CN111728194A - 益生菌发酵黄芪的方法及益生菌黄芪发酵液 - Google Patents

Abstract

本发明利用益生菌发酵黄芪，模拟体内微生物转化过程，在体外将大分子物质直接转化为机体利于吸收和利用的小分子物质，快速达到稳态血药浓度，提高药物防治效果。益生菌产生的β‑葡萄糖苷酶将异黄酮苷水解为苷元后脱去糖基，极性减小，脂溶性增加，使苷元在人体内吸收快于苷的吸收。苷元能迅速经小肠吸收入血液循环，较快达到所需血药浓度，发挥其药效作用。本发明采用生物发酵法，利用益生菌将苷类中药转化成苷元，可作为提高中药生物利用度以及提高其药效的一个重要方法，值得中药的推广。

Description

益生菌发酵黄芪的方法及益生菌黄芪发酵液

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更特别地，涉及一种益生菌发酵黄芪的方法及益生菌黄芪发酵液。

背景技术

苷类成分广泛分布于众多植物体内，是人参、三七、黄芪、栀子、黄芩、甘草、牛蒡子、桔梗、柴胡等常用中药材的主要有效成分。中药中的苷类成分有抗炎、解毒、增强免疫、保护血管等诸多功效，近年被报道有抗癌作用。因苷类成分具有诸多重要的药理活性，越来越受到研究者的重视，但天然苷类化合物因含有糖基，分子极性大、分子量大、脂溶性小、不易通过肠壁黏膜吸收，因此并不是药理活性最佳的分子结构。一般认为，被动扩散、脂溶性扩散是药物在消化道内跨膜转运的主要方式。但大多数糖苷类化合物亲脂性低，分子量大，不易進入血脑屏障，但肠道菌群代谢可將糖苷转化为相应苷元、低糖苷或其他产物，使分子极性降低，分子量变小，脂溶性增强，进而发挥药效。

生物发酵法模拟体内微生物转化过程，在体外把药物转化为人体能迅速吸收的有效成分。在发酵转化过程中，植物组织内大多数有效成分也得到了充分地溶出和转化，大幅度提高了药物有效成分含量和药物利用度。将转化的一种或几种已知有效成分直接作用于人体，不仅有利于阐明药物在体内的吸收、分布、代谢、***方式，而且可以明确药物作用机制。生物发酵技术常常在体外能够实现苷类成分的转化，提高了苷类中药中苷元含量，增强了疗效，符合中药现代化发展的方向。目前，利用微生物转化中药，以提高中药的疗效，也是开发口服中药制剂的一个新思路。

益生菌是指在给予人体适当剂量后对人体健康有利的活的微生物。主要分为乳酸菌类和非乳酸菌类。筛选特定益生菌在体外作用于中药黃芪，利用益生菌分泌的酶將中药中的苷水解为苷元后，降低极性，脂溶性增加，增强其在消化道内的的吸收；苷元经小肠吸收入血液循环，发挥其药效作用。当益生菌将苷类降解为苷元的同时，获得了苷类的糖，可作为自我繁殖的碳源。

中药多成分体系中，除含有大量具有药理作用的活性成分外，还含有蛋白质、脂类、微量元素和维生素等营养成分，为益生菌的生长提供多种营养。同时益生菌代谢可以提高中药疗效、减少毒副作用、改变药性、产生新成分、提高利用度等。由此可见利用益生菌对中药进行发酵是中药现代化、创制新药的有效途径，正成为中药研究的热点之一。

黄芪(Astragali Radix)是一味著名的传统中药材，是200多种中药复方中的主要成分，具有保肝、抗氧化、神经保护、促血管舒张等一系列药理作用。黄芪中已被分离并鉴定出的成分超过100种，其中异黄酮是最主要的成分，并被认为是黄芪的主要药理作用和治疗效果的物质基础。

在中药黄芪中，异黄酮苷元大多以糖苷的形式存在。当人体服用中药后，这些苷类化合物属前药形式，需要在肠内微生物转化为苷元或其他代谢物发挥药效。一般认为黄酮类化合物苷元通过被动扩散的形式吸收，而糖苷类物质由于极性大只能先在肠腔中被相应的糖苷水解酶水解为苷元后才能吸收。也有研究认为苷类物质可以由肠细胞上的葡萄糖转运载体转运至细胞内，再由细胞内的β-葡萄糖苷酶水解酶水解脱糖。黄酮类化合物的代谢物极性较大，易被乳腺癌耐药蛋白和多药耐药相关蛋白等排出细胞外。这些因素共同构成生物利用度屏障，使多数黄酮类化合物未能开发成药物。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种益生菌发酵黄芪的方法及益生菌黄芪发酵液。

