CN111635870B - 发酵剂、臭豆腐卤液的直投式发酵方法及臭豆腐卤液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种发酵剂、臭豆腐卤液的直投式发酵方法及臭豆腐卤液。发酵剂为4株乳酸菌复配。臭豆腐卤液直投式发酵方法包括如下步骤：将发酵剂接种于卤液原液中，发酵剂在卤液原液中的初始总浓度为103‑6CFU/mL，并于30～45℃培养10～15h，然后以1～5％的体积比投入发酵氮源，继续发酵10～15h，获得臭豆腐卤液。上述方法通过特定的4种乳酸菌复配对卤液原液进行混合发酵，各原料和乳酸菌按照配比直投，在特定的发酵条件下发酵可得到质量和风味统一的臭豆腐卤液，且发酵周期短。
Description
技术领域
本发明属于臭豆腐卤液发酵技术领域。具体涉及一种发酵剂、臭豆腐卤液的直投式发酵方法及臭豆腐卤液。
背景技术
臭豆腐是中华民族的传统美食，其具有独特的风味及营养价值，其含有的丰富的人体必需氨基酸及VB12更是具有独特的生物活性。由于全国各地饮食习惯各不相同，臭豆腐的制作工艺、香气成分也是有较大的区别。传统的臭豆腐卤液通常使用蔬菜及香辛料为原料，以一定的配比自然发酵而成。湖南地区的臭豆腐卤液配方主要以豆豉、纯碱、青矾、香菇、冬笋等为原料自然发酵而成，所泡制的臭豆腐表面呈黑色；我国南方以绍兴为代表的地区的臭豆腐卤液配方则以苋菜梗、生姜、花椒等原料为主，所泡制的豆腐表面呈米白色。
在臭豆腐卤液的发酵过程中，微生物扮演着十分重要的角色，其微生物的种类及含量对臭豆腐卤液的风味的形成及营养价值的提升起着决定性的作用。臭豆腐卤液中挥发性香气成分相对含量较高的有醇类、酮类、酯类、醛类等物质(贺静,谢靓,刘军鸽,等.臭豆腐卤水发酵过程中挥发性成分的变化趋势分析[J].中国发酵,2016,35(7):79-84.)，还有烷烃类、醇类、醛类、酯类和酸类(郑小芬,苏悟,蒋立文.两种臭豆腐卤水中挥发性成分的比较[J].中国酿造,2013,32(10):122-125.)。其中，正丁醇带有醇香香气，桉树醇香气特征为樟脑气味，芳樟醇为铃兰香气，4-萜烯醇香气特征为木材、泥土香气，这些香气可以赋予臭豆腐卤液醇厚香气，构成卤液重要的香气特征(朱瑞鸿,薛群成,李忠臣,等.合成食用香料手册[M].北京:中国轻工业出版社,1993:25.)。上述几种醇类还存在于酱油、腐乳等物质中(LEE S J,AHN B.Comparison of volatile components in fermented soybean pastesusing simultaneous distillation and extraction(SDE)with sensorycharacterization[C].第十四届世界食品科技大会论文集.上海:中国食品科学技术学会,2008:10-19.)。刘玉平,苗志伟,黄明泉,等.臭豆腐中挥发性香成分提取与分离[J].食品科学,2011,32(24):228-231.及SHIOU H C,YASUAKI T,KOICHI W,et al.Diversity oflactic acid bacteria in fermented brines used to make stinky tofu[J].International journal of Food Microbiology.2008,123:134-141均报道了检测出臭豆腐的香气中有高丰度的正丁醇，因此，正丁醇为臭豆腐卤液的重要香气组成成分。
然而，现有技术中，传统的工业生产臭豆腐卤液的方法往往是在敞口的缸或水泥池中自然发酵而成。其作为发酵剂的微生物来源于空气等自然环境中，微生物的种类难以确定，且存在有害微生物进入其中带来食品安全隐患的问题。传统的工业生产臭豆腐卤液的时间为半年到1年，之后反复浸泡臭豆腐，浸泡时间可长达2年甚至更长，在这个工程中会增加多种微生物，杂菌，导致产品质量不稳定。由于发酵过程简单粗放，机械化程度低，生产周期长，时间、温度、原料配比等缺乏明确的生产标准，无法形成微生物种类明确，风味稳定的臭豆腐卤液，臭豆腐产品质量难以把控，严重阻碍了相关产业的发展。
