CN111655225A - 用于治疗微尘造成的皮肤细胞损伤、增强皮肤障壁、及抗老化或抗发炎的包含野薄荷提取物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本说明书涉及包含野薄荷提取物作为活性成分的皮肤外用制剂组合物并提供用于治疗微尘造成的皮肤损伤的组合物，该组合物将选自由下列所组成的组中的任一种或多种的表达调控到正常水平：IL‑1a(NM_000575)、IL‑1B(NM_000576)、IL‑36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)、和XDH(NM_000379)，这些是皮肤细胞中的基因并且其表达受微尘影响。通过使用用于治疗微尘造成的皮肤的损伤的组合物，可使因微尘而改变的基因表达回到正常水平，从而可以治疗皮肤细胞损伤。

Description

用于治疗微尘造成的皮肤细胞损伤、增强皮肤障壁、及抗老化 或抗发炎的包含野薄荷提取物的组合物
技术领域
本发明涉及用于护理微尘对皮肤细胞的损伤的组合物，尤其是包含野薄荷提取物的组合物，并且该组合物通过显著改变生物标记等来处理皮肤细胞损伤，该生物标记是表达水平与正常状态相比因微尘而改变的皮肤细胞基因。
背景技术
皮肤是身体的一部分，直接暴露在外部环境中。皮肤不仅作为保护我们身体重要器官的保护层，而且还调节水分蒸发并保护身体免受外部感染。然而，即使皮肤是为了防止病毒从外部侵入，皮肤过度暴露于紫外线或污染物会引起皮肤刺激。尤其是，皮肤被伴随着强风及污垢的亚洲沙尘(Asian dust)所损伤。
亚洲沙尘是一种现象，其中小沙子或红色黏土从中国、蒙古等内陆沙漠漂浮，被上风带远然后落在地面附近。在韩国，每年春天都会周期性地发生亚洲沙尘。亚洲沙尘是有机和无机材料的组合，而其物理特性和成分根据发生的时间和地点是非常多样化的。它还包括可产生生物效应的金属。大颗粒的亚洲沙尘通常留在其源头或周围环境中，而小颗粒甚至流入韩国。据报导，当吸入时，这些灰尘沉积在下支气管甚至在肺的气体交换部分中，这可能对呼吸***造成损伤。此外，发现生活在尘土飞扬的地区或有大量亚洲沙尘的地区的人的皮肤中，皮肤细胞损伤增加。
同时，在皮肤层当中，在预防人体内水分蒸发方面，表皮扮演了重要角色。表皮层从外到内依次为：角质层(stratum corneum)、颗粒层(stratum granulosum)、棘层(stratum spinosum)、和基底层(stratum basale)。角质层的细胞像砖一样作用，且角质层细胞之间的细胞间脂质像砂浆一样构成皮肤障壁。此外，健康的人的角质层细胞具有高浓度的天然保湿因子(Natural moisturzing factor，NMF)，其有助于保持皮肤中的水分。例如，诸如氨基酸的物质是水溶性的，因此有效地与水分结合以防止皮肤的水分干燥。
然而，如今，由于各种原因，诸如由于环境或生活方式的变化造成的冷却/加热的人工温度控制、由于社会生活的压力和环境污染造成的皮肤压力、由化妆习惯引起的频繁洗涤、以及由于年龄增长造成的皮肤自然老化、角质层的水分减少，使得皮肤变得干燥、皮肤表面变得粗糙、并且皮肤变得松弛且由于缺乏水分等而看起来变色。因此，对皮肤保湿剂的需求增加。此外，来自外部过多的物理和化学刺激、紫外线、压力和营养缺乏，使皮肤的正常功能退化且促进诸如失去弹性、角质化、和皱纹形成的现象。具体而言，真皮-表皮边界受到紫外线的严重破坏。
IL-36G被认为是由皮肤障壁薄弱(skin barrier weakness)引起的牛皮癣(psoriasis)中有用的生物标记(biomarker)(参见非专利文献1)。S100A7也被认为是由皮肤障壁功能破坏引起的异位性皮肤炎(atopic dermatitis)和牛皮癣的指标(参见非专利文献2)。LCE3D也被认为是牛皮癣风险基因的指标(indicator)(参见非专利文献3)。
介白素-1(Interleukin-1)归类为衰老相关的分泌表型(senescence-associatedsecretory phenotype，SASP)。具体地，已知作为代表性老化标记物(aging markers)的介白素1a及1b(IL-1a及IL-1b)参与细胞衰老(cellular senescence)(参见非专利文献4)。还已知IL-1a、IL-1b、及PTGS2参与皮肤发炎(skin inflammation)，并且XDH表示因长期暴露于刺激源所诱导的氧化压力(oxidative stress)并因此是外在皮肤老化(skin aging)的指标(参见非专利文献5)。关于皮肤发炎，还已知暴露于刺激源的皮肤细胞中PTGS2(＝COX-2)和IL-1a的表达水平(expression level)增加(参见非专利文献6)。还已知作为氧化压力指标的XDH(黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase))参与皮肤老化。
引文列表
非专利文献
非专利文献1：
AM D’Erme等人，“IL-36c(IL-1F9)Is a Biomarker for Psoriasis Skin Lesions”,Journal of Investigative Dermatology,Volume 135,2015。
