaattacg 19

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<212> DNA

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cttgctcgtt gatttctcta 20

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<212> DNA

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cgcggatcca tgaacgtaga tctgctgcct gaag 34

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cggactagtt cattctttag gtctaatctc aatt 34

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<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgaacgtag atctgctgcc tgaagattgt tttgctcaca ttttatcata cacatctcct 60

agagatgcgt gccggctttc gcttgtctcg tcgacggtac gatttgcggc cgattccgac 120

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cctaaagaat ga 852

<210> 14

<211> 1481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgaacgtag atctgctgcc tgaagattgt tttgctcaca ttttatcata cacatctcct 60

agagatgcgt gccggctttc gcttgtctcg tcgacggtac gatttgcggc cgattccgac 120

aatgtgtggg agaaattttt gccggttgat tatatggaaa ttctcccaag attagtgttg 180

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agtttccatt caaaattttg cttgtcctta taattcaact ttgatggccg aaatttattt 660

aatttattga caaatcttat tgatggtgat tacattaatt aatgattttt cagacttttt 720

ccttagagaa atcaacgagc aagaaacgtt acattctagg tgcaagagaa ctttcaatta 780

cgtgggcaaa caatcctctc tattggacct ggaaaccctt ccttcagtca aggttgcata 840

tatgttcaca tcaactctgt tgaaacgtat ctttaatttg atactcatgc tggatcatca 900

tctatcagct taattttttc cattaatgat ttttttaaca tggtatcata gccaacattt 960

catgtttaaa ctctcactct cacgtattca cttattgttt cagatttaca gaagtagccg 1020

aacttagaac cattagttgg ctacaaataa ctggtaaaat aaacaccaaa accatatcac 1080

caaaaacaca atacgctgcc tacctcatcg ttaaatttgc cgagagagct ttcggattag 1140

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ctagggaacg tgaagatgga tggattgaga ttgaattggg aagtttttac aatgacggag 1380

gtgatggtaa ggaagtggag atgtgcttga aagaagtgaa gggtcagcat ctgaaagggg 1440

gacttattgt tgaaggaatt gagattagac ctaaagaatg a 1481

<210> 15

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agcaaggtta gcgatgtgct 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgacacgctt gtctactcca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcattcttta ggtctaatct 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gctctgagat ctagggtttc cg 22

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cccctttcag atgctgaccc 20

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

catccctcag caccttcc 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccaaccttag cacttctcc 19

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

atgaacgtag atctgctgcc tg 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcattcttta ggtctaatct c 21

Claims (10)

1.一种改良柑橘的sgRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9或SEQ ID No.10。

2.根据权利要求1所述的一种改良柑橘的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA序列在改良柑橘时作用于柑橘CsPP2B15基因。

3.权利要求1所述的一种改良柑橘的sgRNA在改良柑橘黄龙病抗性中的应用。

4.权利要求1所述的一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用sgRNA序列构建CRISPR/Cas9编辑用表达载体；

(2)将步骤(1)构建的表达载体导入到柑橘中，筛选出转基因植株；

(3)从步骤(2)获得的转基因植株中筛选出CsPP2B15突变体植株；

(4)从步骤(3)获得的CsPP2B15突变体植株中筛选出柑橘黄龙病抗性植株。

5.根据权利要求4所述的一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)中构建载体时所用的载体为pCas9-CsPP2B15sgRNA。

6.根据权利要求4所述的一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)中构建载体时所用的酶为BamHI/SalI酶。

7.根据权利要求4所述的一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，其特征在于，所述导入的方法为根癌农杆菌介导法和电击转化法。

8.根据权利要求4所述的一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述的转基因柑橘植株筛选方法为抗性筛选、GUS组织化学染色和PCR验证。

9.根据权利要求4所述的一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)中筛选突变体植株的方法为Sanger测序法和重测序技术。

10.根据权利要求4所述的一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，其特征在于，所述步骤(4)中黄龙病抗性植株筛选方法为嫁接传毒、温室症状和切片观察、定量PCR检测。

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