CN111671784A - 一种可用于预防、治疗非酒精性脂肪肝的产品 - Google Patents

一种可用于预防、治疗非酒精性脂肪肝的产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于预防、治疗非酒精性脂肪肝的产品，属于生物医药技术领域。本发明制备的肉豆蔻提取物能够抑制肝脏细胞LO2脂肪酸的合成、抑制肝脏细胞LO2脂肪酸合成酶基因FASN，固醇调节元件结合蛋白基因SREBP‑1c的表达，改善肝功能，调节脂代谢，改善肝脏炎症反应，增强小鼠免疫功能，调节肝脏脂质代谢，降低肝脏脂质堆积，有助于预防和/或非酒精性脂肪肝。

Description

一种可用于预防、治疗非酒精性脂肪肝的产品
技术领域
本发明涉及一种可用于预防、治疗非酒精性脂肪肝的产品，属于生物医药技术领域。
背景技术
非酒精性脂肪肝是一种以肝细胞内脂肪过度积累为特征的疾病。它通常与严重肥胖和慢性低度炎症有关。非酒精性脂肪性肝病的临床病理综合征的特点是弥漫性肝细胞伴肝细胞球囊化，肝内炎症和进行性纤维化。根据非酒精性脂肪性肝的病理变化可分为单纯脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化，纤维化甚至发展成肝癌。持续肝脂肪浸润和炎症反应可增加肝硬化和肝癌的发生率。此外，非酒精性脂肪性肝促进血脂异常的发展，并显著增加心血管疾病的发病率。非酒精性脂肪性肝进程发生的机制尚不清楚，尽管人们普遍认为它至少有两部分组成，即“二次打击”学说。脂肪代谢紊乱引起的肝脏脂肪堆积是引起肝脏脂肪变性的各种原因中的常见机制，其次是免疫细胞活化和炎症细胞因子产生。
研究表明，患有非酒精性脂肪性肝的肥胖患者脂质代谢下降，但脂肪酸合成增加。脂肪酸合成酶基因(FASN)以及上游固醇调节元件结合蛋白酶-1c(SREBP-1c)在脂肪酸代谢中起着重要的作用，激活上游磷酸腺苷蛋白酶(AMPK)加速能量代谢，而FASN的抑制导致脂肪酸合成途径减少。因此它已成为干预过度脂质积累引起的非酒精性脂肪性肝的有力靶点。持续过量的游离脂肪酸参与了脂肪变性的发病机制，并导致非酒精性脂肪性肝相关的代谢并发症，如炎症反应。肝脏长期暴露于过量的游离脂肪酸中可能导致细胞内甘油三酯的积累，并损害胰岛素功能，进一步影响血糖水平。过量的脂肪酸以VLDL的形式促进TG的分泌，并增加肝脏的新生脂肪生成，导致肝毒性产生，并诱导肝脏持续产生炎症因子，影响肝脏功能。通过抑制脂肪酸合成可以抑制肝癌细胞增殖生长，降低存活率。因此，调控脂质代谢成为减肥降脂，抑制炎症反应，恢复肝脏功能，改善非酒精性脂肪肝的有力手段。
目前，通过限制饮食中的能量摄入(如低糖，低脂等)或进行适量运动可以在一定程度上预防非酒精性脂肪肝，但是干预程度是很有限的。随着现代生活节奏的加快，社会工作压力的增加，饮食和睡眠的不规律增加了非酒精性脂肪肝的发病率。然而药物治疗又会伴随着一系列的副作用的产生，对身体产生一定程度的损伤。因此，亟待研发一种既可以预防又可以治疗非酒精性脂肪肝的产品以解决此问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种既能够减轻体重，降低血脂，减少肝脏脂质堆积；又能够调节炎症反应，降低并发症的产生；且毒副作用小的可于预防/治疗非酒精性脂肪肝的产品。
本发明提供了肉豆蔻提取物在制备预防/治疗非酒精性脂肪肝的产品中的应用。
在一种实施方式中，所述肉豆蔻提取物是按如下步骤制备而成：
(1)将煨制后的肉豆蔻粉碎，研磨，过筛；
(2)将步骤(1)过筛后的肉豆蔻粉用乙醇溶液浸提至少10h，重复2～3次；
(3)将每次的提取物混合后，真空过滤，浓缩，制得肉豆蔻提取物。
在一种实施方式中，所述肉豆蔻提取物溶解在溶剂中。
在一种实施方式中，所述溶剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)或质量分数为0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC)。
在一种实施方式中，所述肉豆蔻提取物的制备方法如下：
(1)将煨制后的肉豆蔻粉碎，用机械研磨机粉碎研磨，过200目筛；
(2)将步骤(1)过筛后的肉豆蔻粉用75％乙醇在37℃下浸提12h，过滤回收药渣，重复浸提步骤3次；
(3)将3次提取物混合，真空过滤；
(4)过滤后的液体在旋转蒸发器中浓缩，蒸干，溶解在溶剂中；所述溶剂包括但不限于二甲基亚砜(DMSO)或质量分数为0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC)。
在一种实施方式中，所述预防/治疗非酒精性脂肪干具体表现为(a)～(f)中的至少一种情况：
(a)降低游离脂肪酸引起的炎症反应；
(b)抑制肝细胞脂质合成和巨噬细胞炎症反应；
(c)降低血脂；
(d)降低血糖，改善葡萄糖耐量；
(e)减少肝脏脂质合成；
(f)调节肝脏脂质代谢和/或降低肝脏脂质堆积；
(g)改善肝脏功能；
(h)抑制肝癌细胞增殖，降低癌细胞存活率。
在一种实施方式中，所述产品为功能性食品。