非专利文献2：
Son等人，“S100A7(psoriasin)inhibits human epidermal differentiation byenhanced IL-6secretion through IjB/NF-jB signalling”,ExperimentalDermatology,John Wiley&Sons A/S,2016。
非专利文献3：
Bergboer等人，“Psoriasis Risk Genes of the Late Cornified Envelope-3GroupAre Distinctly Expressed Compared with Genes of Other LCE Groups”,TheAmerican Journal of Pathology,Vol.178,No.4,April 2011。
非专利文献4：
Jean-Philippe Coppe等人，“The Senescence-Associated Secretory Phenotype:The Dark Side of Tumor Suppression”,Annual Review of Pathology:Mechanisms ofDisease,volume 5,2010。
非专利文献5：
Kim,H.J.等人，“Transcriptome analysis of airborne PM2.5-induceddetrimental effects on human keratinocytes”,Toxicology Letters 273,26-35,2017。
非专利文献6：
Natalia D Magnani等人，“Skin Damage Mechanisms Related to AirborneParticulate Matter Exposure”,toxicological sciences,149(1),2016,227-236。
发明内容
本发明人已经发现微尘对皮肤具有有害作用，这继而影响皮肤细胞基因的表达、引起诸如皮肤细胞损伤的症状。
因此，本发明的一方面是提供一种用于护理微尘对皮肤细胞的损伤的组合物。
为了实现上述目标，本发明的一方面提供一种外用于皮肤以护理微尘对皮肤的损伤的组合物，该组合物包含野薄荷提取物作为活性成分，并且该组合物调节至少一种选自由下列所组成的组的表达水平使：IL-1a(NM_000575)、IL-1B(NM_000576)、IL-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)、及XDH(NM_000379)，这些是皮肤细胞中表达水平受微尘影响的基因。
附图说明
图1显示用微尘提取物处理时的细胞存活率(cell viabilities)。这里，ADSP代表亚洲沙尘暴粒子(Asian dust storm particle)，是指亚洲沙尘，PM10(微粒物质10(particulate matter 10))是指粒径(particle size)为10μm的微尘，而PM2.5(微粒物质2.5)是指粒径为2.5μm的微尘；
图2a显示受PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中S100A7基因的mRNA表达水平增加；
图2b显示受PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中IL-1A基因的mRNA表达水平增加；
图2c显示受PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中IL-1B基因的mRNA表达水平增加；
图2d显示受PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中IL-36G基因的mRNA表达水平增加；
图2e显示受PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中PTGS2基因的mRNA表达水平增加；
图2f显示受PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中LCE3D基因的mRNA表达水平增加；
图2g显示受PM2.5微尘刺激的皮肤细胞中XDH基因的mRNA表达水平增加；
图3a显示，通过用野薄荷提取物处理，受微尘刺激的皮肤细胞中所改变的S100A7基因表达水平回到正常水平；
图3b显示，通过用野薄荷提取物处理，受微尘刺激的皮肤细胞中所改变的IL-1A基因表达水平回到正常水平；
图3c显示，通过用野薄荷提取物处理，受微尘刺激的皮肤细胞中所改变的IL-1B基因表达水平回到正常水平；
图3d显示，通过用野薄荷提取物处理，受微尘刺激的皮肤细胞中所改变的IL-36G基因表达水平回到正常水平；
图3e显示，通过用野薄荷提取物处理，受微尘刺激的皮肤细胞中所改变的PTGS2基因表达水平回到正常水平；
图3f显示，通过用野薄荷提取物处理，受微尘刺激的皮肤细胞中所改变的LCE3D基因表达水平回到正常水平；及
图3g显示，通过用野薄荷提取物处理，受微尘刺激的皮肤细胞中所改变的XDH基因表达水平回到正常水平。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