因此，研发具有固定配方的臭豆腐卤液的直投式发酵方法，对于生产质量、安全性、风味稳定的臭豆腐卤液和臭豆腐产品，对于产业生产水平的提升具有十分重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种臭豆腐卤液的直投式乳酸菌发酵剂，以及臭豆腐卤液的直投式发酵方法，通过特定的4种乳酸菌菌种对卤液原液进行混合发酵，可得到质量、安全性和风味稳定的臭豆腐卤液，且臭豆腐卤液的发酵时间短，臭豆腐的生产时间短，从而可实现臭豆腐的工业化生产。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种发酵剂，所述发酵剂为4株乳酸菌复配；其中：
4株所述乳酸菌分别为植物乳杆菌KS1-1，植物乳杆菌KS1-2、戊糖片球菌ZJL2-2、乳酸乳球菌ZJL1-3；所述植物乳杆菌KS1-1的保藏编号为：CCTCC NO:M 2020131；所述植物乳杆菌KS1-2的保藏编号为：CCTCC NO:M 2020132；所述戊糖片球菌ZJL2-2的保藏编号为：CCTCC NO:M 2020133；所述乳酸乳球菌ZJL1-3的保藏编号为：CCTCC NO:M 2020134。
本领域技术人员很容易理解，上述4株乳酸菌可以通过一定的配比进行复配。
优选地，所述发酵剂为4株乳酸菌等量复配。
本领域技术人员很容易理解，上述4株乳酸菌可以采用一定的方式进行保存。
优选地，所述乳酸菌采用乳酸菌冻干菌粉。
本发明中，所述发酵剂可以用于发酵现有技术种制备臭豆腐卤液的常规卤液原液。
优选地，所述卤液原液的组分包括苋菜梗、生姜、花椒和无菌盐水；所述卤液原液中，所述苋菜梗的浓度为10～50g/100mL，所述生姜的浓度为1～10g/100mL，所述花椒的浓度为0.5～5g/100mL，所述无菌盐水的浓度为1～5g/100mL。
优选地，所述植物乳杆菌KS1-1、植物乳杆菌KS1-2、戊糖片球菌ZJL2-2、乳酸乳球菌ZJL1-3的复配比范围为：1:(0.1～3):(0.5～5):(0.1～5)。
更优选地，所述植物乳杆菌KS1-1、植物乳杆菌KS1-2、戊糖片球菌ZJL2-2、乳酸乳球菌ZJL1-3的复配比范围为：1:(0.5～2):(1～3):(0.5～4)。
本发明的第二个目的是提供一种臭豆腐卤液的直投式发酵方法，包括如下步骤：
将上述发酵剂接种于卤液原液中，所述发酵剂在所述卤液原液中的初始总浓度为103-6CFU/mL，并于30～45℃培养10～15h，然后以1～5％的体积比投入发酵氮源，继续发酵10～15h，获得臭豆腐卤液。
根据本发明的一个优选技术方案，所述的4株乳酸菌以冻干菌粉的形式等量复配，作为所述发酵剂。
优选地，所述卤液原液的组分包括苋菜梗、生姜、花椒和无菌盐水；所述卤液原液中，所述苋菜梗的浓度为10～50g/100mL，所述生姜的浓度为1～10g/100mL，所述花椒的浓度为0.5～5g/100mL，所述无菌盐水的浓度为1～5g/100mL。
进一步优选地，所述卤液原液中，所述苋菜梗的浓度为12.25g/100mL、生姜的浓度为1.25g/100mL、花椒的浓度为0.63g/100mL；所述无菌盐水的浓度为2g/100mL；所述发酵剂在所述卤液原液中的初始总浓度为104CFU/mL。
在上述配方条件下，能够有效抑制杂菌，且乳酸菌的发酵效果最好，发酵终点时的菌浓最高。
优选地，所述卤液原液于37℃培养12h，然后以2％体积比投入发酵氮源，继续发酵12h，获得臭豆腐卤液。
在上述发酵条件下，可在较短的时间内得到发酵效果好的臭豆腐卤液。
进一步优选地，所述发酵氮源为碾碎的豆腐坯。当然，所述发酵氮源还可以为现有技术中常规的用于臭豆腐卤液发酵所用的氮源，例如豆乳。
本发明的第三个目的是提供一种臭豆腐卤液，采用上述臭豆腐卤液的直投式发酵的方法得到。
与现有技术相比，本发明具有如下有益技术效果：