为实现上述目的，本发明提供一种利用益生菌发酵黄芪的方法，包括以下步骤：

步骤S1：制备黄芪水提液；

步骤S2：活化菌种，制备得到益生菌母液：采用划线平板法将冷冻保藏的益生菌接入到MRS固体培养，置于厌氧培养箱，37℃培养24h，经镜检无杂菌后将其转接到MRS液体培养基，37℃再次培养24h；连续活化三代，将菌株以10％vol的接种量接种到MRS液体培养基中并于37℃培养24h，制备得到益生菌母液备用；

步骤S3：利用步骤S2得到的益生菌母液发酵步骤S1得到的黄芪水提液，得到黄芪发酵液，将黄芪中的异黄酮苷分别转化为其相应的异黄酮苷元。。

在本发明提供的方法中，所述益生菌为植物乳杆菌。

在本发明提供的方法中，在步骤S3中，在植物乳杆菌的β-葡萄糖苷酶的作用下，将黄芪中的毛蕊异黄酮苷和芒炳花苷分别转化为毛蕊异黄酮和芒柄花素。

根据本发明的另一方面，还提供一种根据以上方法获得的益生菌黄芪发酵液，在所述黄芪发酵液中，黄芪中的异黄酮苷分别转化为其相应的异黄酮苷元。

在本发明提供的黄芪发酵液中，所述黄芪发酵液中的异黄酮苷元包括毛蕊异黄酮和芒柄花素。

在本发明提供的黄芪发酵液中，所述毛蕊异黄酮和所述芒柄花素的转化率随发酵时间的延长而增加。

在本发明提供的黄芪发酵液中，所述黄芪发酵液的抗氧化能力随发酵时间的延长而增加。

本发明的益生菌发酵黄芪的方法及益生菌黄芪发酵液，具有以下有益效果：本发明提供一种用益生菌生物转化黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的方法，并进一步根据其转化率筛选出植物乳杆菌作为发酵黄芪的最适宜菌株；本发明建立了毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的HPLC-UV条件，并对转化前后的化学物质进行定量分析，计算其各成分在发酵液的含量，进而对黄芪不同发酵时间各成分的含量变化进行动态监测；本发明提供了植物乳杆菌发酵黄芪48小时内不同发酵时间点下菌液吸光度值、pH值、β-葡萄糖苷酶酶活以及异黄酮转化率的变化趋势；并采用DPPH清除率考察了黄芪发酵前后的体外抗氧化活性，发现黄芪发酵液的抗氧化活性较黄芪水提取液和植物乳杆菌本身均有显著提高；该技术的产品对益生菌发酵黄芪前后化学成分变化的考察以及对发酵液抗氧化活性的初步探索，可用于日后对黄芪发酵液的食品、功能型食品的开发。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图：

图1所示为经发酵48h后，黄芪中的毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷均转化为其苷元毛蕊异黄酮和芒柄花素的指纹图谱，其中，A：空白基质；B；异黄酮混标(1毛蕊异黄酮苷；2芒柄花苷；3毛蕊异黄酮；4芒柄花素)；C：黄芪水提液；D：黄芪发酵液；

图2所示为9种益生菌的转化率；

图3所示为菌株生长曲线，其中，A：β-葡萄糖苷酶活性；B：吸光度值和pH值；

图4所示为植物乳杆菌发酵黄芪过程毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的转化率，其中，A：毛蕊异黄酮苷转化率；B：芒柄花苷转化率；

图5所示为黄芪发酵液清除DPPH能力。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1发酵黄芪化学成分研究

1材料与试剂

1.1药物与试剂

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，ACCC11095)来自于香港科技大学实验室；MRS培养基(批号20190226)购置于青岛高科技工业园区海博生物技术有限公司；中药黄芪(SRI20190312)购自山西省浑源县，经香港科技大学董婷霞教授鉴定为蒙古黄芪(Astragalusmongholicus Bunge)的干燥根；毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷和芒柄花素对照品由香港科技大学中药研发中心实验室提供，经过HPLC-DAD和C13 NMR检测，标准品的纯度为99％。

