CN111690710A - 一种牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物检测技术领域，公开了一种牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法包括进行牛粪的预处理得到牛粪液；将牛粪液与培养基混合，振荡培养；离心，取上清液作为牛粪样品；取培养基置于厌氧试管中，通入氮气填满试管；吸取牛粪样品加入试管，晃匀；恒温水浴培养后冷藏；试管壁上附着物即牛粪纤维素降解菌菌株；将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中进行发酵培养，离心，取上清液，即为酶液；计算酶液的纤维素酶酶活。本发明对牛粪进行充分处理，最大程度保留牛粪中的纤维素降解菌；在纤维素降解菌提取后进行酶液获取，通过酶液活性实现牛粪纤维素降解菌降解能力判定，判定结果更准确。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法。
背景技术
目前：纤维素是地球上储存量最大的可再生生物质资源，广泛存在于植物的枝叶和茎秆中。纤维素能被具有纤维素降解能力的微生物分解成相关产物，广泛应用于食品、化工、纺织、饲料、酿酒、石油、勘探、药物提取、及生物能源领域。纤维素利用的关键是纤维素降解菌。因此，从自然界中分离筛选降解能力强的纤维素降解菌株非常重要。目前，通过以滤纸为唯一碳源的初筛培养基和羧甲基纤维素钠复筛培养基的方法能够从自然界中分离纯化得到纤维素降解菌。然后对分离出来的纤维素降解菌进行降解能力的判定，从中筛选出具有广泛应用前景的降解能力强的菌株。而目前纤维素降解菌降解能力的判定，一般是通过比较其中纤维素酶活力来进行的。纤维素酶活力的测定方法有很多，包括内切葡聚糖酶活力测定、外切葡聚糖酶活力测定、β-葡萄糖苷酶活力测定和滤纸酶活测定方法。牛粪中含有大量的纤维素分解菌，具有极大的开发应用前景。但是目前进行牛粪中纤维素降解菌测定的方法非常繁琐且过程漫长，为牛粪纤维素降解菌降解能力的判定带来不便。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前进行牛粪中纤维素降解菌测定的方法非常繁琐且过程漫长，为牛粪纤维素降解菌降解能力的判定带来不便。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法。
本发明是这样实现的，一种牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法包括以下步骤：
步骤一，进行牛粪的预处理，得到牛粪液；
所述进行牛粪的预处理包括以下步骤：
(1.1)除去牛粪表面沾染的青草、枝叶、泥沙；
(1.2)对牛粪含水量进行测定，取含水量为65-75％的牛粪置于烧杯中；
(1.3)将盛放牛粪的烧杯置于摇床上，室温下进行振荡培养，得到牛粪固液混合物；
(1.4)将待检测的牛粪样品进行充分搅拌，搅拌至固液融合，得到牛粪液。
步骤二，配制培养基，并将牛粪液与培养基按照一定比例进行混合，将混合物置于摇床上进行振荡培养；
所述培养基配置方法包括：
(2.1)将牛肉膏10g、琼脂20g加入1000ml蒸馏水中，得到基础培养基；
(2.2)在基础培养基中添加葡萄糖5-10g、酵母膏5-8g，缓慢晃匀，得到混合培养基；
(2.3)在混合培养基中缓慢加入预先配置好的盐溶液，得到培养基。
步骤三，将振荡培养后的混合物进行离心，取上清液作为牛粪样品；
所述离心方法包括：
(3.1)将振荡培养后的混合物置于离心机内；控制离心转速变化，升速到2500rpm转速后停止升速；
(3.2)升速结束后保持转速，离心3min；继续提升转速，控制转速变化，升速到4000rpm转速后停止升速；
(3.3)升速结束后保持转速，离心6min，离心完成；控制转速变化，降速到3000rpm转速后后停止降速；
(3.4)降速结束后保持转速不变一段时间；继续降速，控制转速变化，降速到1000rpm转速后后停止降速；降速结束后保持转速不变一段时间；
(3.5)稳速结束后关闭离心机，使转子自由惯性停止；
步骤四，取步骤二配制的培养基置于厌氧试管中，盖好盖子，通入氮气至氮气填满试管；
步骤五，使用注射器吸取牛粪样品加入试管，晃匀；
步骤六，将试管置于35-42℃环境下，恒温水浴培养4h，培养结束后置于5-8℃冷藏3h；
步骤七，取出试管，开盖，刮取试管壁上的附着物，即为牛粪纤维素降解菌菌株；