野薄荷是管状花目(Tubiflorae)唇形科(Lamiaceae)家族的多年生草本植物。野薄荷也称为薄荷或夜息香(mint或peppermint)。野薄荷的特征在于清爽和酷凉的味道。在凉爽的气候中生长时，它的叶子和茎具有浓郁的香气。它主要含有野薄荷醇(menthol)，并因此散发独特的香气。它还含有营养成分，诸如维生素。
在本发明的一方面中，所述组合物包含野薄荷提取物。
在本发明的一方面中，可使用野薄荷的叶或茎，但不限于此。
添加微生物的野薄荷具体地可以在22-30℃下发酵24-72小时。在一实施例中，将提取物在26℃下发酵约48小时。
在本发明的一方面中，可用特定的提取溶剂提取野薄荷以形成野薄荷提取物。
在本发明的一方面中，可通过用水或有机溶剂提取野薄荷叶或茎来制备野薄荷提取物。具体地，可通过用至少一种选自由下列所组成的组的提取溶剂提取野薄荷的叶或茎来制备：水、C1–C6无水或水合低级醇(hydrated lower alcohol)、丙酮、丁二醇、乙酸乙酯、二乙酸乙酯(diethyl acetate)、***、苯、氯仿、和己烷。
在一方面中，可在室温下提取野薄荷提取物。
在一方面中，可通过用提取溶剂提取然后进一步执行下列步骤中的至少一个来获得野薄荷提取物：过滤、浓缩、分离、和干燥。具体地，野薄荷提取物可经受至少一个过滤步骤。在一实施例中，其经受两个过滤步骤。
在一实施例中，分离步骤可包括离心步骤。
具体地，提取可使用下列极性溶剂和低极性溶剂中的至少一种：极性溶剂包括水、C1–C6无水或水合低级醇、丙酮、和丁二醇，而低极性溶剂包括乙酸乙酯、二乙酸乙酯、***、苯、氯仿、和己烷。
更具体地，溶剂可以是50-90％乙醇水溶液，并且可以是60-80％或65-75％乙醇水溶液。当溶剂是50-90％乙醇水溶液时，可从野薄荷中有效地提取活性成分。在一实施例中，溶剂可以是约70％乙醇水溶液。
在一方面中，提取物在提取后可在适当温度下在配备有冷却冷凝器(coolingcondenser)的蒸馏装置中在减压下浓缩。
然而，通过本领域常规方法提取可获得根据本发明的野薄荷提取物，并且提取方法不限于上述方法。
在本发明的一方面中，以组合物的总重量计，组合物可包含0.000001至30重量百分比的野薄荷提取物。当其含量是0.000001至30重量百分比时，野薄荷提取物得到护理微尘对皮肤的损伤的优异效果。
具体地，含量可以是0.0000001重量百分比或更多、0.0000005重量百分比或更多、0.0000007重量百分比或更多、0.0000009重量百分比或更多、0.000001重量百分比或更多、0.000002重量百分比或更多、0.000004重量百分比或更多、0.000006重量百分比或更多、0.000008重量百分比或更多、0.00001重量百分比或更多、0.00003重量百分比或更多、0.00005重量百分比或更多、0.00007重量百分比或更多、0.00009重量百分比或更多、0.0001重量百分比或更多、0.0003重量百分比或更多、0.0005重量百分比或更多、0.0007重量百分比或更多、0.0009重量百分比或更多、0.001重量百分比或更多、0.01重量百分比或更多、0.1重量百分比或更多、1重量百分比或更多、3重量百分比或更多、5重量百分比或更多、7重量百分比或更多、9重量百分比或更多、10重量百分比或更多、13重量百分比或更多、15重量百分比或更多、17重量百分比或更多、19重量百分比或更多、21重量百分比或更多、23重量百分比或更多、25重量百分比或更多、27重量百分比或更多、29重量百分比或更多、30重量百分比或更多、或31重量百分比或更多，以及32重量百分比或更少、31重量百分比或更少、30重量百分比或更少、29重量百分比或更少、28重量百分比或更少、26重量百分比或更少、24重量百分比或更少、22重量百分比或更少、20重量百分比或更少、18重量百分比或更少、16重量百分比或更少、14重量百分比或更少、12重量百分比或更少、10重量百分比或更少、9重量百分比或更少、8重量百分比或更少、6重量百分比或更少、4重量百分比或更少、2重量百分比或更少、1重量百分比或更少、0.1重量百分比或更少、0.09重量百分比或更少、0.04重量百分比或更少、0.01重量百分比或更少、0.006重量百分比或更少、0.001重量百分比或更少、0.0009重量百分比或更少、0.0007重量百分比或更少、0.00005重量百分比或更少、0.00003重量百分比或更少、0.00001重量百分比或更少、0.000009重量百分比或更少、0.000007重量百分比或更少、0.000005重量百分比或更少、0.000003重量百分比或更少、0.000001重量百分比或更少、0.0000009重量百分比或更少、0.0000007重量百分比或更少、0.0000005重量百分比或更少、0.0000003重量百分比或更少、0.0000002重量百分比或更少、0.0000001重量百分比或更少、0.00000009重量百分比或更少，但不限于此。
本发明的另一方面包括使用组合物来护理微尘对皮肤的损伤。
本发明的另一方面提供一种用于护理受试者中微尘对皮肤的损伤的方法，该方法包含将有效量的野薄荷提取物施予有其需要的受试者。
本发明的另一方面提供野薄荷提取物在制备用于护理微尘对皮肤的损伤的组合物中的用途。