(1)、本发明的发酵剂，通过特定的4种乳酸菌复配，可作为发酵剂直接投放到卤液原料中，4株乳酸菌复合后的发酵剂的发酵能力相比乳酸菌单独作为发酵剂得到明显提升，且发酵终点时的菌浓明显高于单株乳酸菌的菌浓。因而，在工业化生产条件下发酵卤液原料得到发酵效果良好的臭豆腐卤液，且发酵时间可缩短至1天，与现有技术相比，显著缩短了发酵时间。因而适用于工业化大规模生产。
(2)、本发明的臭豆腐卤液直投式发酵方法，通过特定的4种乳酸菌菌种复配作为发酵剂对卤液原液进行发酵，发酵菌种明确，时间、温度、原料配比等发酵条件明确；各原料和乳酸菌按照配比直接投放，并在特定的发酵条件下发酵，可得到质量、安全性、风味稳定的臭豆腐卤液，因此发酵效果好；且臭豆腐卤液的发酵时间及臭豆腐的浸泡生产周期均明显缩短，从而可实现臭豆腐的工业化生产。
(3)、本发明的乳酸菌发酵菌种中的植物乳杆菌KS1-1和乳酸乳球菌ZJL1-3对常见致病菌具有显著的抑菌作用，可以大大降低臭豆腐生产过程中的食品安全风险。
附图说明
图1为植物乳杆菌、乳酸乳球菌及戊糖片球菌单菌株发酵期间臭豆腐卤液的菌浓变化图。
图2为4种菌株复合发酵期间臭豆腐卤液的菌浓-时间变化图。
图3为4种菌株复合发酵期间臭豆腐卤液的pH/酸度-时间变化图。
图4为4种菌株复合发酵期间臭豆腐卤液的颜色-时间变化图。
图5为未发酵卤液挥发性香气成分的GC-MS图谱。
图6为发酵后臭豆腐卤液中挥发性香气成分的GC-MS图谱。
保藏说明
本发明的植物乳杆菌KS1-1(Lactobacillus plantarum KS1-1)菌株，已于2020年5月19日保存在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020131。
本发明的植物乳杆菌KS1-2(Lactobacillus plantarum KS1-2)菌株，已于2020年5月19日保存在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020132。
本发明的戊糖片球菌ZJL2-2(Pediococcus pentosaceus ZJL2-2)菌株，已于2020年5月19日保存在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2020133。
本发明的乳酸乳球菌ZJL1-3(Lactococcus lactis ZJL1-3)菌株，已于2020年5月19日保存在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020134。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明中发酵所用4株乳酸菌均分离自泡菜及酸面团中，分别为植物乳杆菌KS1-1、植物乳杆菌KS1-2、戊糖片球菌ZJL2-2和乳酸乳球菌ZJL1-3。
MRS液体培养基：10.0g蛋白胨、5.0g牛肉粉、4.0g酵母粉、20.0g葡糖糖、1.0mL吐温-80、2.0g磷酸氢二钾、5.0g乙酸钠、2.0g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰和1000mL蒸馏水。
MRS固体培养基：10.0g蛋白胨、5.0g牛肉粉、4.0g酵母粉、20.0g葡糖糖、1.0mL吐温-80、2.0g磷酸氢二钾、5.0g乙酸钠、2.0g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、16.0g琼脂粉和1000mL蒸馏水。
LB液体培养基：NaCl 10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和1000mL蒸馏水。
LB固体培养基：NaCl 10g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、16.0g琼脂粉和1000mL蒸馏水。
本发明所用原料及设备均为市售。
实施例1、乳酸菌的分离与鉴定
从自然发酵的泡菜及酸面团中分离、鉴定乳酸菌菌株，具体步骤如下：