1.2仪器

Waters 2695HPLC和PDA UV-Vis photodiode array detector(WAT 2996)(Waters,Milford,MA,USA)；厌氧培养箱(上海龙跃LAI-3)；生物安全柜(沪净净化BSC-1300IIA2型)；酶标仪(上海赛默飞世尔Multiskan FC)；精密PH计(Sartorius PB-10)；超低温冰箱(中科美菱DW-HL768)。

2实验方法

2.1黄芪水提液的制备

称取黄芪药材100g，打粉过筛，加8倍量的水煎煮两次，每次2小时。合并两次滤液，在40℃下减压回收溶剂，冻干，即得黄芪药材提取物，将其置于冰箱备用。

2.2菌种的活化

采用划线平板法将冷冻保藏的植物乳杆菌接入到MRS固体培养，置于厌氧培养箱(H₂:10％；CO₂:10％；N₂:80％)，37℃培养24h，经镜检无杂菌后将其转接到MRS液体培养基(固体培养基加2％的琼脂)，37℃再次培养24h。连续活化三代，将菌株以10％vol的接种量接种到MRS液体培养基中并于37℃培养24h，制备得到植物乳杆菌母液备用。

2.3黄芪发酵液的制备

称取黄芪提取物适量，用MRS液体培养基溶解，使提取物的浓度为20mg/mL。按照10％vol接种植物乳杆菌，于37℃恒温震荡培养箱孵育，转速为120r/min，经48h后得到黄芪发酵液。

2.4对照品溶液的制备

分别精密称定毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素适量，置于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。摇匀，制成浓度为1.0mg/mL的对照品母溶，各取适量溶液，制成20μg/mL的对照品混标储备液。

2.5供试样本的处理

吸取黄芪发酵液200μL，加入800μL甲醇震荡30s，高速离心除去沉淀，留取上清液备用。

2.6HPLC-UV检测条件

色谱柱：Grace Alltima C₁₈。柱温：25℃；进样量：10μL。梯度洗脱程序见表1

表1

3实验结果

经发酵48h后，黄芪中的毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷均转化为其苷元毛蕊异黄酮和芒柄花素，其指纹图谱如图1所示。

实施例2菌株的筛选

1材料与试剂

1.1药物与试剂

11种益生菌均来自于香港科技大学深圳研究院菌种保藏库，具体保藏信息见表2。

表2

2实验方法

2.1菌种的活化

划线法将冷冻保藏的11株菌株接入到MRS固体培养基中活化，置于恒温培养箱37℃培养24h，经镜检无杂菌后将其转接到MRS液体培养基，37℃再次培养24h。连续活化三代，将菌株以10％vol的接种量接种到MRS液体培养基中并于37℃培养24h，制备得到11株菌液。

2.2对照品溶液的制备

方法同实施例1项下2.4。

2.3异黄酮苷发酵液的制备

称取毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷适量，用MRS培养基溶解，制备成浓度为20μg/mL的混合溶液。将混合液分作11份，按照1.0×10⁸CFU/mL的菌体浓度分别接种上述11种益生菌，于37℃恒温震荡培养箱孵育36h。

2.4供试样本的处理

方法同实施例1项下2.5。

2.4HPLC-UV条件

方法同实施例1项下2.6

3实验结果

根据HPLC-UV结果，在11种益生菌中不能使毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷转化成其苷元的是德氏乳杆菌保加利亚亚种和发酵乳杆菌，其余9种益生菌的转化率如图2所示。依据异黄酮苷转化率大小，植物乳杆菌是转化这两种苷的最适宜菌株并将其作为发酵黄芪的目标菌株。

实施例3植物乳杆菌发酵黄芪过程中pH值、吸光度值和β-葡萄糖苷酶酶活的变化

1材料与试剂

方法同实施例1中1.1

2实验方法

2.1黄芪水提液的制备

方法同实施例1中2.3

2.1菌种的活化

方法同实施例1中2.2

2.2对照品溶液的制备

方法同实施例1中2.4。

2.3植物乳杆菌发酵液的制备

吸取植物乳杆菌母液，按照浓度约1.0×10⁸CFU/mL接种在MRS培养基中，在37℃恒温震荡培养箱孵育48h。在发酵过程中，采集9(0、3、6、9、12、18、24、36、48h)个时间点的发酵液，置于-80℃冰箱保存备用。