本发明的另一方面提供用于护理微尘对皮肤的损伤。的野薄荷提取物
如本文中所使用，术语“微尘”是指肉眼不可见的非常小的物质。其是长时间在空气中漂浮或颤振(flutter)并且直径为10μm或更小的颗微粒物质。尤其是直径为2.5μm或更小的微粒物质称为“超微粒子(ultrafine particle)”。在本发明中，“微尘”旨在包括“超微粒子”。
如本文中所使用，术语“护理(care)”是指有效保护皮肤细胞免受刺激，并且抑制、预防或复原(restoration)(恢复(recovery))因刺激引起的特定基因表达水平的变化。
在一方面中，本发明提供一种用于通过将因微尘而损伤的皮肤细胞中特定基因的表达水平调控至正常水平来抑制微尘对皮肤细胞的损伤的组合物。
具体地，在本发明中，皮肤细胞中其表达水平受微尘影响的基因包括：IL-1a(NM_000575)、IL-1B(NM_000576)、IL-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)、及XDH(NM_000379)。IL-1a(NM_000575)、IL-1B(NM_000576)、IL-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)、及XDH(NM_000379)是表达水平因微尘而增加的基因。因此，可通过将这些基因的表达水平压制到正常水平来抑制皮肤细胞的损伤。
本发明中所使用且其表达水平因微尘而增加的基因示于表1。表1显示其表达水平因微尘而增加的基因。在该表中，术语“名称(name)”表示NCBI的基因库登录ID，术语“基因符号(gene symbol)”表示官方的基因符号，并且术语“基因标题(gene title)”表示各基因的名称。这些描述于非专利文献1中。
表1
Figure GDA0002599020650000101
Figure GDA0002599020650000111
可使用本领域已知的各种分析方法分析基因或蛋白质的表达水平，诸如微阵列、PCR、NGS(下一代测序法)、西方墨点法(western blot)、北方墨点法(northern blot)、ELISA、放射免疫分析(radioimmunoassay)、放射免疫扩散(radioimmunodiffusion)、免疫组织化学染色(immunohistochemical staining)、免疫沉淀法(immunoprecipitationassay)等。
微尘会对皮肤细胞造成损伤，从而导致发炎并因此进一步损伤皮肤细胞。通过用野薄荷提取物处理皮肤细胞的损伤的恶性循环，可改善皮肤状况。
本发明的另一方面包括使用本发明的组合物来抗老化及抗发炎。
本发明的另一方面提供一种用于受试者的抗老化的方法，该方法包含将有效量的野薄荷提取物施予有其需要的受试者。
本发明的另一方面提供野薄荷提取物在制备用于抗老化的组合物中的用途。
本发明的另一方面提供用于抗老化的野薄荷提取物。
本发明的另一方面提供一种用于受试者的抗发炎的方法，该方法包含将有效量的野薄荷提取物施予有其需要的受试者。
本发明的另一方面提供野薄荷提取物在制备用于抗发炎的组合物中的用途。
本发明的另一方面提供用于抗发炎的野薄荷提取物。
在一方面中，本发明提供一种通过将受发炎或老化刺激而损伤的皮肤细胞中特定基因的表达水平调控至正常水平来抑制发炎或老化的组合物。
在本发明的一方面中，其表达水平受发炎或老化刺激而影响的皮肤细胞中的基因具体包括：IL-1a(NM_000575)、IL-1B(NM_000576)、PTGS2(NM_000963)、及XDH(NM_000379)。IL-1a(NM_000575)、IL-1B(NM_000576)、PTGS2(NM_000963)、及XDH(NM_000379)是表达水平受发炎或老化刺激而增加的基因。因此，可通过将这些基因的表达水平压制到正常水平来抑制皮肤细胞的发炎或老化。
在一方面中，本发明中所使用且其表达水平因发炎或老化刺激而增加的基因示于表2中。在该表中，术语“名称”表示NCBI的基因库登录ID，术语“基因符号”表示官方的基因符号，以及术语“基因标题”表示各基因的名称。
表2
Figure GDA0002599020650000121
Figure GDA0002599020650000131
本发明的另一方面包括使用本发明的组合物来增强皮肤障壁。
在一方面中，本发明提供一种通过将由于诱导皮肤障壁薄弱的刺激而损伤的皮肤细胞中特定基因的表达水平调控至正常水平来增强皮肤障壁的组合物。
在本发明的一方面中，皮肤细胞中其表达水平受诱导皮肤障壁薄弱的刺激影响的基因具体包括：S100A7(NM_002963)、IL-36G(NM_019618)、及LCE3D(NM_032563)。S100A7(NM_002963)、IL-36G(NM_019618)、及LCE3D(NM_032563)是表达水平由于诱导皮肤障壁薄弱的刺激而增加的基因。因此，可通过将这些基因的表达水平压制到正常水平来增强皮肤障壁。
在一方面中，本发明中所使用且其表达水平由于诱导皮肤障壁薄弱的刺激而增加的基因示于表3中。在该表中，术语“名称”表示NCBI的基因库登录ID，术语“基因符号”表示官方的基因符号，以及术语“基因标题”表示各基因的名称。
表3