(1)将采集到的泡菜及酸面团以无菌生理盐水以10倍进行梯度稀释，分别稀释为10-3和10-5倍，取200μL稀释液均匀涂布在MRS固体培养基(MRS培养基混合物48.3g/L，含2％琼脂，115℃灭菌)上，37℃恒温培养箱中倒置培养48h，取出后挑取单菌落于10mL的MRS液体培养基(含2％琼脂)中37℃恒温摇床培养18h，转速为200rpm。
(2)获得菌液用DNA提取试剂盒提取DNA后对其16S rRNA片段进行聚合酶链式反应，引物如表1所示，反应体系如表2所示、反应条件如表3所示。
(3)扩增产物送派森诺生物技术有限责任公司进行测序，测序结果在Genebank上与标准菌株进行序列比对。
表1、16S rRNA引物序列
表2、扩增反应体系
表3、扩增反应条件
对菌株16S rRNA扩增产物序列进行测序鉴定，与GenBank上标准菌株序列进行比对同源性最高(>99％)的4株菌株，并确定分离所得菌株分别为植物乳杆菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌。根据鉴定结果将此4株菌分别命名为：植物乳杆菌KS1-1，植物乳杆菌KS1-2、乳酸乳球菌ZJL1-3和戊糖片球菌ZJL2-2，如表4所示。
表4 16S rDNA测序结果比对表
其中，KS1-1、KS1-2从泡菜中分离得到，ZJL2-2、ZJL1-3从酸面团中分离得到。
实施例2、乳酸菌冻干菌粉的制备
在无菌操作台中，从保藏植物乳杆菌KS1-1，植物乳杆菌KS1-2、乳酸乳球菌ZJL1-3和戊糖片球菌ZJL2-2的甘油管中挑取出少量菌液，在MRS固体平板上划线，37℃培养36～48h，挑平板上的单菌落接种于10mL液体MRS培养基中，37℃厌氧培养18h后接种于10L的含MRS培养基的发酵罐中，厌氧发酵24h，然后6000rmp离心10min收集菌体，用无菌磷酸缓冲液(pH＝6.4)洗涤2次。离心并将得到的菌泥与含18％～22％的脱脂乳粉，4～9％海藻糖，2～4％甘氨酸钠，1～5％甘油和0.1～1％(w/w)半管氨酸盐酸盐的经灭菌的冻干保护剂以重量比1:2的比例充分混合乳化。菌泥和保护剂充分悬浮均匀后，乳化混合液在-45℃以下预冻4～10h，再放入冻干机冻干20～26h，即可得到冻干菌粉。菌粉中植物乳杆菌KS1-1，植物乳杆菌KS1-2、乳酸乳球菌ZJL1-3和戊糖片球菌ZJL2-2的活菌数经测定为1010～12CFU/g。
实施例3-6、4株乳酸菌单独进行臭豆腐卤液的发酵
4株乳酸菌单独作为发酵剂用于发酵卤液原液，具体步骤如下：
(1)、配制卤液原液，所述卤液原液的组分包括苋菜梗、生姜、花椒和无菌盐水，其中，所述苋菜梗的浓度为12.25g/100mL，所述生姜的浓度为1.25g/100mL，所述花椒的浓度为0.63g/100mL，所述无菌盐水的浓度为2g/100mL。
(2)、将发酵剂接种于步骤(1)的卤液原液中，所述发酵剂在所述卤液原液中的初始总浓度约为104CFU/mL，并于37℃培养12h，然后以2％的体积比投入碾碎的豆腐坯作为发酵氮源，继续37℃发酵12h，获得臭豆腐卤液。
检测步骤(2)的发酵过程中菌浓的变化，结果如图1所示。
由图1可知，植物乳杆菌KS1-1、KS1-2具有较好的发酵能力，在发酵前期(0～12h)呈指数增长并在12～18h左右生长放缓进入稳定期，发酵达到18h时的菌浓为1012～1013CFU/mL，此后菌浓不再变化，主要为风味产生阶段。
戊糖片球菌ZJL2-2及乳酸乳球菌ZJL1-3同样具有较好的发酵能力，在发酵前期(0～18h)呈指数增长，并在18h左右生长放缓进入稳定期，发酵达到18h时的菌浓为108～1010CFU/mL，此后菌浓不再变化，主要为风味产生阶段。
实施例7、单一菌株发酵液抑菌能力的测定
实施例3-6中的单菌株发酵得到的臭豆腐卤液用于抑菌实验，具体步骤如下：
分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌于LB液体培养基中37℃恒温摇床中过夜活化。然后以倾注法将上述含有活化的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的LB液体培养基按照1μL/mL的比例均匀加入融化的LB固体培养基中，待固体培养基呈半凝固状态后，分别在LB固体培养基的表面放置5个牛津杯，然后在牛津杯中分别注入100μL实施例3-6制备的臭豆腐卤液，以未注入臭豆腐卤液的卤液原液作为对照，37℃恒温过夜培养，记录抑菌圈直径。结果如表5所示。