2.4黄芪发酵液的制备

称取黄芪提取物适量，用MRS培养基溶解，制成终浓度为20mg/mL的溶液。按照约1.0×10⁸CFU/mL的接种浓度接种植物乳杆菌，于37℃恒温震荡培养箱孵育48h。在发酵过程中，采集9(0、3、6、9、12、18、24、36、48h)个时间点的黄芪发酵液，置于-80℃冰箱保存。

2.4不同时间点发酵液pH值和吸光度值的测定

取2mL实施例3中2.3和2.4项下采集得到的发酵液样品，测定其PH值以及吸光度值OD_595nm。

2.5不同发酵时间β-葡萄糖苷酶活性的测定。

取0.1mL实施例3中2.3和2.4项下采集的发酵液样品，于12,000rpm离心10min，取上清用于β-葡萄糖苷酶活性测定。活性测定的反应体系为0.5mL，包括0.2mL的PBS(0.1M,pH7.0)，0.1mL发酵液上清溶液和0.2mL浓度为1mM的PNP-β-D-Glu底物溶液。以上溶液混匀后置于37℃培养30min，然后添加0.5mL NaOH溶液(0.5N)终止反应，混匀后于3,000rpm离心10min，取上清测定OD_405nm处的吸收值，各浓度对应吸光度用于制作标准曲线，并用于酶活性的计算。

3实验结果

在48h内，随着发酵时间的延长，样品中的pH值不断降低，OD值着随之升高，并都在发酵24h后趋于稳定。植物乳杆菌发酵液和黄芪发酵液的变化基本相同。培养基中，在37下体外厌氧培养。以培养时间作横坐标，培养基在595nm处的吸光度值和pH值作纵坐标，绘制菌株生长曲线，结果如图3A所示。

在对于β-葡萄糖苷酶的活性方面，随着发酵时间的增长，样品的酶活均增强，并在发酵24h后趋于稳定，其中，相比单独植物乳杆菌发酵液，黄芪发酵液的β-葡萄糖苷酶活性更强，结果如图3B所示。

实施例4黄芪发酵液中四种异黄酮HPLC-UV的方法学验证

1材料与试剂

同实施例1中的1.1

1.2仪器

同实施例1中的1.2

2实验方法

2.1菌种的活化

方法同实施例1中2.2

2.4对照品及内参溶液的制备

分别精密称定毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素适量，置于10mL的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的对照品母溶。各取适量溶液，混合制成20μg/mL的对照品混标储备液。另芦丁10mg适量置于容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成1mg/mL的储备液，最终稀释成20μg/mL的内标溶液。

2.2标准曲线的制备

将对照品混标溶液用甲醇稀释成一系列的质量浓度7.80，15.60，31.25，62.50，125.00，250.00，500.00μg/mL的标准溶液；加入900μL MRS液体培养基空白基质，制备成浓度为0.78，1.56，3.125，6.25，12.5，25.00，50.00μg/mL系列的工作液。

2.4HPLC-UV的检测条件

方法同实施例1中2.6表1

3.0方法学验证

根据FDA guidelines for bioanalytical method validation对建立的方法进行方法学验证，包括线性，灵敏度，精密度，准确度，稳定性，基质效应和提取效率。以标曲样品中四种异黄酮类成分峰面积与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，以各异黄酮浓度为横坐标(X,μg/mL)进行线性回归拟合，权重系数为1/X，求得直线方程，即为标准曲线。分析灵敏度以检出限(LOD,limit of detection)和定量限(LLOQ,lower limit of quantitation)表示，LOD和LLOQ对应信噪比(S/N)分别为3:1和10:1时四种异黄酮的浓度。

将各QC样品一天内进行6次平行测定，且连续测定3天；第一天测定结果的相对误差(RE,relative error)和相对标准偏差(RSD,relative standard deviation)分别用来表示日内准确度和日内精密度(n＝6)；连续3天测定结果的RE和RSD用来表示日间准确度和日间精密度(n＝18)。将各QC样品置于温度为4℃的自动进样器中，48h周期内每隔8h进行一次测定，测定结果的RSD用于表示短期稳定性。

