CN108913698B

CN108913698B - 一种与小麦穗发芽抗性/感性相关的caps标记及其应用

Info

Publication number: CN108913698B
Application number: CN201810825032.3A
Authority: CN
Inventors: 张海萍; 常成; 王升星; 朱玉磊; 姜昊; 曹佳佳; 李黎; 未文新; 卢杰; 陈璨; 司红起; 马传喜
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Tianjin Hedong Xinyao Technology Development Co ltd
Priority date: 2018-07-25
Filing date: 2018-07-25
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2038-07-25
Also published as: CN108913698A

Abstract

本发明公开了一种与小麦穗发芽抗性/感性相关的CAPS标记及其应用，涉及遗传育种技术领域，本发明公开了一种控制小麦种子休眠/穗发芽抗性的候选基因，所述候选基因被命名为TaGASR‑7B，所述TaGASR‑7B的核苷酸序列具体为SEQ ID NO.1，同时根据该候选基因开发了一个CAPS标记，该CAPS标记的序列表为SEQ ID NO.4，一种利用该CAPS标记鉴定小麦穗发芽抗性或感性的方法，利用引物对对所述CAPS标记扩增后酶切，若酶切产物为两条主带，则，该产物对应的基因序列被命名为GS7B1‑R，其对应的小麦品种表现为抗穗发芽；若酶切产物为一条主带，则该产物对应的基因序列被命名为GS7B1‑S，其对应的小麦品种表现为感穗发芽；本发明可以为小麦抗穗发芽育种提供基因资源和功能标记，拓宽其抗性遗传基础。

Description

一种与小麦穗发芽抗性/感性相关的CAPS标记及其应用

技术领域

本发明涉及的是作物遗传育种技术领域，尤其涉及的是一种与小麦穗发芽抗性或感性相关的CAPS标记和应用。

背景技术

小麦是全球约40％人口的主食，我国是世界最大的小麦生产国和消费国，占当年世界小麦生产总量的17％和消费总量的16％。收获前穗发芽(Pre-harvest sprouting,PHS)是指小麦临近收获前遭遇阴雨天气导致籽粒直接在穗部发芽的现象。小麦发生穗发芽会严重降低产量及品质，以至威胁我国及全球的粮食安全。

种子休眠是穗发芽抗性的主要遗传因子。前人利用连锁分析和关联分析方法定位了大量小麦种子休眠/穗发芽抗性相关的QTL，然而，这些QTL并非功能性标记，仅代表染色体上的某一区段，影响了分子标记辅助选择育种的高效性和准确性。直接利用基因功能标记可以大大提高选择的效率，缩短育种进程。目前，已克隆的小麦种子休眠/穗发芽抗性基因主要是2AS和2BS染色体上的TaSdr-A1和TaSdr-B1(Zhang等2014，2017)，3AS染色体上的TaMFT-3A和TaPHS1(Nakamura等2011；Liu等2013)，3AL和3BL染色体上的TaVp-1(Yang等2007；Chang等2011)，以及4AL染色体上的TaMKK3-A1(Torada等2016)。然而，培育穗发芽抗性较强的品种还需要继续挖掘种子休眠/穗发芽抗性基因，以满足小麦穗发芽抗性的多基因聚合育种的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了与小麦穗发芽抗性/感性相关的CAPS标记及其应用，以满足小麦穗发芽抗性的多基因聚合育种的需求。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种控制小麦种子休眠/穗发芽抗性的候选基因，所述候选基因被命名为TaGASR-7B，所述TaGASR-7B的核苷酸序列具体为SEQ ID NO.1。

进一步，本发明还提供一种用于扩增上所述候选基因的引物对，该引物对具体为：

F:GAGGGCCGGAGATAAATAG SEQ ID NO.2

R:CTGCGGTAAGTGGTCGTT SEQ ID NO.3。

进一步，本发明还提供一种根据上述候选基因开发的CAPS标记，所述CAPS标记被命名为GS7B1,所述CAPS标记的核苷酸序列具体为SEQ ID NO.4。

进一步，本发明还提供一种用于扩增上述CAPS标记的引物对，该引物对具体为：

F:ACACCTCGGTTCAATGCC SEQ ID NO.5

R:CCTTCTTGTACTGCGTCCC SEQ ID NO.6。

进一步，本发明还提供一种利用上述CAPS标记鉴定小麦穗发芽抗性或感性的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、提取待测小麦基因组DNA；

步骤2、以SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3为引物对步骤1提取的待测小麦基因组进行PCR扩增，获得初级扩增产物；

