CN111690667A - 一种提高抗菌肽bsn-37抑菌活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高抗菌肽BSN‑37抑菌活性的方法。本发明主要是分别构建SUMO及硫氧还蛋白空白载体，抗菌肽载体，然后将空白载体与抗菌肽BSN‑37利用限制性内切酶BamH I和Xho I分别进行双酶切，制成重组载体质粒，以达到提高抗菌肽溶解性，降低毒性的目的。本发明提供的提高抗菌肽BSN‑37抑菌活性的方法，最终获得的抗菌肽毒性低，溶解度高，且抑菌活性强。

Description

一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)，是动物机体在抵抗外来微生物的入侵时，产生的一类小分子活性多肽。由于抗菌肽大部分多为小肽，因此，氨基酸序列较短，一般为50个左右。在这些氨基酸中，疏水性的大约占50％左右，由于碱性残基过多而带净正电荷，因而抗菌活性更强。抗菌肽的主要优势在于：首先，它们具有广谱的抗菌活性以及良好的稳定性；其次，它们主要针对的是机体的微生物膜，可以阻碍微生物对其产生耐药性。因此，这些肽被认为是有希望的候选新抗生素。
有些抗菌肽本身抗菌性不佳，且溶解性差，现在通常会采用将抗菌肽与其他蛋白融合，形成重组质粒，以提高其溶解性。
硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)，是一种用于分泌表达的载体蛋白。该蛋白热稳定性好，可以被过度表达，即使在高浓度也可以保持其溶解性，它被用来提高溶解度和促进许多哺乳动物细胞因子的表达，降低重组蛋白被宿主蛋白酶降解的可能，催化二硫键的形成；以前是存在于包涵体中，分析融合蛋白是如何抵抗形成包涵体的，表明高可溶性Trx不聚集，并允许正确折叠融合蛋白，超过25％的抗菌肽表达都是以Trx作为融合标签。最近的一项研究表明，在检测的13种不同载体蛋白中，硫氧还蛋白融合的肽段绝对产量最高，尽管其整体表达水平并不是最高的。
麦芽糖结合蛋白(MBP)，它的分子量约为(142.5kDa)，是一种用于提高溶解度的同源大肠杆菌蛋白标签，显著大于GST(26kDa)和Trx(11.8kDa)，然而，在这三种标签中，MBP表现出最大的增溶作用，以及伴侣行为。
而泛素化相关小分子蛋白(SUMO)，研究发现：它比MBP具有更好的增溶效果，可以提高蛋白的折叠性和溶解性。这一方面的机制目前尚不清楚，但推测其可能具有类似泛素的伴侣作用。或者它可以作为融合蛋白正确折叠的核心，SUMO的分子量小(11.2kDa)，可以将抗菌肽的最终产量提高。此外，具有高度特异性的SUMO蛋白酶的存在促进了其他蛋白/肽的高效释放，为该***提供了独特的优势。
综上所述，现有的抗菌肽普遍存在溶解性低、毒性大，进而容易导致抗菌效果差的缺点。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺点，本发明创造性的提供了一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法。该方法将抗菌肽BSN-37与其他蛋白融合，构成重组质粒，最终达到提高溶解性，降低毒性，并可显著提高抗菌肽的抗菌性能的效果。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法，包括如下步骤：
S1、构建含有BSN-37基因序列的质粒PUC-BSN-37；
S2、将步骤S1构建的质粒PUC-BSN-37导入空载体pCold-SUMO-硫氧还蛋白，得重组质粒；
S3、将步骤S2制得的重组质粒用无菌水稀释至25ng/μL，向其中加入由糖皮质激素及丹参提取物按质量比1～2：7～9组成的混合物，即可。
优选地，所述抗菌肽BSN-37的氨基酸序列信息如SEQ ID NO.1所示。
FRPPIRRPPIRPPFYPPFRPPIRPPIFPPIRPPFRPP(SEQ ID NO.1)
优选地，所述PUC-BSN-37质粒的构建过程为：根据氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的特性，反向翻译出其基因片段，加上限制性内切酶BamH I和Xho I、GST标签、终止子和保护碱基，合成BSN-37的基因，大小为126bp，并将其克隆在PUC57载体中，即得。
优选地，所述BSN-37基因序列信息如SEQ ID NO.2所示，所述加上限制性内切酶BamH I和Xho I、GST标签、终止子和保护碱基后的BSN-37的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
TTCCGTCCACCAATCCGTCGTCCTCCAATCCGCCCACCATTCTACCCACCATTCCGTCCTCCAATCCGTCCACCAATCTTCCCACCAATCCGTCCACCATTCCGTCCACCA(SEQ ID NO.2)