本发明的第二个目的是提供一种预防、治疗非酒精性脂肪肝的药物组合物，所述药物组合物含有前述的肉豆蔻提取物。
在一种实施方式中，所述肉豆蔻提取物溶于乙醇溶液、二甲基亚砜(DMSO)或质量分数为0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC)溶液中。
在一种实施方式中，所述药物组合物中肉豆蔻提取物的含量不低于200mg/kg。
在一种实施方式中，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。
在一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述填充剂为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。
本发明还要求保护所述肉豆蔻提取物在制备非医疗目的的保健产品中的应用。
有益效果：
(1)本发明以肉豆蔻为原料，制备了肉豆蔻提取物，该提取物能够抑制肝脏细胞LO2脂肪酸的合成，降低小鼠巨噬细胞RAW264.7由游离脂肪酸引起的炎症反应，抑制小鼠肝脏细胞LO2脂肪酸合成酶基因FASN，固醇调节元件结合蛋白基因SREBP-1c的表达。与对照组相比，使FASN基因与SREBP-1c基因的表达量显著降低，可见，本发明的产品对体外小鼠肝细胞脂质合成和巨噬细胞炎症反应的抑制效果较好。
(2)可以有效抑制鼠肝癌细胞Hepa1-6体外增殖，显著优于已报道的抑制水平。
(3)本发明的肉豆蔻提取物能使小鼠体重减轻，血脂降低，肝脏脂质明显减少，血糖水平改善，肝功能改善，预防和/或非酒精性脂肪肝的效果强。
(4)灌胃本发明制备的肉豆蔻提取物后的小鼠肝脏中的炎症因子IL-6、TNFα含量在非酒精性脂肪肝模型16周时，IL-6、TNFα呈现出显著的降低。可见，本发明的肉豆蔻提取物可改善肝脏炎症反应，增强小鼠免疫功能。
(5)灌胃本发明制备的肉豆蔻提取物后的小鼠肝脏中FASN和SREBP-1c的蛋白表达量较模型对照组小鼠显著下调，pAMPK-α/AMPK-α的表达量与对照组小鼠相比显著上调，可见，本发明的肉豆蔻提取物能够调节小鼠肝脏脂质代谢，降低肝脏脂质堆积。
附图说明
图1不同肉豆蔻醇提物浓度对LO2肝细胞存活率的影响。
图2不同肉豆蔻醇提物浓度对LO2肝细胞FASN和SREBP-1c基因的影响。
图3不同肉豆蔻醇提物浓度对LO2肝细胞FASN基因表达量的影响。
图4不同肉豆蔻醇提物浓度对LO2肝细胞SREBP-1c基因表达量的影响。
图5肉豆蔻醇提物对小鼠巨噬细胞炎症因子TNFα基因表达量的影响。
图6肉豆蔻醇提物对小鼠巨噬细胞炎症因子IL-6基因表达量的影响。
图7肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠进食量的影响。
图8肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠体重的影响。
图9肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠体重变化量的影响。
图10肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠血糖水平的影响。
图11肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠口服葡萄糖耐受量曲线的影响。
图12肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠口服葡萄糖耐量曲线下面积的影响。
图13肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏脂质积累的影响。
图14肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠血清低密度脂蛋白水平的影响。
图15肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠血清高密度脂蛋白水平的影响。
图16肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠血清胆固醇水平的影响。
图17肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠血清丙氨酸氨基转移酶水平的影响。
图18肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠血清碱性磷酸酶水平的影响。
图19肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏中炎症因子TNFα水平的影响。
图20肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏中炎症因子IL-6水平的影响。
图21肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏中FASN基因相对表达量的影响。