步骤3、、以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6为引物对步骤2获得的初级扩增产物进行PCR扩增，获得终极扩增产物；

步骤4、利用限制性内切酶BsaI酶切步骤3获得的终极扩增产物，获得酶切产物；

步骤五、若酶切产物为两条主带，则，该产物对应的终极扩增产物基因序列被命名为GS7B1-R，其对应的小麦品种表现为抗穗发芽；若酶切产物为一条主带，则该产物对应的终极扩增产物基因序列被命名为GS7B1-S，其对应的小麦品种表现为感穗发芽。

本发明具有如下有益效果：

本发明克隆了一个控制小麦种子休眠/穗发芽抗性的候选基因TaGASR-7B，并开发了功能标记GS7B1，该标记能有效区分种子休眠/穗发芽抗性不同的品种，可以为小麦穗发芽抗性育种提供基因资源和功能标记，拓宽其抗性遗传基础。

附图说明

图1GS7B1标记在不同小麦品种中的扩增及酶切电泳图谱。

M:MarkerII；1：红芒春21；2：扬麦16；3：洋小麦；4：京411；5：烟农19；6：济麦22。

具体实施方式

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品，所用种质资源，均可从国家种质资源库获得。

(一)小麦种子休眠表型的测定

(1)种子萌芽指数(germination index,GI)测定

于小麦蜡熟期分别收获主茎穗，室内风干2天，立即存放于-20℃冰箱以维持种子的休眠性，待全部试验材料收获完毕，手工脱粒，一并进行后熟5天、15天和30天的籽粒发芽试验。具体为：每个材料取50粒进行种子发芽试验，2次重复。籽粒腹沟朝下摆放在培养皿内，培养皿内加9ml无菌水，置于人工气候培养箱(20℃，光照14h，黑暗10h，湿度80％)，24小时候后开始统计每个培养皿萌发种子数，于每天同一时间统计萌芽数并剔除发芽种子(以胚部露白为萌芽鉴定标准)，3天后计算种子萌芽指数(germination index，GI)，计算两次平均值。

种子萌芽指数(GI)计算公式：GI＝[(3×n1+2×n2+1×n3计算)/(3×N)]×100％

其中n1、n2、n3是种子第1天、第2天、第3天每天所萌芽的籽粒数，N指总粒数。

注：对于260份小麦品种组成的自然群体(NP)，2012年收获后5天，15天和30天测定的GI分别命名为12GI5-NP，12GI15-NP和12GI30-NP；2013年测定的GI分别命名为13GI5-NP，13GI15-NP和13GI30-NP；2014年测定的GI分别命名为14GI5-NP，14GI15-NP和14GI30-NP；2015年测定的GI分别命名为15GI5-NP，15GI15-NP和15GI30-NP。对于京411/红芒春21RILs群体(JH)，2014和2015年测定的GI分别命名为14GI5-JH，14GI15-JH，15GI5-JH和15GI15-JH。对于260份微核心种质资源(CMCC)，2014、2015和2016年测定的GI分别命名为14GI5-CMCC，14GI15-CMCC，15GI5-CMCC，15GI15-CMCC，16GI5-CMCC和16GI15-CMCC。

(2)田间穗发芽率(field sprouting,FS)测定

小麦收获期间遇到降雨天气，于田间保留10个小麦主茎穗进行整穗发芽率测定。收获后置于电热恒温干燥箱中，150℃快速烘干，手工脱粒，统计发芽种子数和总粒数，计算田间穗发芽率(FS)

田间整穗发芽率(FS)计算公式：FS＝(10穗发芽粒数÷10穗总粒数)×100％

注：对于260份小麦品种组成的自然群体(natural population,NP)，2013年和2015年测定的FS分别命名为13FS-NP和15FS-NP。对于京411/红芒春21RILs群体(JH)，2015年和2016年测定的FS分别命名为15FS-JH和16FS-JH。对于260份微核心种质资源(Chinesemicro-core collection,CMCC)，2015和2016年测定的FS分别命名为15FS-CMCC和16FS-CMCC。

(二)SDS-Tris饱和酚法抽提小麦基因组DNA

(1)取2-3粒小麦种子置于2ml灭菌离心管，利用MP高通量组织研磨仪研磨成粉末。

(2)加入1.2ml DNA提取缓冲液(200mM Tris-Cl,250mM NaCl,25mM EDTA,0.5％SDS,2％β-ME)。

(3)60℃水浴45min，期间间歇振荡以充分提取。

(4)室温下12000rpm离心10min。

(5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酚/氯仿异/戊醇(体积比为25：24：1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡。