由表5可知，2株乳酸菌发酵液在平板上有抑菌圈。植物乳杆菌KS1-1可同时抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，乳酸乳球菌ZJL1-3可抑制大肠杆菌生长，说明将此两株乳酸菌菌株运用于臭豆腐卤液发酵可有效改善发酵过程中致病菌的污染。
表5 菌株抑菌圈的测定
实施例8、4株乳酸菌复合进行臭豆腐卤液的直投式发酵
4株乳酸菌复合用于发酵卤液原液，具体步骤如下：
(1)取4株乳酸菌的冻干菌粉等量复配，作为发酵剂。
(2)配制卤液原液，所述卤液原液的组分包括苋菜梗、生姜、花椒和无菌盐水，其中，所述苋菜梗的浓度为12,25g/100mL，所述生姜的浓度为1.25g/100mL，所述花椒的浓度为0.63g/100mL，所述无菌盐水的浓度为2g/100mL；
(3)取适量步骤(1)的所述发酵剂接种于步骤(2)的卤液原液中；所述卤液原液于37℃培养12h，然后以2％的体积比投入碾碎的豆腐坯作为发酵氮源，继续于37℃发酵12小时，获得臭豆腐卤液；所述发酵剂在卤液原液中的初始复合菌株总菌浓约为104CFU/mL。
本实施例中，将植物乳杆菌KS1-1、植物乳杆菌KS1-2、戊糖片球菌ZJL2-2、乳酸乳球菌ZJL1-3进行等量混合发酵，分别在0h、6h、12h、18h、24h取臭豆腐卤液样品涂平板进行菌落计数，测定其生长曲线，同时测定发酵液酸度、pH值及颜色变化。结果如图2至图4所示。
由图2可知，上述4株乳酸菌经复合发酵后，发酵约12～18h后进入稳定期，在发酵18h时的菌浓达到1014CFU/mL。发酵24h时的菌浓达到1014.5CFU/mL。由图2与图1对比可知，4株乳酸菌复合后的发酵剂的发酵能力相比乳酸菌单独作为发酵剂得到明显提升，且发酵终点时的菌浓明显高于单株乳酸菌的菌浓。
分析臭豆腐卤液在发酵过程中的酸度变化，如图3所示。4株乳酸菌在发酵前期的产酸能力较强，发酵液的pH逐渐下降，且在12h时酸度达到最高，此时发酵液的pH下降至3.17，滴定酸度达到13.1°T/10mL。发酵中后期pH逐渐上升，在24h时发酵液的pH达到5.32，臭豆腐卤液的滴定酸度恢复至9.3°T。
由于酸度过高往往会促进豆制品变质，并带来刺激、强烈、令人不愉快的酸涩感，因此，向本发明的终产品臭豆腐卤液中投放豆腐坯以发酵生产臭豆腐产品的工序中，豆腐坯的投放和浸泡应避开酸度较高的6～12h，可选择在18～24h时投放，以减少给臭豆腐产品带来不愉悦的感官影响。
与此同时，观察发酵过程中发酵液的颜色变化，并记录如图4所示。由图4可知，初始的卤液原液呈青绿色，透明度较高。发酵过程中逐渐演变为黄色、棕色。加入碾碎的豆腐坯后，透明度逐渐降低，在发酵至18～20h时发酵液成深棕色，透明度较低，此时臭豆腐发酵卤液的色泽、外观非常接近自然发酵的市售臭豆腐卤液。综上所述，选择37℃发酵18～20h为较优的卤液发酵周期。
实施例9-14、4株乳酸菌复合进行臭豆腐卤液的直投式发酵
实施例9-14的发酵工艺与实施例8基本相同，改变的发酵条件如表6所示，结果如表7所示。
表6 实施例9-14的发酵工艺参数
表7 实施例9-14的发酵产品性质
观察实施例9-14发酵过程中发酵液的颜色变化与实施例8基本相同，在发酵20h时发酵液成深棕色，透明度较低，此时臭豆腐发酵卤液的色泽、外观非常接近自然发酵的市售臭豆腐卤液。
综上所述，实施例9-14的发酵工艺条件下得到的臭豆腐卤液的性质均接近自然发酵的臭豆腐卤液。且4株特定的乳酸菌等量复合作为发酵剂发酵，能够有效促进臭豆腐卤液的发酵，缩短发酵时间。
本实施例中，植物乳杆菌KS1-1、植物乳杆菌KS1-2、戊糖片球菌ZJL2-2、乳酸乳球菌ZJL1-3的复配比范围为：1:(0.5～2):(1～3):(0.5～4)。