步骤八，将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中进行发酵培养，培养结束后进行发酵培养液的离心，取上清液，即为酶液；
步骤九，计算酶液的纤维素酶酶活，即为牛粪纤维素降解菌降解能力。
进一步，步骤一中，所述牛粪振荡时间为2-3天。
进一步，步骤二中，所述盐溶液配置方法包括：使用2g MnSO4·4H2O、2g FeSO4·7H2O、2gNaCl，用蒸馏水配成1000ml的盐溶液。
进一步，步骤二中，所述牛粪液与培养基按照质量比为1:8的比例进行混合。
进一步，步骤三中，所述将混合物置于摇床上进行振荡培养具体为：设定培养温度为28℃，振荡频率为200rpm，培养时间为25min。
进一步，步骤四中，所述通入氮气至氮气填满试管前，在试管中加入刃天青，所述刃天青变为无色则试管内氧气已经排尽，氮气填满试管。
进一步，步骤八中，所述将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中进行发酵培养具体为：将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中，设定培养条件为37℃，150rpm培养，培养时间为3天。
进一步，步骤八中，所述进行发酵培养液的离心具体为：将发酵培养液3000rpm离心20min。
进一步，步骤九中，所述计算酶液的纤维素酶酶活前，还进行酶液处理，包括：
1)在试管中加入酶液，晃动后进行水浴加热，保持温度为60℃加热10min；
2)向试管内滴加1mL 2mol/L的NaOH溶液以及2mL DNS显色剂，缓慢晃匀；
3)再次向试管中加入酶液并晃动；
4)将试管置于水中加热10min，取出冷却，用蒸馏水定容至20ml；
5)测定葡萄糖含量。
进一步，步骤九中，所述计算酶液的纤维素酶酶活具体为：
酶活力(u/ml)＝葡萄糖量/10*粗酶液体积；
其中，u为每分钟催化纤维素水解成1ug葡萄糖量的酶量；葡萄糖量单位为mg；10为保温时间。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明对牛粪进行充分处理，最大程度保留牛粪中的纤维素降解菌，避免对其造成的破坏或是不充分提取，能够实现对牛粪纤维素降解菌降解能力判定的准确性的提升；在进行牛粪中纤维素降解菌提取后进行酶液获取，通过酶液活性实现牛粪纤维素降解菌降解能力判定，比菌株筛选后直接进行降解能力的观测计算得到的介入因素更少，判定结果更准确。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法的流程图。
图2是本发明实施例提供的进行牛粪的预处理的流程图。
图3是本发明实施例提供的配制培养基的流程图。
图4是本发明实施例提供的酶液处理的流程图。
图5是本发明实施例提供的不同牛粪纤维素降解菌降解能力的持续时间对比图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法包括以下步骤：
S101，进行牛粪的预处理，得到牛粪液；
S102，配制培养基，并将牛粪液与培养基按照质量比为1:8的比例进行混合，将混合物置于摇床上进行振荡培养；
S103，将振荡培养后的混合物进行离心，取上清液作为牛粪样品；
S104，取步骤S102配制的培养基置于厌氧试管中，盖好盖子，通入氮气至氮气填满试管；
S105，使用注射器吸取牛粪样品加入试管，晃匀；
S106，将试管置于35-42℃环境下，恒温水浴培养4h，培养结束后置于5-8℃冷藏3h；
S107，取出试管，开盖，刮取试管壁上的附着物，即为牛粪纤维素降解菌菌株；
S108，将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中进行发酵培养，培养结束后进行发酵培养液的离心，取上清液，即为酶液；
S109，计算酶液的纤维素酶酶活，即为牛粪纤维素降解菌降解能力。
如图2所示，步骤S101中，本发明实施例提供的进行牛粪的预处理包括以下步骤：
S201，除去牛粪表面沾染的青草、枝叶、泥沙；
S202，对牛粪含水量进行测定，取含水量为65-75％的牛粪置于烧杯中；
S203，将盛放牛粪的烧杯置于摇床上，室温下进行振荡培养，培养时间为2-3天，得到牛粪固液混合物；
S204，将待检测的牛粪样品进行充分搅拌，搅拌至固液融合，得到牛粪液。
如图3所示，步骤S102中，本发明实施例提供的配制培养基具体包括：
S301，将牛肉膏10g、琼脂20g加入1000ml蒸馏水中，得到基础培养基；
S302，在基础培养基中添加葡萄糖5-10g、酵母膏5-8g，缓慢晃匀，得到混合培养基；