图22肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏中SREBP-1c基因相对表达量的影响。
图23肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏中FASN、SREBP-1c和β-actin表达量的影响。
图24肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏中pAMPK-α/AMPK-α的影响。
(*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；显著性用abc表示：相同字母无显著性差异，不同字母有显著性差异。)
具体实施方式
下述实施例中涉及的肉豆蔻购自北京同仁堂公司；
实施例中涉及的检测IL-1β(货号：DY401-05)、IL-6(货号：DY406-05)、TNFα(货号：DY410-05)和IL-10(货号：DY417-05)的ELISA试剂盒采购自R&D公司；
实施例中涉及的LO2细胞、Raw264.7细胞购自南京科佰生物科技有限公司；小鼠肝癌细胞系Hepa1-6购自上海凯博生物公司。
实施例中涉及的DMEM培养基和RPMI-1640培养基(货号：C11965092和C11875500B)购自Gibco,USA公司；
实施例中涉及的60％高脂饲料购自南通特洛菲公司(货号：TP 23300)。
本发明建立非酒精性脂肪肝模型方法为：
取5周龄雌性C57BL/6小鼠，于饲养室温为20～26℃，湿度为40～70％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应性喂养1周后，每日喂食60％高脂模型饲料，饮水正常，并观察其体重和进食量变化，模型建立10-12周时，观察体重，肝重，血浆甘油三酯、血糖等变化，确定是否建立非酒精性脂肪肝模型。
实施例1：肉豆蔻醇提物的制备
将煨制过的肉豆蔻(购自北京同仁堂)用机械研磨机粉碎研磨，过200目筛子，用75％乙醇在37℃下反复提取三次，过滤回收药渣，再次浸提，每次12h。将三次提取物混合，真空过滤。过滤后的液体在旋转蒸发器中浓缩，蒸干称重，分别溶解在二甲基亚砜(DMSO)和0.5％羧甲基纤维素钠(CMC)中用于细胞实验和动物实验，4℃冷藏备用。同时用全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF-MS)鉴定提取物主要成分(表1)。
表1肉豆蔻提取物主要成分组成
Figure BDA0002606692090000051
实施例2：肉豆蔻醇提物对肝脏细胞脂质合成相关基因FASN、SREBP-1c的影响
将人肝细胞系LO2在含5％(v/v)CO2的37℃培养箱中培养，在含10％FBS，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中生长。至LO2细胞的细胞密度达到80％时，转至96孔板中，密度为每孔5000个细胞。在孵育24小时后，用不同浓度的肉豆蔻乙醇提取物处理，分为四个剂量组(25、50、100和200mg/L)。对照细胞(CON组)只加入溶剂(1‰DMSO)。每组重复设置三个平行复孔。用MTT比色法测定72小时(即刺激48h后)细胞增殖情况。吸去培养基，用PBS小心冲洗细胞三次，然后加入含有MTT的培养基，静置4小时。最后，加入DMSO溶解细胞中的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)。在酶标仪中，通过测定570nm波长处的吸收来鉴定细胞活力。将另一组LO2细胞种在6孔板中，用不同剂量(25、50和100mg/L)的肉豆蔻乙醇提取物处理。阳性对照组用脂肪酸合成酶(FAS)抑制剂——姜黄素(Curcumin)处理。培养48小时后，弃去培养基，将细胞PBS洗涤三遍后与TRIzol混合。用Trizol法提取LO2细胞的总RNA，反转录后，通过PCR检测脂肪酸合成酶FASN和固醇调节元件结合蛋白基因SREBP-1c的表达量(检测结果如图1-4所示)。
检测结果为：由图1可知，四个剂量组(25、50、100和200mg/L)中，LO2的存活率均有不同程度的下降，在50mg/L时，存活率出现显著下调，在100mg/L时，LO2细胞的存活率为49.4％，即100mg/L在IC50值以下，存在肉豆蔻醇提物的有效浓度，设置浓度梯度进行下一步实验。
由图2-4知，将另一组LO2细胞在6孔板中，用不同剂量(25、50和100mg/L)的肉豆蔻乙醇提取物处理。阳性对照组用脂肪酸合成抑制剂——姜黄素(Curcumin)处理。可以看到48h后，LO2细胞的FASN基因在四个处理组中均有显著下调，其中100mg/L时，基因表达量为CON组的19.5％，下调5.12倍；Curcumin组表达量为CON组的23.9％，下降4.18倍。SREBP-1c基因在100mg/L组和Curcumin组中下调显著，分别为19.1％和31.5％。由图2-4可知，肉豆蔻醇提物可以显著抑制LO2细胞的脂质合成，优于脂肪酸合成酶抑制剂Curcumin。