Figure GDA0002599020650000132
本发明的另一方面提供一种用于增强皮肤障壁的方法，该方法包含将有效量的野薄荷提取物施予有其需要的受试者。
本发明的另一方面提供野薄荷提取物在制备用于增强皮肤障壁的组合物制造中的用途。
本发明的另一方面提供用于增强皮肤障壁的野薄荷提取物。
在本发明的一方面中，组合物可以是化妆品组合物、药物组合物、或保健功能性食品组合物。
化妆品组合物的实例包括化妆品，诸如各种乳霜(cream)、乳液(lotion)、及爽肤水(toner)，以及清洁产品、清洁剂(cleanser)、肥皂、及化妆液(cosmetic solution)。
在一方面中，包含含有本发明的野薄荷提取物的组合物的化妆品可以是溶液、乳液(emulsion)、黏性混合物等形式。
即，在一方面中，本发明的化妆品剂型没有特别限制并且可以是例如乳液、乳霜、爽肤水(toner)、精华液(essence)、面膜(pack)、凝胶(gel)、蜜粉(powder)、妆前底霜(makeup base)、粉底(foundation)、洗剂(lotion)、软膏(ointment)、修补液(patch)、化妆液(cosmetic solution)、洁肤泡沫(cleansing foam)、洁肤霜(cleansing cream)、洁肤水(cleansing water)、润肤乳(body lotion)、润肤霜(body cream)、润肤油(body oil)、润肤精华液(body essence)、洗发精(shampoo)、润丝精(rinse)、沐浴乳(body cleanser)、肥皂(soap)、染发剂(hair dye)或喷雾剂(spray)。
根据所需的剂型或目的，本领域技术人员可毫无困难地选择除了野薄荷提取物以外的成分并将其添加至各剂型的化妆品组合物中。
此外，在一方面中，本发明的化妆品可包含选自由下列所组成的组的组合物：水溶性维生素、油溶性维生素、多肽、多醣、神经鞘脂质、及海藻提取物。
此外，在一方面中，如果需要，本发明的化妆品可含有除了必需成分之外通常用于化妆品中的成分。
额外成分的实例包括油脂成分、保湿剂、润滑剂、界面活性剂、有机和无机颜料、有机粉末、UV吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、醇类、着色剂、香料、血液循环***、皮肤冷却器、止汗剂、纯化水等。
然而，化妆品中可含有的成分不限于此。还有，可在不负面影响本发明的目的及效应的范围内决定任何这些成分的量。
在一方面中，包含本发明的野薄荷提取物的药物组合物可进一步包含习知用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂、及稀释剂。
包含野薄荷提取物的药物组合物根据常规方法可配制成适合于药物制剂(pharmaceutical preparation)的任何形式，包括口服剂型诸如片剂、胶囊、粉末、或糖浆，以及外用于皮肤的试剂诸如软膏、凝胶、乳膏、贴剂、及喷雾剂。
通常，应理解以药物组合物施用的活性成分的实际剂量应鉴于各种相关因素而判定，诸如症状的严重程度、给药途径、年龄、性别、体重、及受试者的健康状况。通常，活性成分的剂量可以是0.0001mg/kg/天至3000mg/kg/天，例如10mg/kg/天至500mg/kg/天。
在根据本发明的一方面的保健功能食品组合物中，保健食品可指由这样的营养素制成的食品：正常饮食中可能缺乏或作为具备对人体有用的功能的原料或成分(功能性原料)，并且通过维持人体的正常功能或活化生理机能(physiological function)来维持并改善健康，但不限于此。可将保健食品制备并加工成片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体、丸剂等形式。然而，剂型不限于此，并且可在法律的规定的下制造及加工成任何形式。
具体地，除了以预定比例作为必需成分含有的上述化合物以外，保健饮料组合物在成分上没有特别限制。其可含有各种调味剂或天然碳水化合物作为常规饮料中的额外成分。天然碳水化合物的实例是常规糖诸如单醣、多醣、及环糊精(cyclodextrin)，以及糖醇诸如木糖醇(xylitol)、山梨糖醇(sorbitol)、及赤藻糖醇(erythritol)。还有，天然调味剂(索马甜(thaumatin)、甜菊(stevia)提取物(例如，莱鲍迪苷A(rebaudioside A)、甘草素(glycyrrhizin)等))及合成调味剂(例如糖精(saccharin)、阿斯巴甜(aspartame)等)可用作调味剂。
通常，应理解以保健功能性食品组合物施用的活性成分的实际剂量应鉴于各种相关因素而判定，诸如症状的严重程度、给药途径、年龄、性别、体重、及受试者的健康状况。通常，活性成分的剂量可以是0.0001mg/kg/天至1000mg/kg/天，例如0.02mg/kg/天至6mg/kg/天。
在下文中，将参照实例更详细地描述本发明的组成及效果。然而，提供下列实例仅用于说明目的以便于理解本发明，并且本发明的范畴不限于此。
实例1：野薄荷提取物的制备