实施例15：4个单菌株发酵及4个乳酸菌菌种复合发酵得到的臭豆腐卤液中挥发性香气成分的分析
借助固相微萃取(SPME)方法对实施例3-6及实施例8的臭豆腐卤液产品的挥发性香气成分进行萃取，并以GC-MS进行分析鉴定。
85μm的PDMS萃取头首次使用前于GC-MS进样口以250℃老化12h，之后每次使用时提前在进样口250℃老化30min后使用。
气相色谱检测条件：采用DB-WAX色谱柱进行气相色谱分析，进样模式为不分流，载气(He)流量1.0mL/min，升温程序：初始温度40℃，保持4min；以5℃/min升至100℃，再以10℃/min升至220℃，在220℃保持8min。
质谱检测条件：离子源温度为200℃；EI电离源；电子能量为70eV；检测器为350V；扫描范围M/Z为33～450amu。
具体的检测步骤如下：取30mL单菌株或混合菌株发酵臭豆腐发酵卤液产品，5g氯化钠，和5μL浓度为20μg/mL的乙酸苯乙酯于顶空萃取瓶中，调整PDMS萃取头的高度在液体平面上方0.5cm，置于磁力搅拌器上50℃加热条件下，设置搅拌速度为80r/min，萃取90min。萃取完成后快速去除萃取头与GC-MS进样口相连接，萃取头在进样口以250℃解吸5min，用于后续分析，每个样品检测三个平行数据。
GC-MS分析鉴定出实施例3-6单菌株发酵臭豆腐卤液中主要的挥发性香气成分16种，如表8所示。
表8 单菌株发酵臭豆腐卤液中主要特征香气成分及其相对含量
由表8的实验结果可知，经植物乳杆菌KS1-1、植物乳杆菌KS1-2、戊糖片球菌ZJL2-2、乳酸乳球菌ZJL1-3单菌株发酵后臭豆腐卤液中可检测到香气成分，其中含量较高的有醇类4种、酯类4种、醛类2种、酮类1种、其他4种。其中植物乳杆菌KS1-1、植物乳杆菌KS1-2及乳酸乳球菌ZJL1-3发酵产品中醇、酯类挥发性物质丰度较高，而戊糖片球菌ZJL2-2发酵产品中吲哚及硫醚类物质丰度较高，上述物质对香气特征形成产生突出贡献。
GC-MS分析实施例8的混合菌株发酵臭豆腐卤液中总离子流图如图5和图6所示，共鉴定出挥发性香气成分51种，如表9所示。
表9 臭豆腐发酵卤液挥发性香气成分及其相对含量
由表9的结果可知，经乳酸菌发酵后获得的臭豆腐卤液中共鉴定出61种挥发性香气成分。其中烯烃类19种、醇类10种、酯类5种、酸类4种、醛类3种、酮类3种、其它(包括胺类、硫醚类、吲哚、酚类等)7种。本实验与现有技术中的臭豆腐卤液的香气成分分析基本一致。下面对香气成分组分进行归类分析。
(1)烷烃类
实验鉴定得到的烷烃类物质共为19种，其中烯类13种、烃类1种、烷类5种。其中大部分烯类物质为以果木、松香、柑橘香气为特征的香气成分，这可能来自于新鲜的苋菜梗及生姜、花椒等香辛料，且在发酵前原料液中的丰度较高，而在发酵后的臭豆腐卤液中的丰度显著下降。较为明显的有顺-α-佛手柑油烯由发酵前的22.5％降至2.41％，β-红没药烯由7.32％降至1.68％。由于烷烃类化合物芳香阈值较高，且不具有风味活性，且发酵后的丰度普遍降低，对臭豆腐发酵卤液香气特征贡献较小。
(2)醇类
发酵过程中碳水化合物经乳酸菌转化为醇类物质。值得注意的是，大部分醇类物质在发酵前的丰度较低，经发酵后有所上升。变化较为显著的有正丁醇由0％变为38.3％，桉树醇由2.39％变为5.42％，芳樟醇由4.08％变为8.76％，和4-萜烯醇由6.51％变为7.98％。正丁醇带有醇香香气，桉树醇香气特征为樟脑气味，芳樟醇为铃兰香气，4-萜烯醇香气特征为木材、泥土香气，这些香气可以赋予臭豆腐发酵卤液醇厚香气，构成臭豆腐卤液重要的香气特征。4种特定的乳酸菌复合发酵，可提高大部分醇类物质的丰度，特别是较大幅度地提高正丁醇的丰度，从而提高臭豆腐卤液的香气。
(3)酯类
实验鉴定得到的酯类物质共为5种，发酵前的臭豆腐卤液原料中几乎未检测到脂类物质，除乙酸丁酯外，其他的酯类物质均为发酵过程中产生。其中对香气生成具有贡献的酯类有乙酸丁酯(丰度1.78％)、乙酸己酯(丰度0.74％)、戊酸乙酯(丰度1.12％)和3-辛烯酯(丰度1.35％)。酯类物质多为果木香和甜香香气。虽然酯类化合物的丰度较低，但酯类化合物芳香阈值非常低，依然可以认为其对卤液特征香气的重要组成。