(6)室温下12000rpm离心10min。

(7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤(5)、(6)，以充分去除蛋白。

(8)转移上清液至新的1.5ml灭菌离心管中，加入0.6倍异丙醇(300μl)和1/10倍体积(50μl)NaAc(pH5.2)，充分混合混匀后冰上静置17min，使DNA白色沉淀充分析出。

(9)4℃10000rpm离心10min。

(10)弃上清，加入预冷的70％乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾干，加入100μl其中含2μl 10mg/ml RNase酶的1×TE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解。

(11)在NanoVue Plus微量分光光度计上检测DNA浓度，并统一稀释成50ng/ul工作液，备用。

(三)PCR扩增与检测

利用SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3引物对：

F:GAGGGCCGGAGATAAATAG SEQ ID NO.2

R:CTGCGGTAAGTGGTCGTT SEQ ID NO.3

对步骤2获得的小麦基因进行PCR扩增。

PCR扩增体系为20μL，包括10×buffer(含有2.0mmol L^-1Mg²⁺)2.0μL，2.5mmol L^- ¹dNTPs 1.6μL，5UμL^-1Taq DNA polymerase 0.2μL，10μmol L^-1引物各0.8μL，2.0μL模板DNA(50～60ngμL^-1)，ddH2O 13.8μL。反应程序为94℃预变性5min；35个循环(95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min)；72℃延伸10min；4℃保存。CAPS标记的检测参考相应内切酶说明书配置体系后酶切3h或者过夜。PCR产物则利用1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分析检测，GelStain荧光染料染色，BIO-RAD凝胶成像***扫描拍照。

(四)转录组数据分析

根据京411/红芒春21RILs群体种子休眠/穗发芽抗性极端混池及双亲的转录组数据，在小麦7B染色体上筛选到一个两池间差异表达基因(筛选标准为P≤10^-4和FDR≤10^-3)，该基因编码一个赤霉素刺激调控因子(GA-stimulated regulator,GASR)，暂时命名为TaGASR-7B。根据中国春转录组参考序列获取该差异基因CDS序列，通过DNAMAN软件分析该基因CDS序列信息，并在NCBI上Blast比对获取目的基因序列。

(五)目的基因克隆及测序验证

利用Primer Premier 5.0软件设计基因组特异引物GASR7B，以扩增全长TaGASR-7B基因(表1，图1)。对扩增产物进行胶回收，连接于pGEM-T载体中进行克隆测序，测序结果验证该扩增产物确为TaGASR-7B基因DNA序列。TaGASR-7B基因全长1974bp，包含3个外显子(300bp)、2个内含子(221bp)、启动子(994bp)和3’非翻译区(459bp)。

利用EasyPure Quick Gel Extraction Kit进行胶回收。具体操作如下：

1)切胶，加入500uL GSB，65℃水浴5-10min至胶液融化；

2)融化的胶液降至室温后转移液体至离心柱中，静置1min，10000rpm离心1min，弃滤液；

3)加入650uLWB溶液，10000rpm离心1min，弃滤液；

4)10000rpm离心2min，去除残留WB；

5)转移离心柱至灭菌1.5mL离心管，开盖静置1-2min，待乙醇挥发干净，加入20-50uL去离子水(65℃预热)，静置1min；

6)10000rpm离心1min，洗脱DNA，4℃冰箱保存。

连接用Blunt-zero质粒载体，连接体系为5μL：1μL的连接载体、4μL的胶回收产物，25℃连接，连接时间根据片段长度而定。具体操作如下：

1)超净工作台提前紫外杀菌10-20min，转移连接产物于50uL Trans1-T1感受态细胞中(感受态刚解冻时加入为最适宜时间)，轻轻混匀，超净工作台拿出，冰浴20min；

2)水浴锅42℃热激45s，立即置于冰上，冰浴2min；

3)继续至超净工作台，加入600-1000uL不含氨苄的SOC培养基；

4)37℃摇菌培养1-1.5h；

5)取100-200uL菌液涂平板(提前配制冷却，含氨苄)，涂完后静置15-30min后37℃倒置培养过夜至长出合适菌落，拿出；

6)挑选白色克隆10个左右，接种于含有氨苄的LB液体培养基，37℃摇菌6-8h。取摇好的菌液2uL作为模版，M13引物扩增检测，退火温度为55℃，扩增并挑选阳性克隆进行测序。

(六)功能标记开发及在不同群体中的验证

根据TaGASR-7B基因序列在穗发芽抗性极端材料间差异，将启动子区域SNP变异(-16位置，C/G)开发成CAPS标记GS7B1。

针对CAPS标记GS7B1设计用于对其进行PCR扩增的引物对，SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6，即：