制备野薄荷叶及醋酸菌(Acetobacter aceti)，并在26℃下发酵48小时。然后，使用通过以3：7的比例混合纯化水与乙醇(即，70％乙醇)获得的提取溶剂作为提取溶剂，在室温下提取发酵产物。在室温下提取后，进行初级过滤以移除提取物中所含有的固体物质。然后，将提取液浓缩以移除乙醇，接着分离及纯化。然后，将所得物进行离心及二次过滤，然后干燥以获得野薄荷提取物。
实例2：微尘收集及提取
使用低容量空气采样器(Sensidyne,Gillian,FL,U.S.A.)收集微尘。在各测量日的上午约10:00更换过滤组(filter pack)的过滤器及分离器(denuder)，以收集样本达约24小时。在首尔的顺风区(韩国外语研究大学国际研究中心，龙仁市京畿道前宁区宿舍大楼6楼屋顶)每天收集微尘达28天。在打开真空泵时启动定时器并在关闭真空泵时记录定时器的时间来测量测量时间。收集流速设定在16.7L/min。在测量开始时用流量计(型号4143，TSI Inc.)测量流速，并在测量结束时再次测量。在收集之前和之后将过滤组中的特夫纶(Teflon)过滤器进行称重。将特夫纶过滤器在40％的相对湿度下的干燥器(NIKKO,Japan)中干燥24小时至恒重，之后测量特夫纶过滤器的重量，然后在小数点后5位电子天平(DVG215CD,Ohaus)上称重两次。记录平均值。收集样本后，在测量重量之前，将特夫纶过滤器再次在干燥器中干燥24小时至恒重，然后称重两次。接着，通过将测量的重量与收集前测量的重量进行比较来计算质量浓度。微尘提取如下：用1mL的乙醇润湿特夫纶过滤器并放置14mL的DW使得过滤器的气溶胶收集器表面达到水面，关上盖子，然后用超音波清洗器对过滤器施加超音波30分钟。为了使过滤步骤中因水分引起的误差最小化，在干燥器中使水分从过滤器中完全移除达48小时。然后，使用可以向下测量到0.1mg的超精度天平(MettlerToledo Company)测量过滤器的重量，以测量提取之前和之后的过滤器重量。
实例3：角质形成细胞系(keratinocyte line)的培养(正常人)
角质形成细胞系(正常人)购自Lonza Inc.(Walkersville,Maryland,USA)、经继代培养(subcultured)，然后在37℃及5％CO2的条件下在CO2培养器中培养。按照Lonza的指南进行细胞培养。将KGM-2bullet kit CC-4152(成分：BPE(牛垂体提取物))、人类表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)、胰岛素、氢化皮质酮(hydrocortisone)、转铁蛋白(transferrin)、肾上腺素(epinephrine)、及添加有GA-1000(庆大霉素硫酸盐(gentamycin suflate)+双性霉素-B(amphotericin-B))的KGM-2bullet kit CC-3107，添加至500ml的KBM-2CC-3103培养基中，以制备用于细胞培养的培养基。
实例4：用微尘处理角质形成细胞系(正常人)并测量细胞毒性(cytotoxicity)
为了研究用微尘处理的细胞毒性，根据Mossman等人的方法(J.Immunol.Methods,65,55-63,1983)用角质形成细胞系(正常人)进行MTT试验。
具体地，使用24孔板。将实例2中获得的直径2.5μm的微尘分散在纯化水中以制备微尘分散体。然后，将微尘分散体施用于在实例3的条件下培养的细胞且每孔2.5×105个细胞，接着培养24小时。然后，将细胞与5mg/ml的MTT(溴化3-4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯四唑(3-4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetrazolium bromide))混合，并在37℃下进一步培养3小时。然后移除培养基，并将所形成的甲臜晶体(formazan crystal)溶解在500μl的DMSO中。将裂解液等分至96孔板中，并在540nm处测量OD值。测量结果显示于图1。
如图1所示，对于通过分散2.5微米或更小的微尘获得的分散体所引起的细胞毒性，在细胞系中达到80％存活率的浓度(IC20)是12.5μg/ml。
实例5：透过下一代测序法研究细胞基因因微尘的变化
为了进行RNA碱基序列数据处理和分析，参考Trapnell等人(2012)开发的一般分析步骤。使用FastQC测定RNA-seq数据质量(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)。使用FASTX移除准确度低的碱基和接合子序列(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)。然后，使用Tophat(Trapnell等人，2009)及人类基因体(hg19)进行比对，并且使用更名为RSeQC的EVER-seq来判定各样本的数据量(Wang等人，2012)。此外，使用Cufflinks将转录物(transcript)的表达水平进行量化，并且比较用微尘分散体处理的样本与正常样本之间的转录水平(transcription level)(Trapnell等人，2010)。使用≥2.0倍-变化的严格截止值(stringent cut-off)以及经FDR调整的p-值<0.05来判定当用直径2.5μm的微尘的分散体处理时显示显著表达差异的基因。测量结果示于下列表4及图2a至图2g。