GGATCCTTCCGTCCACCAATCCGTCGTCCTCCAATCCGCCCACCATTCTACCCACCATTCCGTCCTCCAATCCGTCCACCAATCTTCCCACCAATCCGTCCACCATTCCGTCCA CCACTCGAGTTA(SEQ ID NO.3)
优选地，步骤S2中重组质粒的构建过程为：
(1)根据酶切位点BamH I和Xho I设计扩增BSN-37基因序列的引物，并利用PCR技术扩增目的片段，将目的基因测序并酶切纯化，得经酶切的目的片段；
(2)将载体pCold-SUMO-硫氧还蛋白甘油菌划线于Amp平板上，于37℃下培养13-15h，然后挑取单个菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养15h，利用试剂盒提取质粒，并用相同的酶切，得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒；
(3)将步骤(1)所得经酶切的目的片段与步骤(2)所得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒连接，即得。
优选地，所述步骤(1)中扩增BSN-37基因序列的引物为Primer-BSN，上游引物为Primer-BSN-F，序列信息如SEQ ID NO.4所示，下游引物为Primer-BSN-R，序列信息如SEQID NO.5所示；
5’-ATCCTCGAGGTTCCGTCCACCAATCCGTCGT-3’(下划线为Xho I酶切位点)(SEQ IDNO.4)
5’-CCCAAGCTTTTATGGTGGACGGAATGGTGGACG-3’(下划线为Hind III酶切位点)(SEQID NO.5)
所述PCR技术的扩增过程为：配制20μL的PCR反应体系，包含2×Taq PCR MasterMix 10μL，Primer-BSN-F 2μL，Primer-BSN-R 2μL，步骤S1所得质粒PUC-BSN-37 2μL，双蒸水4μL；反应条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，38个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
所述酶切过程为，将经PCR技术获得的目的基因PUC-BSN-37 10μL，10×Greenbuffer 3μL，Xho I 1.5μL，Hind III 1.5μL，双蒸水4μL配成20μL的酶切体系，于36℃条件下酶切2h，经测序鉴定序列信息及长度，即可。
优选地，所述步骤(2)中的酶切过程为：pCold-SUMO-硫氧还蛋白2μL，10×Greenbuffer 3μL，Xho I 1.5μL，Hind III 1.5μL，双蒸水4μL配成20μL的酶切体系，于36℃条件下酶切2h，经测序鉴定序列信息及长度，即可。
优选地，所述步骤(3)中的连接过程为：取步骤(1)所得经酶切的目的片段6μL，步骤(2)所得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒8μL，T4 DNA Ligease 1.5μL，10×Ligation buffer 2.5μL，双蒸水2μL，配制成20μL的连接体系，放入金属浴中，于16℃连接6h，经测序鉴定，即可。
优选地，所述由糖皮质激素及丹参提取物按体积比1～2：7～9组成的混合物的加入量为总体积的0.1～0.15％。
本发明中，将抗菌肽BSN-37导入载体pCold-SUMO-硫氧还蛋白，构建成重组质粒，这是首次将抗菌肽与两种蛋白融合，结果发现，该重组质粒的溶解性极佳，且可以降低其在实际应用过程中产生的毒副作性。同时，本发明还意外发现，将重组质粒溶解后，向溶液中滴加由糖皮质激素及丹参提取物按质量比1～2：7～9组成的混合物可以提高抗菌肽BSN-37的杀菌作用，为新型抗菌药物的研发提供了新的方向。
与现有技术相比，本发明提供的提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法具有如下优势：
(1)本发明提供的提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法，将抗菌肽与载体pCold-SUMO-硫氧还蛋白混合，构建重组质粒，提高了溶解性，降低了抗菌肽在应用过程中的毒性；
(2)本发明提供的提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法，还可以显著提高杀菌作用；
(3)本发明提供的提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法，操作过程简单，制备成本低，为相关抗菌药物的研发提供了新方向。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