实施例3：肉豆蔻醇提物对肝癌细胞体外增殖的影响
将小鼠肝癌细胞系Hepa1-6在含5％(v/v)CO2的37℃培养箱中培养，在含10％FBS，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中生长。至Hepa1-6细胞的细胞密度达到80％时，转至96孔板中，密度为每孔5000个细胞。在孵育24小时后，用不同浓度的肉豆蔻乙醇提取物处理，分为三个剂量组(25、50、100mg/L)。对照细胞(CON组)只加入溶剂(1‰DMSO)。每组重复设置六个平行复孔。用MTT比色法分别测定刺激18h和36h后细胞增殖情况。吸去培养基，用PBS小心冲洗细胞三次，然后加入含有MTT的培养基，静置4小时。最后，加入DMSO溶解细胞中的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)。在酶标仪中，通过测定570nm波长处的吸收来鉴定细胞活力。(检测结果如表2所示)。
检测结果为：由表2可知，在18h和36h的刺激下，三个剂量组(25、50、100mg/L)中，Hepa1-6细胞的抑制率均有不同程度的上升，在18h时，细胞半数抑制率在50mg/L以下，为47.05mg/L，在36h时，细胞半数抑制率在30mg/L以下，为28.96mg/L。由表2可知，AEN有效抑制肝癌细胞在体外的增殖。
表2肉豆蔻提取物对鼠肝癌细胞Hepa1-6增殖的抑制
Figure BDA0002606692090000071
实施例4：肉豆蔻醇提物对小鼠巨噬细胞炎症反应相关基因IL-6、TNFα的影响
将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7在含5％(v/v)CO2的37℃培养箱中培养，在含10％FBS，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中生长。至RAW264.7细胞的细胞密度达到80％时，转至6孔板，得到长满RAW264.7细胞的孔板；将长满RAW264.7细胞的孔板分为四组，分别为CON组、AEN组、FFA组和AEN+FFA组。其中，在CON组的孔板中加入溶剂(1‰DMSO)，在AEN组的孔板中加入肉豆蔻醇提物100mg/L，FFA组的孔板中加入摩尔比为2：1的油酸和棕榈酸混合物，AEN+FFA组的孔板中加入肉豆蔻醇提物100mg/L和油酸和棕榈酸混合物(2：1)，处理48h后弃去培养基，将细胞PBS洗涤三遍后与TRIzol混合。用Trizol法提取RAW264.7细胞的总RNA，反转录后，通过PCR检测TNF-α和IL-6的基因表达量。
由图5可知，在巨噬细胞RAW264.7加入AEN并无显著变化(AEN组)，在油酸和棕榈酸混合物的刺激下炎症因子TNF-α升高(FFA组)，升高为对照组的2.34倍，再加入AEN后TNF-α基因表达量下调(AEN+FFA组)，与FFA组相比下调27.0％，是对照组的1.71倍。
由图6可知，在巨噬细胞RAW264.7加入AEN并无显著变化(AEN组)，在油酸和棕榈酸混合物的刺激下炎症因子IL-6升高(FFA组)，升高为对照组的2.09倍，再加入AEN后IL-6基因表达量下调(AEN+FFA组)，与FFA组相比下调22.8％，是对照组的1.61倍。
由图5-6可知，AEN可以显著下调由游离脂肪酸引起的小鼠巨噬细胞的炎症反应，并且对正常巨噬细胞无刺激炎症反应。
实施例5：肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝小鼠脂质代谢和血糖水平的影响
取5周龄雌性C57BL/6小鼠，于饲养室温为20～26℃，湿度为40～70％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应性喂养1周后，按照平均体重分为3组，每组10只，其中一组喂食普通低脂饲料，另外两组喂食60％高脂饲料，饲养10-12周后，确定模型建立。3组分别设为空白对照组(CON)、模型组(HF)、肉豆蔻醇提物组(HF+AEN)。将肉豆蔻醇提物用羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液稀释至浓度为200mg/kg，得到肉豆蔻醇提物稀释液，准备灌胃肉豆蔻醇提物组。模型组和空白对照组只灌胃溶剂羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液。
实验时间共5周：CON组小鼠灌胃羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化，HF组小鼠灌胃羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化，HF+AEN组小鼠肉豆蔻醇提物稀释液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化。在实验结束前，取血清采用分光光度法测定生化指标，小鼠处死后解剖取肝脏，脂肪等脏器组织做病理切片。(检测结果如图7-16所示)