表4
Figure GDA0002599020650000191
实例6：实时聚合酶连锁反应(RT-PCR)定量
用实例2中所提取的直径2.5μm的微尘、以每1ml细胞培养基12.5μg的量处理实例3中培养的正常人角质形成细胞。然后，使用下表5中指明的基因的引物(appliedbiosystems
Figure GDA0002599020650000202
Primers)测量相对mRNA表达水平。将实例1中制备的提取物用作野薄荷提取物。
表5
Figure GDA0002599020650000201
用20ppm的野薄荷提取物处理培养基。24小时之后，移除培养液，并用2ml磷酸盐缓冲液(phospate buffered saline，PBS)洗涤细胞。然后，使用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)自细胞中分离出RNA。用RNA试剂盒(QIAGEN RNeasy kt,QIAGEN,Valencia,CA)进一步纯化分离的RNA。然后，使用Agilent 2100BioAnalyzer(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA,USA)测定RNA的品质。使用反转录试剂盒(SuperscriptReverse Transcriptase(RT)kit,Invitrogen,Carlsbad,CA)自RNA合成cDNA。使用表5中所示的引物通过实时反转录聚合酶链锁反应(Q-RT-PCR)对cDNA进行定量分析。使用TaqMan基因表达检测试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA)通过实时PCR评估细胞基因的变化。结果显示于图3。根据Life Technologies发布的标准方案执行Q-RT-PCR和实时PCR两者。具体地，进行40个下列循环：95℃持续20秒、95℃持续3秒、及60℃持续30秒。
图3a至图3g显示存在着表达水平在受微尘刺激的皮肤细胞中增加或降低的基因。还有，发现了介白素-1α(IL-1a)、介白素1β(IL-1B)、介白素3素-36γ(IL-36G)、S100钙结合蛋白A7(S100A7)、晚期角质化包膜3D(LCE3D)、***素-内过氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase-2)(PTGHS2)、及黄嘌呤脱氢酶(XDH)基因的表达水平通过用野薄荷提取物处理而降低。
此外，图3a至图3g显示存在着表达水平在因发炎或老化刺激而受刺激的皮肤细胞中增加的基因。还有，发现了介白素-1α(IL-1a)、介白素-1β(IL-1B)、***素-内过氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase-2)(PTGHS2)、及黄嘌呤脱氢酶(XDH)基因的表达水平通过用野薄荷提取物处理而降低。
因此，发现了野薄荷提取物有效地保护皮肤细胞免受因发炎或老化刺激而引起的皮肤细胞损伤，并抑制或预防上述特定基因的表达水平因发炎或老化刺激而改变，从而达到正常表达水平。
此外，图3a至图3g显示存在着表达水平在因诱导皮肤障蔽薄弱的刺激而受刺激的皮肤细胞中增加的基因。还有，发现了介白素36γ(IL-36G)、S100钙结合蛋白A7(S100A7)、及晚期角质化包膜3D(LCE3D)基因的表达水平通过用野薄荷提取物处理而降低。
因此，发现了野薄荷提取物有效地保护皮肤细胞免受因诱导皮肤障蔽薄弱的刺激而引起的皮肤细胞损伤，并抑制或预防上述特定基因的表达水平因诱导皮肤障蔽薄弱的刺激而改变，从而达到正常表达水平。
因此，发现野薄荷提取物有效地保护皮肤细胞免受微尘的刺激，并抑制或预防上述特定基因的表达水平因刺激而改变，从而达到正常表达水平。
在下文中，将描述根据本发明的组合物的剂型实例。然而，化妆品组合物、药物组合物、及保健功能性食品组合物可配制成各种其他形式。这些实例仅用于说明目的，并不意图限制本发明的范畴。
剂型实例1：片剂
将100mg根据本发明实施例的野薄荷提取物、400mg的乳糖、400mg的玉米淀粉、及2mg的硬脂酸镁混合，并根据制备片剂的常规方法使其经受压片过程(tableting process)以制备片剂。
表6
成分 含量(mg)
野薄荷提取物 100
乳糖 400
玉米淀粉 400
硬脂酸镁 2
剂型实例2：胶囊
将100mg根据本发明实施例的野薄荷提取物、400mg的乳糖，400mg的玉米淀粉、及2mg的硬脂酸镁混合，并根据制备胶囊的常规方法将其填充至明胶胶囊中以制备胶囊。
表7
成分 含量(mg)
野薄荷提取物 100
乳糖 400
玉米淀粉 400
硬脂酸镁 2
剂型实例3：颗粒
将50mg根据本发明实施例的野薄荷提取物、250mg的无水结晶葡萄糖、及550mg的淀粉混合，并使用流体化床制粒机(fluidized bed granulator)配制成颗粒。然后将颗粒装入小袋中。
表8
成分 含量(mg)
野薄荷提取物 50
无水结晶葡萄糖 250
淀粉 550
剂型实例4：肥皂
表9
Figure GDA0002599020650000231