所述抗菌肽BSN-37由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；所述pCold-SUMO-硫氧还蛋白是将硫氧还蛋白克隆至pCold-SUMO载体所得，由上海名劲生物科技有限公司制成；所述糖皮质激素可购自上海一基实业有限公司，货号为BN65497170；所述丹参提取物湖北信康医药化工有限公司。
实施例1一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法
所述提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法，包括以下步骤：
S1、构建含有BSN-37基因序列的质粒PUC-BSN-37；
根据氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的特性，反向翻译出其基因片段，加上限制性内切酶BamH I和Xho I、GST标签、终止子和保护碱基，合成BSN-37的基因，大小为126bp，并将其克隆在PUC57载体中，即得。
S2、将步骤S1构建的质粒PUC-BSN-37导入空载体pCold-SUMO-硫氧还蛋白，得重组质粒；
(1)根据酶切位点BamH I和Xho I设计扩增BSN-37基因序列的引物，并利用PCR技术扩增目的片段，将目的基因测序并酶切纯化，得经酶切的目的片段；所述扩增BSN-37基因序列的引物为Primer-BSN，上游引物为Primer-BSN-F，序列信息如SEQ ID NO.4所示，下游引物为Primer-BSN-R，序列信息如SEQ ID NO.5所示；
5’-ATCCTCGAGGTTCCGTCCACCAATCCGTCGT-3’(下划线为Xho I酶切位点)(SEQ IDNO.4)
5’-CCCAAGCTTTTATGGTGGACGGAATGGTGGACG-3’(下划线为Hind III酶切位点)(SEQID NO.5)
所述PCR技术的扩增过程为：配制20μL的PCR反应体系，包含2×Taq PCR MasterMix 10μL，Primer-BSN-F 2μL，Primer-BSN-R 2μL，步骤S1所得质粒PUC-BSN-37 2μL，双蒸水4μL；反应条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，38个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
所述酶切过程为，将经PCR技术获得的目的基因PUC-BSN-37 10μL，10×Greenbuffer 3μL，Xho I 1.5μL，Hind III 1.5μL，双蒸水4μL配成20μL的酶切体系，于36℃条件下酶切2h，经测序鉴定序列信息及长度，即可；
(2)将载体pCold-SUMO-硫氧还蛋白甘油菌划线于Amp平板上，于37℃下培养13-15h，然后挑取单个菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养15h，利用试剂盒提取质粒，并用相同的酶切，得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒；具体的酶切过程为：pCold-SUMO-硫氧还蛋白2μL，10×Green buffer 3μL，Xho I 1.5μL，Hind III 1.5μL，双蒸水4μL配成20μL的酶切体系，于36℃条件下酶切2h，经测序鉴定序列信息及长度，即可；
(3)将步骤(1)所得经酶切的目的片段与步骤(2)所得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒连接，即得；连接过程为：取步骤(1)所得经酶切的目的片段6μL，步骤(2)所得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒8μL，T4 DNA Ligease 1.5μL，10×Ligation buffer2.5μL，双蒸水2μL，配制成20μL的连接体系，放入金属浴中，于16℃连接6h，经测序鉴定，即可；
S3、将步骤S2制得的重组质粒用无菌水稀释至25ng/μL，向其中加入由糖皮质激素及丹参提取物按体积比1：7组成的混合物，加入量为总体积的0.1％，即得。
实施例2一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法
所述提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法与实施例1类似；
与实施例1的区别在于，实施例2中的步骤S3中加入的混合物由糖皮质激素及丹参提取物按质量比2：9组成，加入量为重量的0.15％。
实施例3一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法
所述提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法与实施例1类似；
与实施例1的区别在于，实施例3中的混合物由糖皮质激素及丹参提取物按体积比1.5：8组成，加入量为总体积的0.13％。