取100μL空白基质溶液，添加900μL甲醇，制备空白基质的甲醇提取液，12,000rpm离心10min后，取适量空白基质的甲醇提取液，并向其中添加适量的四种异黄酮混标溶液和内标溶液，制备与QC样品相同浓度的提取样品；同时采用甲醇对混标溶液进行稀释，制备与QC样品相同浓度的标准品样品。检测并计算QC样品，提取样品和标准品样品中四种异黄酮峰面积与内标峰面积的比值。QC样品和提取样品测定结果的比值及RSD用于表示提取效率(extraction efficiency)；提取样品和标准品样品测定结果的比值及RSD表示用于表示基质效应(matrix effect)。

3实验结果

根据FDA guidelines for bioanalytical method validation对建立的方法进行方法学验证，包括线性，灵敏度，精密度，准确度，稳定性，基质效应和提取效率。

3.1线性考察

四种异黄酮标准曲线线性良好，决定系数(R²)均大于0.99(见表3)。

表3

3.2特异性和灵敏度的考察

以LLOQ表示的分析特异性和灵敏度结果见表4。以相对误差(RE)和相对标准偏差(RSD)表示特异性和灵敏性的范围分别-18.00％-4.74％和3.70％-12.87％，RE低于20％，RSD低于15％，说明特异性和灵敏度良好。

表4

3.3日内/日间的准确度和精密度

通过对3个浓度水平QC样品的分析来测定方法的日内/日间的准确度和精密度。以相对标准偏差(RSD)表示的日内精密度和日间精密度的范围分别是1.15％-4.11％和1.97％-6.78％(表5)。此外，置于4℃自动进样器中的3个浓度水平QC样品中的各异黄酮在48h周期内是稳定的，RSD均低于15％(表5)。

表5

3.4提取率/基质效应/稳定性

提取效率(extraction efficiency)和基质效应(matrix effect)均平行测定6次(n＝6)，测定结果见表6。3个浓度水平QC样品的提取效率良好，低浓度、中浓度和高浓度QC样品的回收率范围分别为85.08-97.91％、98.88-104.97％和114.87-117.41％；没有观察到显着的基质效应，低浓度、中浓度和高浓度QC样品的范围分别为91.29-93.14％、91.53-97.80％和92.27-97.81％，均在80-120％的范围内。此外，提取效率和基质效应的RSD均低于15％。上述参数表明所开发的方法可用于精确测定发酵液中4种异黄酮的含量。

表6

实施例5植物乳杆菌发酵黄芪过程毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的转化率

1材料与试剂

同实施例1中的1.1

2实验方法

2.1黄芪水提液的制备

方法同实施例1中2.3

2.1菌种的活化

方法同实施例1中2.2

2.2对照品溶液的制备

方法同实施例1中2.4。

2.4黄芪发酵液的制备

方法同实施例3中2.4

2.5供试样本的处理

吸取实施例3中2.4项下的发酵9个时间点的样本各200μL，加入800μL甲醇后震荡30s，高速离心除去沉淀，上清液过滤后备用。

2.4HPLC-UV条件

方法同实施例1中2.6

3实验结果

黄芪发酵液中两种异黄酮苷的转化率随着发酵时间的延长，转化率也逐渐增加。其中，芒柄花素在发酵18小时后候的相对含量达到100％，毛蕊异黄酮在发酵48小时后的相对含量也达到95％，如图4所示。

实施例6黄芪发酵液清除DPPH能力的测定

1材料与试剂

同实施例1中的1.1

2实验方法

2.1黄芪水提液的制备

方法同实施例1中2.3

2.1菌种的活化

方法同实施例1中2.2

2.3植物乳杆菌发酵液的制备

吸取植物乳杆菌母液，按照约1.0×10⁸CFU/mL的接种浓度接种在MRS培养基中，在37℃恒温震荡培养箱孵育48小时，菌液经0.22μm的微孔滤膜过滤后置于-80℃冰箱保存。

2.4黄芪发酵液的制备

称取黄芪提取物适量，用MRS培养基溶解，制成终浓度为20mg/mL的溶液。按照约1.0×10⁸CFU/mL的接种浓度接种植物乳杆菌，于37℃恒温震荡培养箱孵育48h。在发酵过程中，采集4(0、9、18、48h)个时间点的黄芪发酵液，置于-80℃冰箱保存。