Figure GDA0002599020650000241
剂型实例5：乳液
表10
Figure GDA0002599020650000242
剂型实例6：乳霜
表11
Figure GDA0002599020650000243
Figure GDA0002599020650000251
剂型实例7：软膏
表12
Figure GDA0002599020650000252
Figure GDA0002599020650000261
剂型实例8：化妆品溶液的制备
表13
Figure GDA0002599020650000262
剂型实例9：保健食品
表14
Figure GDA0002599020650000263
Figure GDA0002599020650000271
剂型实例10：保健饮料
表15
Figure GDA0002599020650000272
Figure GDA0002599020650000281

Claims (19)

1.一种用于护理微尘对皮肤细胞的损伤的组合物，所述组合物包含野薄荷提取物作为活性成分。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，
护理微尘对皮肤细胞的损伤是选自由增强皮肤障壁、抗老化、及抗发炎所组成的组中的至少一种。
3.一种用于增强皮肤障壁的组合物，所述组合物包含野薄荷提取物作为活性成分。
4.一种用于抗老化的组合物，所述组合物包含野薄荷提取物作为活性成分。
5.一种用于抗发炎的组合物，所述组合物包含野薄荷提取物作为活性成分。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述野薄荷提取物的含量，以所述组合物的总重量计，是0.000001至30重量百分比。
7.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述野薄荷提取物用选自由水、C1–C6无水或水合低级醇、丙酮、丁二醇、乙酸乙酯、二乙酸乙酯、***、苯、氯仿、和己烷组成的组中的至少一种提取溶剂来提取。
8.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述野薄荷提取物是从野薄荷的叶提取而来。
9.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述野薄荷是发酵的野薄荷，并且
通过添加醋酸菌属微生物进行发酵。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，
所述醋酸菌属微生物是醋酸菌。
11.如权利要求1至2中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述组合物抑制选自由下列所组成的组中的至少一种的表达：IL-1a(NM_000575)、IL-1B(NM_000576),、L-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、LCE3D(NM_032563)、PTGS2(NM_000963)、及XDH(NM_000379)。
12.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，
所述组合物抑制选自由下列所组成的组中的至少一种的表达：L-36G(NM_019618)、S100A7(NM_002963)、及LCE3D(NM_032563)。
13.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，
所述组合物抑制选自由下列所组成的组中的至少一种的表达：IL-1a(NM_000575)、IL-1B(NM_000576)、PTGS2(NM_000963)、及XDH(NM_000379)。
14.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，
所述组合物抑制选自由下列所组成的组中的至少一种的表达：IL-1a(NM_000575)、IL-1B(NM_000576)、及PTGS2(NM_000963)。
15.如权利要求11至14中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述组合物作用于角质形成细胞(keratinocyte)。
16.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述野薄荷提取物以10mg/kg/day至500mg/kg/day的剂量施用。
17.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述组合物是化妆品组合物。
18.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述组合物是药物组合物。
19.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其特征在于，
所述组合物是保健功能性食品组合物。
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