对比例1一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法
所述提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法与实施例3类似；
与实施例1的区别在于，对比例1中的混合物由糖皮质激素及丹参提取物按体积比1：1组成。
对比例2一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法
所述提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法与实施例3类似；
与实施例1的区别在于，对比例2中不包含由糖皮质激素及丹参提取物组成的混合物。
试验例1溶解性试验
1.试验样品：抗菌肽BSN-37，硫氧还蛋白，SUMO，实施例1制得的重组质粒
2.试验方法：取上述试验样品各0.05g，加入10mL双纯水，在溶液保持澄清的前提下，测定各样品的溶解率。
溶解率＝(溶解前样品重量-溶解后样品重量)/溶解前样品重量×100％
3.试验结果：具体试验结果见表1。
表1不同试验样品的溶解性对比
试验样品 溶解前样品重量/g 溶解后样品重量/g 溶解率/％
抗菌肽BSN-37 0.05 0.0125 75％
硫氧还蛋白 0.05 0.06 68％
SUMO 0.05 0.0175 65％
重组质粒 0.05 0.0015 97％
由表1可知，与其他试验组相比，本发明实施例1制得的重组质粒的溶解率最高，可达97％，而单个蛋白质或多肽的溶解率明显降低。
试验例2活性测定试验
1.试验样品：采用本发明实施例1-3及对比例1-2制得的抗菌肽；
2.试验方法：分别取用MH培养基培养的处于对数生长期的菌株，大肠杆菌ATCC25922，铜绿假单孢菌ATCC27853，绿脓杆菌ATCC15422，用生理盐水稀释至0.5麦氏标准浓度单位，取1mL菌液均匀涂布于LB平板；待菌液扩散20min后，将无菌空白的药敏纸片贴于平板表面，各纸片中心之间距离为25mm，纸片距平板內缘为18mm，取试验样品各40μL加在每一个纸片上，于37℃倒置培养18h后观察结果，量取抑菌圈直径。
3.试验结果：具体试验结果见表2。
表2不同试验样品的抑菌圈直径对比
Figure BDA0002526970000000081
由表1可知，本发明实施例1-3所述方法制得的重组质粒溶解后，抑菌圈直径较高，表明活性高，尤其是实施例3组，对三种菌株的抑菌性均最佳，故实施例3为本发明的最佳实施例，而对比例1-2由于改变了抗菌肽溶解后加入的混合物中各组分的含量，或将其去掉，导致活性大大降低，抑菌效果也变差。
最后应当说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 广州颜如玉生物科技有限公司
<120> 一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法
<130> 2020.5.26
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> BSN-37的氨基酸序列(Amino acid sequence of BSN-37)
<400> 1
Phe Arg Pro Pro Ile Arg Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Phe Pro Pro Ile Arg Pro
20 25 30
Pro Phe Arg Pro Pro
35
<210> 2
<211> 111
<212> DNA
<213> BSN-37基因序列(BSN-37 gene sequence)
<400> 2
ttccgtccac caatccgtcg tcctccaatc cgcccaccat tctacccacc attccgtcct 60
ccaatccgtc caccaatctt cccaccaatc cgtccaccat tccgtccacc a 111
<210> 3
<211> 126
<212> DNA
<213> 经保护碱基等修饰后的BSN-37基因序列(BSN-37 gene sequence modified byprotected bases etc)
<400> 3
ggatccttcc gtccaccaat ccgtcgtcct ccaatccgcc caccattcta cccaccattc 60
cgtcctccaa tccgtccacc aatcttccca ccaatccgtc caccattccg tccaccactc 120
gagtta 126
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Primer-BSN-F
<400> 4
atcctcgagg ttccgtccac caatccgtcg t 31
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Primer-BSN-R