S303，使用2g MnSO4·4H2O、2g FeSO4·7H2O、2g NaCl，用蒸馏水配成1000ml的盐溶液；
S304，在混合培养基中缓慢加入盐溶液，得到培养基。
步骤S102中，本发明实施例提供的将混合物置于摇床上进行振荡培养具体为：设定培养温度为28℃，振荡频率为200rpm，培养时间为25min。
步骤S103中，本发明实施例提供的离心方法包括：将振荡培养后的混合物置于离心机内；控制离心转速变化，升速到2500rpm转速后停止升速；升速结束后保持转速，离心3min；继续提升转速，控制转速变化，升速到4000rpm转速后停止升速；升速结束后保持转速，离心6min，离心完成；控制转速变化，降速到3000rpm转速后后停止降速；降速结束后保持转速不变一段时间；继续降速，控制转速变化，降速到1000rpm转速后后停止降速；降速结束后保持转速不变一段时间；稳速结束后关闭离心机，使转子自由惯性停止；
步骤S104中，本发明实施例提供的通入氮气至氮气填满试管前，在试管中加入刃天青，所述刃天青变为无色则试管内氧气已经排尽，氮气填满试管。
步骤S108中，本发明实施例提供的将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中进行发酵培养具体为：将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中，设定培养条件为37℃，150rpm培养，培养时间为3天。
步骤S108中，本发明实施例提供的进行发酵培养液的离心具体为：将发酵培养液3000rpm离心20min。
如图4所示，步骤S109中，本发明实施例提供的计算酶液的纤维素酶酶活前，还进行酶液处理，包括：
S401，在试管中加入酶液，晃动后进行水浴加热，保持温度为60℃加热10min；
S402，向试管内滴加1mL 2mol/L的NaOH溶液以及2mL DNS显色剂，缓慢晃匀；
S403，再次向试管中加入酶液并晃动；
S404，将试管置于水中加热10min，取出冷却，用蒸馏水定容至20ml；
S405，测定葡萄糖含量。
步骤S109中，本发明实施例提供的计算酶液的纤维素酶酶活具体为：
酶活力(u/ml)＝葡萄糖量/10*粗酶液体积；
其中，u为每分钟催化纤维素水解成1ug葡萄糖量的酶量；葡萄糖量单位为mg；10为保温时间。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1：
进行牛粪的预处理，得到牛粪液；配制培养基，并将牛粪液与培养基按照质量比为1:8的比例进行混合，将混合物置于摇床上进行振荡培养；将振荡培养后的混合物进行离心，取上清液作为牛粪样品；取培养基置于厌氧试管中，盖好盖子，通入氮气至氮气填满试管；使用注射器吸取牛粪样品加入试管，晃匀；将试管置于35-42℃环境下，恒温水浴培养4h，培养结束后置于5-8℃冷藏3h；取出试管，开盖，刮取试管壁上的附着物，即为牛粪纤维素降解菌菌株。
将牛粪纤维素降解菌菌株置于盛有羧甲基纤维素钠培养基的培养皿中央，10-35℃培养；培养3-96h，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速率，所得菌丝生长速率值越大表示纤维素降解菌降解能力越强。
实施例2：
进行牛粪的预处理，得到牛粪液；配制培养基，并将牛粪液与培养基按照质量比为1:8的比例进行混合，将混合物置于摇床上进行振荡培养；将振荡培养后的混合物进行离心，取上清液作为牛粪样品；取培养基置于厌氧试管中，盖好盖子，通入氮气至氮气填满试管；使用注射器吸取牛粪样品加入试管，晃匀；将试管置于35-42℃环境下，恒温水浴培养4h，培养结束后置于5-8℃冷藏3h；取出试管，开盖，刮取试管壁上的附着物，即为牛粪纤维素降解菌菌株。
将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中进行发酵培养，培养结束后进行发酵培养液的离心，取上清液，即为酶液；计算酶液的纤维素酶酶活，即为牛粪纤维素降解菌降解能力。
实施例3：
对实施例1和实施例2进行牛粪纤维素降解菌降解能力的过程进行记录，分别统计二者的操作时间、计算难度以及测定的降解结果，对比数据如下表及图5所示。
以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法包括以下步骤：
步骤一，进行牛粪的预处理，得到牛粪液；
所述进行牛粪的预处理包括以下步骤：
(1.1)除去牛粪表面沾染的青草、枝叶、泥沙；
(1.2)对牛粪含水量进行测定，取含水量为65-75％的牛粪置于烧杯中；
