CN111647585A - 一种尿激酶的精制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿激酶的精制方法，属于尿激酶纯化技术领域。该方法包括以下步骤：取尿激酶中间体溶液，上凝胶色谱柱，用平衡缓冲液洗脱，收集中段洗脱液，得到精制的尿激酶溶液；其中，所述凝胶色谱的填料包括Superdex 75pg/GE、Superdex 200pg/GE、Sephacryl S‑100HR/GE、Chromadex 75PG/BESTCHROM、Chromadex 200PG/BESTCHROM中的至少一种。该方法简便、安全、环保，纯度高、回收率好，适用范围广，通过优化各项工艺参数，仅需要通过一次凝胶色谱柱，满足量产经济效益要求。
Description
技术领域
本发明属于尿激酶纯化技术领域，具体涉及一种尿激酶的精制方法。
背景技术
尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物，是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种碱性蛋白，等电点在PH8.7左右，为白色非结晶状粉末，易溶于水。稀溶液性状不稳定，必须新鲜配用，且不得用酸性溶液稀释，冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似，也有酯酶的活力，无抗原性，不使体内产生抗体。体内半衰期为(14±6)min。
尿激酶能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以，尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且它无抗原性问题，可长时间使用。
尿激酶的精制过去一直采用D-160吸附树脂，吸附树脂存在的主要问题是处理步骤繁琐，大量使用强酸强碱，环保压力大，且大体积强酸的使用对工作环境和人的伤害也比较大。
中国专利申请200410018835.6公开了一种重组人尿激酶原的纯化方法，包括以下步骤：A.用阳离子交换Streaml ine-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶原；B.用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗产品；C.用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；D.用DEAE-SepharoseFast Flow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞的DNA,采用上述方法得到符合SFDA要求的重组人尿激酶原，总回收率在70％以上，纯度达到99％以上。
中国专利申请201711260186.4公开了一种1,一种溶血栓新药一重组人尿激酶原的四步纯化工艺，由羧甲基径向离子交换色谱(CM-RIEC)、微孔玻璃珠吸附色谱(MPG)、葡聚糖聚丙稀酰氨高效凝胶色谱(Sephacryl S-200HR)和对氨基本甲眯亲和色谱(PABZ)四步组成，其特征在于CM-径向离子交换色谱法与其他三个方法的组合配套。纯化后尿激酶原比活性要提高280多倍，能除去杂蛋白98％以上，总回收率达到50％以上。
但是以上方法均需要凝胶色谱与其他色谱柱联用，多次上不同的色谱柱，大大提高了纯化流程的复杂程度。
中国专利申请201710311962.2公开了一种尿激酶的分离纯化方法，该方法包括如下步骤：1)尿激酶粗品的制备；2)尿激酶的纯化；所述的步骤2)包括如下步骤：将步骤1)制得的尿激酶粗品溶解后的澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱进行纯化。本申请提供的分离纯化方法，可同时提高尿激酶比活性达至2万IU/mg蛋白以上，收率达75-87％，大小分子尿激酶的比例大于85％。该方法制备的粗品依次通过硅藻土柱和CM-C柱制得，纯度已经得到一定提高，直接用其纯化步骤用来纯化成品尿激酶产品不能取得同样的效果。
有鉴于此，本发明提供了一种简便、安全、环保的尿激酶精制方法，纯度高、回收率好，适用范围广，该方法通过优化各项工艺参数，仅需要通过一次凝胶色谱柱，满足量产经济效益要求。
发明内容
本发明的目的是在保证尿激酶纯度和回收率的前提下，采用高分辨率凝胶色谱，结合其他工艺条件的优化，简化尿激酶的纯化流程，满足量产经济效益要求，同时不需要使用强酸，安全环保。
为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：
一种尿激酶的精制方法，包括以下步骤：
取尿激酶中间体溶液，上凝胶色谱柱，用平衡缓冲液洗脱，收集中段洗脱液，得到精制的尿激酶溶液。
其中，所述凝胶色谱柱的填料包括Superdex 75pg/GE、Superdex 200pg/GE、Sephacryl S-100HR/GE、Chromadex 75PG/BESTCHROM、Chromadex 200PG/BESTCHROM中的至少一种，优选为Superdex 75pg。
优选的，所述尿激酶中间体溶液为人尿激酶中间体溶液，其纯度优选为65-85％，进一步优选为70％。
优选的，所述上凝胶色谱柱的蛋白浓度为2-20mg/mL，进一步优选为10mg/mL。
优选的，所述上凝胶色谱柱的上柱体积为柱体积的2-8％，进一步优选为5％。
优选的，所述平衡缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的至少一种，优选为柠檬酸盐缓冲液；所述缓冲液中含有氯化钠，缓冲液中氯化钠含量为150-500mM。
优选的，所述平衡缓冲液的pH4.5-8.0，进一步优选为6。
优选的，所述洗脱在电导值15-90ms/cm条件下进行，进一步优选为50ms/cm。
优选的，所述中段洗脱液是指保留时间40-70min的液体，进一步优选为55min。
优选的，在得到精制的尿激酶溶液后，还包括清洗的步骤；所述清洗步骤优选为：使用清洗溶液清洗柱子，再用注射水冲洗至中性；进一步优选的，所述清洗溶液为0.1-2M的NaOH溶液，所述清洗的时间为0.5-2小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