<400> 5
cccaagcttt tatggtggac ggaatggtgg acg 33

Claims (9)

1.一种提高抗菌肽BSN-37抑菌活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建含有BSN-37基因序列的质粒PUC-BSN-37；
S2、将步骤S1构建的质粒PUC-BSN-37导入空载体pCold-SUMO-硫氧还蛋白，得重组质粒；
S3、将步骤S2制得的重组质粒用无菌水稀释至25ng/μL，向其中加入由糖皮质激素及丹参提取物按质量比1～2：7～9组成的混合物，即可。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗菌肽BSN-37的氨基酸序列信息如SEQID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PUC-BSN-37质粒的构建过程为：根据氨基酸序列和大肠杆菌偏爱密码子的特性，反向翻译出其基因片段，加上限制性内切酶BamHI和Xho I、GST标签、终止子和保护碱基，合成BSN-37的基因，大小为126bp，并将其克隆在PUC57载体中，即得。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述BSN-37基因序列信息如SEQ ID NO.2所示，所述加上限制性内切酶BamH I和Xho I、GST标签、终止子和保护碱基后的BSN-37的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中重组质粒的构建过程为：
(1)根据酶切位点BamH I和Xho I设计扩增BSN-37基因序列的引物，并利用PCR技术扩增目的片段，将目的基因测序并酶切纯化，得经酶切的目的片段；
(2)将载体pCold-SUMO-硫氧还蛋白甘油菌划线于Amp平板上，于37℃下培养13-15h，然后挑取单个菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养15h，利用试剂盒提取质粒，并用相同的酶切，得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒；
(3)将步骤(1)所得经酶切的目的片段与步骤(2)所得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒连接，即得。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中扩增BSN-37基因序列的引物为Primer-BSN，上游引物为Primer-BSN-F，序列信息如SEQ ID NO.3所示，下游引物为Primer-BSN-R，序列信息如SEQ ID NO.4所示；
所述PCR技术的扩增过程为：配制20μL的PCR反应体系，包含2×Taq PCR Master Mix10μL，Primer-BSN-F 2μL，Primer-BSN-R 2μL，步骤S1所得质粒PUC-BSN-37 2μL，双蒸水4μL；反应条件为95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，38个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
所述酶切过程为，将经PCR技术获得的目的基因PUC-BSN-37 10μL，10×Green buffer3μL，Xho I 1.5μL，Hind III 1.5μL，双蒸水4μL配成20μL的酶切体系，于36℃条件下酶切2h，经测序鉴定序列信息及长度，即可。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的酶切过程为：pCold-SUMO-硫氧还蛋白2μL，10×Green buffer 3μL，Xho I 1.5μL，Hind III 1.5μL，双蒸水4μL配成20μL的酶切体系，于36℃条件下酶切2h，经测序鉴定序列信息及长度，即可。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的连接过程为：取步骤(1)所得经酶切的目的片段6μL，步骤(2)所得经酶切的pCold-SUMO-硫氧还蛋白质粒8μL，T4 DNALigease 1.5μL，10×Ligation buffer 2.5μL，双蒸水2μL，配制成20μL的连接体系，放入金属浴中，于16℃连接6h，经测序鉴定，即可。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述由糖皮质激素及丹参提取物按体积比1～2：7～9组成的混合物的加入量为总体积的0.1～0.15％。
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