(4)酸类
酸类物质主要由大豆脂质水解产生，呈现酸味和油脂气息。实验鉴定得到的酸类物质共为4种，总丰度较低，其中大部分酸类化合物在发酵过程中丰度降低甚至消失，仅丁酸的丰度有所上升，丁酸是乳酸菌产生的对健康有益的一类短链脂肪酸。其中2-甲基戊酸和异戊酸由乳酸菌降解氨基酸产生，2-甲基戊酸具有干酪气味，异戊酸具有令人不愉快的酸败气味，但以上两种酸类化合物丰度极低。酸类化合物对于卤液香气特征影响并不大，主要作为背景气味存在。
(5)醛、酮类
本实验鉴定得到的醛类物质共为3种，发酵前原料液中未检测到，均为发酵过程中产生。其中柠檬醛(0.42％)和橙花醛(0.21％)特征香气均为柠檬的果香香气，可由醇类或酚类物质氧化生成。鉴定得到的酮类物质共为3种，3-辛酮(1.78％)具有果实香气，顺-二氢黄蒿萜酮(0.31％)常在蓝莓果实中检出，2-十三烷酮具有乳品和椰子香气(0.27％)，酮类化合物对卤液香气特征有重要影响。
(6)其他
实验鉴定得到的其他类别的物质共为7种，在发酵后的卤液中所占丰度较高，也是卤液特征香气重要的组成部分，绝大部分为发酵过程中产生。其中包括胺类物质2种，硫醚类物质3种，酚类物质1种，以及吲哚。胺类物质具有氨气味，硫醚类物质为乳酸菌降解含硫氨基酸所得。本实施例中鉴定得到的二甲基二流醚(6.32％)、二甲基三硫醚(1.40％)和二甲基四硫醚(1.11％)香气阈值较低，具有洋葱、萝卜的气味，在葱属植物、豆豉、芥末中可检测到，含硫化合物对于食物香气特征有着本质上的贡献。吲哚(27.9％)经微生物降解氨基酸产生，在卤液中丰度很高，具有强烈的粪臭味气息，作为杂环类物质芳香阈值很低，只在经稀释的低浓度下呈现茉莉花香(Ames JM.EUCOST action 919melanoidins in food andhealth.Interrnational Congress Series 2002,1245:389-390)，与本实验结果一致；贺静等人报道卤液发酵原料中未检测到吲哚，而发酵过程中吲哚始终存在，为发酵液特有成分；刘玉平等人(刘玉平，陈海涛，孙宝国，等.固相微萃取与GC-MS法分析发酵型臭豆腐中挥发性成分[J].食品工业科技，2009，30(12)：403-405.)、孙洁雯等人(孙洁雯,杨克玉,李燕敏.SDE结合GC-MS***致和臭豆腐中的特征香气成分[J].食品科学.2015,36(16):127-131.)及郑小芬等人(SHIOU H C,YASUAKI T,KOICHI W,et al.Diversity of lactic acidbacteria in fermented brines used to make stinky tofu[J].Internationaljournal of Food Microbiology.2008,123:134-141.)在分析臭豆腐挥发性香气成分时均检测到吲哚较高丰度的存在，吲哚为卤液重要的特征香气成分。
分析结果表明，本发明中臭豆腐卤液的主体香气成分为2-蒈烯、γ-松油烯、顺-α-佛手柑油烯、正丁醇、桉树醇、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸丁酯、乙酸己酯、戊酸乙酯、3-辛烯酯、2-甲基戊酸、柠檬醛、橙花醛、3-辛酮、顺-二氢黄蒿萜酮、2-十三烷酮。臭豆腐卤液的典型香气成分为二甲基二流醚、二甲基三硫醚、二甲基四硫醚和吲哚。本发明的臭豆腐卤液挥发性香气成分主要构成与以往报道的典型的市售自然发酵的臭豆腐卤液非常相似，说明本发明的臭豆腐卤液产品的香气特征与传统产品较为接近，可以较好地满足广大消费者关于香气特征的基本需求。
采用同样的方法对实施例9-14的臭豆腐卤液产品的挥发性香气成分进行萃取，并以GC-MS进行分析鉴定，结果与实施例8的挥发性香气成分分析结果类似。
综上可知，4种乳酸菌等量复合作为发酵剂发酵得到的臭豆腐卤液产品的香气成分明显多于单菌株发酵产品所具有的香气成分，且特征香气成分的丰度更高。发酵原料在复合乳酸菌的代谢过程中生成香气成分或将其转化，臭豆腐卤液香气特征的形成与乳酸菌的复配密切相关。