2.5黄芪发酵液清除DPPH自由基能力的测试

反应体系中加入80μL样品(植物乳杆菌混悬液；黄芪水提取液；黄芪发酵液)，再加入0.8mL 0.5mM DPPH的无水乙醇，震荡充分混匀，在室温下避光反应30min。再于6000rpm离心10min。取其上清，517nm波长处测定样品吸光度(OD_517nm值)。用等体积的生理盐水代替样品溶液作为对照组，并以生理盐水代替样品溶液和用空白甲醇代替DPPH溶液的无水乙醇的混合液作为空白调零。浓度为500μg/mL的维生素C作为阳性药。按照以下公式计算DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率＝[1-OD_517nm(样品)/OD_517nm(空白)]×100％

3实验结果

如图5所示，所有样品都具有消除DPPH自由基能力。黄芪发酵液随着发酵时间的增长，清除率也随之增强，其中，最高可达到80.1％，其清除率高于黄芪水提取液组和植物乳杆菌组且呈现出有极显著性差异(P＜0.01)。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

1、通过益生菌发酵中药黄芪，利用益生菌分泌出的β-葡萄糖苷酶将黄芪中的异黄酮苷水解为苷元，增强黄芪的抗氧化活性。由于苷元在人体内吸收快于苷的吸收，从而可提高中药的生物利用度。

2、本发明首次发现益生菌发酵中药黄芪，可将黄芪中的两种异黄酮苷(毛蕊异黄酮苷和芒炳花苷)分别转化为其相应的异黄酮苷元(毛蕊异黄酮和芒柄花素)。

3、本发明建立了毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮和芒柄花素的HPLC-UV条件，并且对转化前后的化学成分进行液相定量分析，计算其各成分在发酵液的含量，进而对黄芪不同发酵时间各成分的含量变化进行动态监测。

4、本发明利用在单位时间内转化毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的转化率大小，从11株益生菌中，筛选出能转化这两种苷的菌株有9株。其中，植物乳杆菌是作为转化两种异黄酮苷的最佳菌株。

5、本发明考察了植物乳杆菌发酵黄芪在48小时内，不同时间点下发酵液的吸光度值、pH值、β-葡萄糖苷酶活性以及毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的转化率的变化。

6、本发明比较了黄芪发酵前后的体外抗氧化活性，采用DPPH清除率来体现其抗氧化活性的能力，实验结果表明：黄芪发酵液的DPPH清除率较黄芪水提取液和植物乳杆菌发酵液本身均有大幅度的提高。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (7)

1.一种利用益生菌发酵黄芪的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：制备黄芪水提液；

步骤S2：活化菌种，制备得到益生菌母液：采用划线平板法将冷冻保藏的益生菌接入到MRS固体培养，置于厌氧培养箱，37℃培养24h，经镜检无杂菌后将其转接到MRS液体培养基，37℃再次培养24h；连续活化三代，将菌株以10％vol的接种量接种到MRS液体培养基中并于37℃培养24h，制备得到益生菌母液备用；

步骤S3：利用步骤S2得到的益生菌母液发酵步骤S1得到的黄芪水提液，得到黄芪发酵液，将黄芪中的异黄酮苷分别转化为其相应的异黄酮苷元。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述益生菌为植物乳杆菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，在植物乳杆菌的β-葡萄糖苷酶的作用下，将黄芪中的毛蕊异黄酮苷和芒炳花苷分别转化为毛蕊异黄酮和芒柄花素。

4.一种根据权利要求1-3所述的方法得到的益生菌黄芪发酵液，其特征在于，在所述黄芪发酵液中，黄芪中的异黄酮苷分别转化为其相应的异黄酮苷元。

5.如权利要求4所述的黄芪发酵液，其特征在于，所述黄芪发酵液中的异黄酮苷元包括毛蕊异黄酮和芒柄花素。

6.如权利要求5所述的黄芪发酵液，其特征在于，所述毛蕊异黄酮和所述芒柄花素的转化率随发酵时间的延长而增加。

7.如权利要求4所述的黄芪发酵液，其特征在于，所述黄芪发酵液的抗氧化能力随发酵时间的延长而增加。

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