由图7可知，灌胃前后，小鼠的进食量无显著变化规律，说明肉豆蔻提取物对小鼠进食量无显著抑制或提升作用。
由图8-9可知，灌胃前，相比于空白对照组，高脂饮食组小鼠体重显著升高，相比对照组升高43.4％，灌胃后，HF+AEN组小鼠体重开始显著下降，在第16周实验结束时，相比模型组HF组，体重下降了34.1％。由图8-9可知，AEN对高脂饮食诱导的小鼠体重增加有有效的缓解作用。
由图10-12可知，在第16周时，相比空白对照组，高脂模型组小鼠血糖水平显著升高44.9％，AEN处理组小鼠血糖水平下降，相比高脂模型组下降28.1％。小鼠口服葡萄糖耐量OGTT曲线显示，HF组小鼠0min时血糖在7以上，15min时血糖上升最高到20.72±3.45，相比空白对照组升高35.1％.随后三组小鼠血糖均开始下降，在120min时，CON组小鼠血糖下降到7以下，HF+AEN组血糖恢复在6.4±0.82水平，而HF组在8.81±1.32。通过小鼠OGTT曲线下面积AUC可以看出，HF组显著升高，相比对照组升高36.2％，HF+AEN组有显著下降，相比HF组下降20.2％。由图10-12可知，非酒精性脂肪肝小鼠血糖水平较高，糖耐量受损，导致血糖调节失衡，肉豆蔻提取物可以有效降低血糖水平，改善葡萄糖耐量。
由图13可知，通过肝脏病理切片(HE染色：左；油红染色：右可以看出，和CON组(上)相比，HF组(中)小鼠肝脏出现脂肪变性，即出现大小不一的空泡(脂滴)或橘黄色脂滴，边界清晰，将细胞核挤向一侧，肝细胞体积增大，肿胀，细胞核明显，局部出现炎症反应。AEN组(下)中小鼠肝脏组织空泡(脂滴)面积变小，炎症反应降低，肝脏脂质堆积有明显的缓解。由图11-13可知，AEN可以调节非酒精性脂肪肝小鼠的血脂水平。
由图14-16可知，通过小鼠血清生化指标分析低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血清胆固醇(TG)可以发现，HF组血清中LDL和TC的水平相比对照组升高，HF+AEN组显著下调二者的水平，HDL在HF组水平较低，HF+AEN组显著上调HDL水平。
由图17-18可知，小鼠肝脏功能指标中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)在HF组中均有不同程度升高，说明出现了一定程度的肝功能受损和炎症反应，AEN可以有效恢复肝脏功能，分别下调了50.7％和12.3％。
由图7-18可知，肉豆蔻醇提物可以减肥降脂，调节脂质代谢，改善肝脏功能，降低血糖水平，改善葡萄糖耐量。
实施例6：肉豆蔻提取物对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏中炎症因子IL-6、TNFα的影响
取5周龄雌性C57BL/6小鼠，于饲养室温为20～26℃，湿度为40～70％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应性喂养1周后，按照平均体重分为3组，每组10只，其中一组喂食普通低脂饲料，另外两组喂食60％高脂饲料，饲养10-12周后，确定模型建立。3组分别设为空白对照组(CON)、模型组(HF)、肉豆蔻醇提物组(HF+AEN)。将肉豆蔻醇提物用羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液稀释至浓度为200mg/kg，得到肉豆蔻醇提物稀释液，准备灌胃肉豆蔻醇提物组。模型组和空白对照组只灌胃溶剂羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液。
实验过程如下：CON组小鼠灌胃羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化，HF组小鼠灌胃羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化，HF+AEN组小鼠肉豆蔻醇提物稀释液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化。在实验结束后，小鼠处死后解剖取肝脏，研磨成肝匀浆，用ELISA试剂盒检测小鼠肝脏中的炎症因子IL-6、TNFα的含量。
由图19-20可知，饲喂第16周时，非酒精性脂肪肝模型小鼠肝脏中的促炎症因子IL-6和TNFα显著升高，AEN可以有效降低小鼠肝脏中的炎症因子水平，相比HF组，分别下降了25.6％和24.9％，缓解小鼠肝脏中的炎症反应。
实施例7：肉豆蔻醇提物对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂肪代谢相关蛋白表达量的影响