在保证良好的活性收率条件下，使用凝胶色谱工艺，操作简便，纯度高、回收率好，适用范围广；不使用强酸，环保压力小，工作环境和人员安全都有保障，经济效益满足企业量产要求。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所用的尿激酶中间体溶液为本公司自产，批号为20190426、20190518。
实施例1
取20190426批高纯人尿激酶中间体溶液，纯度为70％，按照蛋白浓度2mg/mL、柱体积2％上样体积，上高分辨率凝胶色谱柱Superdex 200pg，用pH4.5，含150mM氯化钠的醋酸盐缓冲液冲洗柱子，洗脱在电导值15ms/cm条件下进行。收集保留40min中段洗脱液，即为精制的尿激酶溶液。
完成后使用0.1M NaOH溶液清洗柱子2小时，用注射水冲洗至中性。
实施例2
取20190518批高纯人尿激酶中间体溶液，纯度为70％，按照蛋白浓度20mg/mL、柱体积8％上样体积，上高分辨率凝胶色谱柱Sephacryl S-100HR，用pH8.0，含500mM氯化钠的磷酸盐缓冲液冲洗柱子，洗脱在电导值90ms/cm条件下进行。收集保留70min中段洗脱液，即为精制的尿激酶溶液。
完成后使用2M NaOH溶液清洗柱子0.5小时，用注射水冲洗至中性。
实施例3
取20190426批高纯人尿激酶中间体溶液，纯度为70％，按照蛋白浓度10mg/mL、柱体积5％上样体积，上高分辨率凝胶色谱柱Superdex 75pg，用pH6，含150mM氯化钠的柠檬酸盐缓冲液冲洗柱子，洗脱在电导值50ms/cm条件下进行。收集保留55min中段洗脱液，即为精制的尿激酶溶液。
完成后使用1M NaOH溶液清洗柱子1小时，用注射水冲洗至中性。
实施例4
与实施例3不同的是，选用高分辨率凝胶色谱柱Chromadex 75PG，其余皆相同。
实施例5
与实施例3不同的是，平衡缓冲液选用Tris-HCl缓冲液，其余皆相同。
实施例6
与实施例1不同的是，选用高分辨率凝胶色谱柱Superdex 75pg，其余皆相同。
实施例7
与实施例1不同的是，上凝胶色谱柱的蛋白浓度为10mg/mL，其余皆相同。
对比例1
与实施例3不同的是，选用CM-葡聚糖微球柱，其余皆相同。
对比例2
与实施例3不同的是，选用CM-琼脂糖微球柱，其余皆相同。
对比例3
与实施例3不同的是，上凝胶色谱柱的蛋白浓度为30mg/mL，其余皆相同。
测试例
根据中国药典二部测定和计算实施例和对比例所的产品的纯度、活性收率，结果如表1所示。
表1.
| 批号 | 纯度 | 活性收率 |
| 实施例1 | 95％ | 76％ |
| 实施例2 | 95％ | 72％ |
| 实施例3 | 99％ | 83％ |
| 实施例4 | 97％ | 79％ |
| 实施例5 | 96％ | 78％ |
| 实施例6 | 95％ | 74％ |
| 实施例7 | 96％ | 76％ |
| 对比例1 | 88％ | 68％ |
| 对比例2 | 89％ | 67％ |
| 对比例3 | 91％ | 71％ |
从表1中可以看出，本发明实施例所的产品的纯度均不低于95％，活性收率不低于70％，实施例3为最佳实施例，其纯度为99％。活性收率为83％，证明该实施例下的各方面工艺参数为最佳。但是，由实施例6和7发现，单一因素的改变并不会明显提高最终效果，证明本方案的工艺参数综合作用提高了纯度和收率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种尿激酶的精制方法，其特征在于，包括以下步骤：
取尿激酶中间体溶液，上凝胶色谱柱，用平衡缓冲液洗脱，收集中段洗脱液，得到精制的尿激酶溶液；
其中，所述凝胶色谱柱的填料包括Superdex 75pg/GE、Superdex 200pg/GE、SephacrylS-100HR/GE、Chromadex 75PG/BESTCHROM和Chromadex200PG/BESTCHROM中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱的填料为Superdex 75pg/GE。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上凝胶色谱柱的蛋白浓度为2-20mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上凝胶色谱柱的蛋白浓度为10mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述上凝胶色谱柱的上柱体积为柱体积的2-8％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液的pH4.5-8.0。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱是在电导值15-90ms/cm条件下进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中段洗脱液是指保留时间40-70min的液体。
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|---|---|---|---|---|
| GB802326A (en) * | 1955-07-01 | 1958-10-01 | Knud Abildgaard | Method of recovering urokinase from urine |
| CN101024827A (zh) * | 2006-02-22 | 2007-08-29 | 中国科学院福建物质结构研究所 | 尿激酶催化结构域突变体的表达、纯化以及结晶 |
-
2020
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|---|---|---|---|---|
| GB802326A (en) * | 1955-07-01 | 1958-10-01 | Knud Abildgaard | Method of recovering urokinase from urine |
| CN101024827A (zh) * | 2006-02-22 | 2007-08-29 | 中国科学院福建物质结构研究所 | 尿激酶催化结构域突变体的表达、纯化以及结晶 |
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