F:ACACCTCGGTTCAATGCC SEQ ID NO.5

R:CCTTCTTGTACTGCGTCCC SEQ ID NO.6

抗穗发芽材料(含C碱基)含有限制性内切酶BsaI酶切位点(GGTCTCN/)，可以被酶切，产生902bp和408bp扩增产物(命名为GS7B1-R类型)，而感穗发芽材料(含G碱基)不含有限制性内切酶BsaI酶切位点，不能被酶切，产生1310bp的扩增产物(命名为GS7B1-S类型)；

在260份小麦品种(NP)，260份微核心种质资源(CMCC)，以及京411/红芒春21群体(CMCC)中，TaGASR-7B基因等位变异与多年(2012-2016)种子萌芽指数(GI)和田间整穗发芽率(FS)均呈显著或极显著相关(P＜0.05或0.01)，且携带GS7B1-R类型的材料具有较低的种子萌芽指数或较高的穗发芽抗性(表2)。

表1用于扩增TaGASR-7B基因全长引物序列

表2 TaGASR-7B基因不同等位变异在京411/红芒春21群体(JH-RIL)，260份小麦品种(NP)以及260份微核心种质(CMCC)中与种子休眠/穗发芽抗性的关系

注：^*表示显著相关(p<0.05)；^**表示极显著相关(p<0.01)

JH-RIL代表京411/红芒春21群体，CMCC代表260份小麦微核心种质，NP代表260份小麦品种。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 一种与小麦穗发芽抗性/感性相关的CAPS标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1974

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L)

<220>

<221> mutation

<222> (983)

<223> n is c or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (983)..(983)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