取5周龄雌性C57BL/6小鼠，于饲养室温为20～26℃，湿度为40～70％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应性喂养1周后，按照平均体重分为3组，每组10只，其中一组喂食普通低脂饲料，另外两组喂食60％高脂饲料，饲养10-12周后，确定模型建立。3组分别设为空白对照组(CON)、模型组(HF)、肉豆蔻醇提物组(HF+AEN)。将肉豆蔻醇提物用羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液稀释至浓度为200mg/kg，得到肉豆蔻醇提物稀释液，准备灌胃肉豆蔻醇提物组。模型组和空白对照组只灌胃溶剂羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液。
实验过程如下：CON组小鼠灌胃羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化，HF组小鼠灌胃羧甲基纤维素钠(0.5％)溶液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化，HF+AEN组小鼠肉豆蔻醇提物稀释液，每日每只200ul，观察体重和进食量变化。在实验结束后，小鼠处死后解剖取肝脏，研磨成肝匀浆，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液溶解肝组织，提取蛋白后用Western blot法测定小鼠FASN、SREBP-1c和pAMPK-α/AMPK-α的蛋白表达量。
由图21～23可知，小鼠肝脏中的蛋白表达量显示，相比空白对照组，HF组小鼠肝脏FASN、SREBP-1c的蛋白表达量显著升高，AEN可以显著下调肝脏FASN、SREBP-1c的蛋白表达量，降低脂质合成速度，从而降低肝脏中的脂质堆积。这一功能是通过上游靶点AMP依赖的蛋白激酶-α(AMPK-α)的激活实现的。pAMPK-α/AMPK-α是评价AMPK***激活程度的指标。由图24可知，HF+AEN组和HF组相比，pAMPK-α/AMPK-α的比值被显著上调。由图21-24可知，肉豆蔻醇提物通过调节小鼠肝脏脂肪代谢相关蛋白表达量来下调肝脏脂质堆积情况，进而有效改善小鼠非酒精性脂肪肝进程。
实施例8
按照实施例1的方法制备肉豆蔻提取物。
将肉豆蔻提取物与药学上可接受的载体配伍，或与多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
所述药学上可接受的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
所述填充剂为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.肉豆蔻提取物在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的产品中的应用，其特征在于，所述肉豆蔻提取物按如下步骤制备而成：
(1)将煨制后的肉豆蔻粉碎，研磨，过筛；
(2)将步骤(1)过筛后的肉豆蔻粉用乙醇溶液浸提至少10h，重复2～3次；
(3)将每次的浸提物混合后，真空过滤，浓缩，制得肉豆蔻提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肉豆蔻提取物溶解在溶剂中。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括但不限于食品、药品或保健品。
4.根据权利要求1～3任一所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗非酒精性脂肪具体表现为(a)～(f)中的至少一种情况：
(a)降低游离脂肪酸引起的炎症反应；
(b)抑制肝细胞脂质合成和巨噬细胞炎症反应；
(c)降低血脂；
(d)降低血糖，改善葡萄糖耐量；
(e)减少肝脏脂质合成；
(f)调节肝脏脂质代谢和/或降低肝脏脂质堆积；
(g)改善肝脏功能；
(h)抑制肝癌细胞增殖，降低癌细胞存活率。
5.一种药物组合物，其特征在于，含有肉豆蔻提取物；所述肉豆蔻提取物按如下步骤制备而成：
(1)将煨制后的肉豆蔻粉碎，研磨，过筛；
(2)将步骤(1)过筛后的肉豆蔻粉用乙醇溶液浸提至少10h，重复2～3次；
(3)将步骤(2)每次的浸提物混合后，真空过滤，浓缩，制得肉豆蔻提取物。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，肉豆蔻醇提物含量不低于200mg/kg。
7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还含有药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为药学上可接受的填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述填充剂为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。
10.肉豆蔻提取物在制备非医疗目的的保健产品中的应用。
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