实施例16、臭豆腐浸泡
采用实施例8的臭豆腐卤液浸泡豆腐，浸泡时间12小时，得到臭豆腐A。同时以等体积的市售自然发酵型臭豆腐卤液浸泡等量豆腐，浸泡24h，得到的臭豆腐B。臭豆腐A和臭豆腐B分别经过50名志愿者评价，结果如表10所示。
表10 感官实验评价结果
表10的结果表明，本发明的臭豆腐的香气和质量均与市售自然发酵型臭豆腐卤液浸泡得到的臭豆腐相似甚至更好。
综上所述，本发明运用特定的4株乳酸菌进行等量复合作为发酵剂发酵制备所得的臭豆腐卤液具有发酵周期短、配方固定、发酵菌种明确、香气品质稳定等优势，适合推广于工业化生产。其香气与市售的臭豆腐卤液相似，可以满足市场对风味的传统需求，具有广阔的市场应用价值。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (9)
1.一种发酵剂，其特征在于，所述发酵剂为4株乳酸菌复配；其中：
4株所述乳酸菌分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）KS1-1，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）KS1-2、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）ZJL2-2、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）ZJL1-3；所述植物乳杆菌KS1-1的保藏编号为：CCTCC NO: M2020131；所述植物乳杆菌KS1-2的保藏编号为：CCTCC NO: M 2020132；所述戊糖片球菌ZJL2-2的保藏编号为：CCTCC NO: M 2020133；所述乳酸乳球菌ZJL1-3的保藏编号为：CCTCCNO: M 2020134。
2.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂为4株乳酸菌等量复配。
3.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述乳酸菌采用乳酸菌冻干菌粉。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂用于制备臭豆腐卤液。
5.臭豆腐卤液的直投式发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1-4中任一项所述的发酵剂接种于卤液原液中，所述发酵剂在所述卤液原液中的初始总浓度为103-6 CFU/mL，并于30～45℃培养10～15 h，然后以1～5 %的体积比投入发酵氮源，继续发酵10～15 h，获得臭豆腐卤液；
其中：所述卤液原液的组分包括苋菜梗、生姜、花椒和无菌盐水；所述卤液原液中，所述苋菜梗的浓度为10~50 g/100 mL，所述生姜的浓度为1~10 g/100 mL，所述花椒的浓度为0.5~5 g/100 mL，所述无菌盐水的浓度为1~5 g/100 mL。
6.根据权利要求5所述的臭豆腐卤液的直投式发酵方法，其特征在于，所述的4株乳酸菌以冻干菌粉的形式等量复配，作为所述发酵剂。
7.根据权利要求5所述的臭豆腐卤液的直投式发酵方法，其特征在于，所述卤液原液中，所述苋菜梗的浓度为12.25 g/100 mL、生姜的浓度为1.25 g/100 mL、花椒的浓度为0.63 g/100 mL；所述无菌盐水的浓度为2 g/100 mL；所述发酵剂在所述卤液原液中的初始总浓度为104 CFU/mL。
8.根据权利要求5所述的臭豆腐卤液的直投式发酵方法，其特征在于，所述卤液原液于37℃培养12 h，然后以2%体积比投入发酵氮源，继续发酵12 h，获得臭豆腐卤液。
9.臭豆腐卤液，其特征在于，采用权利要求5-8中任一项所述的臭豆腐卤液的直投式发酵方法得到。
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