gagggccgga gataaatagt gttgggtgcc tttatgtatc ttctccaaat aaatgtctga 60

gatgggagcg gcccacacct cggttcaatg ccccgcccct gccttgcagg ccatctactg 120

cgcatgtcag ttgtaaaaat acgcagctat acagattgtt atatgggggt tgaaatcatt 180

atacggctca cgcgtattga agttgcacga atcacgcgag tacatgcggt gtggatacca 240

gccgcgcgtg gacgcatgtc cacttgcgat tattcgcgtt attgctatat atacgtacaa 300

actcatgaca attatgtatc aacaacaata aatactctag taactgaatt ttgcccagta 360

aaactttgct acagatgaaa ctaaaacaag ccctatatga ctatgcaacc tgtggttatc 420

tgctaacgag ctttgtcttt atcttttaat ctaacataac acacaaagtg tggttttgtt 480

ctagtacggc agttattgtt cgcaaaacca agcaaaatat gaatgttggc gttgccaaga 540

gtccaacttc ttttcctaga agagatattg cttttgccga ttgtgatccc atatattttt 600

atcagaaatc tgcctactca cggtcacggt tatagtatca cctaccctcg gcacagcaca 660

aaatgcaaaa gcaagagcct tcccacggaa aaagagagca gggtcgcggt gcactgcagg 720

tctgtaacgc atatgcatgg tcagagcagc cagtggagca tcacatgccg agtacagaca 780

gcaggagcag gcccgtcctc tccacagtaa cgcttccata actgctcacc ccccaccacc 840

gtccaccacc tctctccccc gcctcgtgcc cagctagctg cccttcctcc tctacatata 900

cccaggcgac ccaaccaaaa gatctcacct ctcaagtcca caattcacat cgctcttacc 960

cagccacacg cggagaagag acncagcaag cgccatggcc aagatctcct tcctcctcgt 1020

ggcgctcctc gtcctcgccg tcgcgttccc cgtggtaatc acccatgcca cgtcgcctct 1080

ctccttcatc cttcagccat gcattcatat gtttttttcc ttcactcacc ggtgctcttc 1140

tcctttgggc cgtgccgtgc aggaggtgat gggaggcggc aacggcggcg ccggcggcgg 1200

cggcaagctc aagccatggg gtaaacccac tcgcactcgc agtattgcta gcgcatttcg 1260

ccgcgtttct tctagcctgg tccttttgtt tttttgtaaa aaagaaactg acgttttggg 1320

ggcgtttgtg cagagtgctc gtccaagtgc tcgtcgcggt gctcggggac gcagtacaag 1380

aaggcgtgcc tgacctactg caacaagtgc tgcgccactt gcctctgcgt gccgccgggc 1440

acctacggca acaagggcgc ctgcccctgc tacaacaact ggaagaccaa ggagggaggc 1500

cccaagtgcc cctagattct tgattttctt tcttcttctt ctggggtgcc agcttgcggt 1560

tgatggttat tcactgctcg gccatcaaaa tgtactacag tagatctgaa ttatgtgatg 1620

ggcatttaat cagtggcatg tgaattgccc tcccagttac ctgtatttct atcagtaaga 1680

tgtggaaaac tggaggcact ccgccactcc cacatgatta tagtgggacc tatcgagctt 1740

tattgttcct tgtgcgcctg tgcaccgtgc tttcttcttg tctcaaaagt cagatgaagc 1800

atgaagcgcc cgtaccattc ggcatgaatg atgagctatc acaatgaaca aaagcatgca 1860

acgcccgttc atctttcttt cgttttcaga tgtgcaacga gcatcttttg ttgttattgg 1920

tactgaggcc atccaaatgg atcatgcaga cactaaaacg accacttacc gcag 1974

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 2

gagggccgga gataaatag 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 3

ctgcggtaag tggtcgtt 18

<210> 4

<211> 1310

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L)

<220>

<221> mutation

<222> (909)

<223> n is c or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (909)..(909)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 4

acacctcggt tcaatgcccc gcccctgcct tgcaggccat ctactgcgca tgtcagttgt 60

aaaaatacgc agctatacag attgttatat gggggttgaa atcattatac ggctcacgcg 120

tattgaagtt gcacgaatca cgcgagtaca tgcggtgtgg ataccagccg cgcgtggacg 180

catgtccact tgcgattatt cgcgttattg ctatatatac gtacaaactc atgacaatta 240

tgtatcaaca acaataaata ctctagtaac tgaattttgc ccagtaaaac tttgctacag 300

atgaaactaa aacaagccct atatgactat gcaacctgtg gttatctgct aacgagcttt 360

gtctttatct tttaatctaa cataacacac aaagtgtggt tttgttctag tacggcagtt 420

attgttcgca aaaccaagca aaatatgaat gttggcgttg ccaagagtcc aacttctttt 480

cctagaagag atattgcttt tgccgattgt gatcccatat atttttatca gaaatctgcc 540

tactcacggt cacggttata gtatcaccta ccctcggcac agcacaaaat gcaaaagcaa 600

gagccttccc acggaaaaag agagcagggt cgcggtgcac tgcaggtctg taacgcatat 660

gcatggtcag agcagccagt ggagcatcac atgccgagta cagacagcag gagcaggccc 720

gtcctctcca cagtaacgct tccataactg ctcacccccc accaccgtcc accacctctc 780

tcccccgcct cgtgcccagc tagctgccct tcctcctcta catataccca ggcgacccaa 840

ccaaaagatc tcacctctca agtccacaat tcacatcgct cttacccagc cacacgcgga 900

gaagagacnc agcaagcgcc atggccaaga tctccttcct cctcgtggcg ctcctcgtcc 960

tcgccgtcgc gttccccgtg gtaatcaccc atgccacgtc gcctctctcc ttcatccttc 1020

agccatgcat tcatatgttt ttttccttca ctcaccggtg ctcttctcct ttgggccgtg 1080

ccgtgcagga ggtgatggga ggcggcaacg gcggcgccgg cggcggcggc aagctcaagc 1140

catggggtaa acccactcgc actcgcagta ttgctagcgc atttcgccgc gtttcttcta 1200

gcctggtcct tttgtttttt tgtaaaaaag aaactgacgt tttgggggcg tttgtgcaga 1260

gtgctcgtcc aagtgctcgt cgcggtgctc ggggacgcag tacaagaagg 1310

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 5

acacctcggt tcaatgcc 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Synthetic sequence)

<400> 6

ccttcttgta ctgcgtccc 19

Claims

1.一种鉴定小麦穗发芽抗性或感性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1、提取待测小麦基因组DNA；

步骤3、以SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6为引物对步骤2获得的初级扩增产物进行PCR扩增，获得终极扩增产物；

步骤4、利用限制性内切酶BsaI酶切步骤3获得的终极扩增产物，其中酶切位点为GGTCTCN，获得酶切产物；

步骤五、若酶切产物为两条主带，则其对应的扩增产物基因序列被命名为GS7B1-R，其对应的小麦品种表现为抗穗发芽；若酶切产物为一条主带，则其对应的扩增产物基因序列被命名为GS7B1-S，其对应的小麦品种表现为感穗发芽；

待测小麦品种为红芒春21、扬麦16、洋小麦、京411、烟农19和济麦22中任意一种。