(1.3)将盛放牛粪的烧杯置于摇床上，室温下进行振荡培养，得到牛粪固液混合物；
(1.4)将待检测的牛粪样品进行充分搅拌，搅拌至固液融合，得到牛粪液。
步骤二，配制培养基，并将牛粪液与培养基按照一定比例进行混合，将混合物置于摇床上进行振荡培养；
所述培养基配置方法包括：
(2.1)将牛肉膏10g、琼脂20g加入1000ml蒸馏水中，得到基础培养基；
(2.2)在基础培养基中添加葡萄糖5-10g、酵母膏5-8g，缓慢晃匀，得到混合培养基；
(2.3)在混合培养基中缓慢加入预先配置好的盐溶液，得到培养基；
步骤三，将振荡培养后的混合物进行离心，取上清液作为牛粪样品；
所述离心方法包括：
(3.1)将振荡培养后的混合物置于离心机内；控制离心转速变化，升速到2500rpm转速后停止升速；
(3.2)升速结束后保持转速，离心3min；继续提升转速，控制转速变化，升速到4000rpm转速后停止升速；
(3.3)升速结束后保持转速，离心6min，离心完成；控制转速变化，降速到3000rpm转速后后停止降速；
(3.4)降速结束后保持转速不变一段时间；继续降速，控制转速变化，降速到1000rpm转速后后停止降速；降速结束后保持转速不变一段时间；
(3.5)稳速结束后关闭离心机，使转子自由惯性停止；
步骤四，取步骤二配制的培养基置于厌氧试管中，盖好盖子，通入氮气至氮气填满试管；
步骤五，使用注射器吸取牛粪样品加入试管，晃匀；
步骤六，将试管置于35-42℃环境下，恒温水浴培养4h，培养结束后置于5-8℃冷藏3h；
步骤七，取出试管，开盖，刮取试管壁上的附着物，即为牛粪纤维素降解菌菌株；
步骤八，将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中进行发酵培养，培养结束后进行发酵培养液的离心，取上清液，即为酶液；
步骤九，计算酶液的纤维素酶酶活，即为牛粪纤维素降解菌降解能力。
2.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤一中，所述牛粪振荡时间为2-3天。
3.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤二中，所述盐溶液配置方法包括：使用2g MnSO4·4H2O、2g FeSO4·7H2O、2g NaCl，用蒸馏水配成1000ml的盐溶液。
4.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤二中，所述牛粪液与培养基按照质量比为1:8的比例进行混合。
5.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤三中，所述将混合物置于摇床上进行振荡培养具体为：设定培养温度为28℃，振荡频率为200rpm，培养时间为25min。
6.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤四中，所述通入氮气至氮气填满试管前，在试管中加入刃天青，所述刃天青变为无色则试管内氧气已经排尽，氮气填满试管。
7.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤八中，所述将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中进行发酵培养具体为：将牛粪纤维素降解菌菌株置于发酵培养基中，设定培养条件为37℃，150rpm培养，培养时间为3天。
8.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤八中，所述进行发酵培养液的离心具体为：将发酵培养液3000rpm离心20min。
9.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤九中，所述计算酶液的纤维素酶酶活前，还进行酶液处理，包括：
1)在试管中加入酶液，晃动后进行水浴加热，保持温度为60℃加热10min；
2)向试管内滴加1mL 2mol/L的NaOH溶液以及2mL DNS显色剂，缓慢晃匀；
3)再次向试管中加入酶液并晃动；
4)将试管置于水中加热10min，取出冷却，用蒸馏水定容至20ml；
5)测定葡萄糖含量。
10.如权利要求1所述牛粪纤维素降解菌降解能力的判定方法，其特征在于，步骤九中，所述计算酶液的纤维素酶酶活具体为：
酶活力＝葡萄糖溶液体积/10*粗酶液体积。
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