CN111624078A - 点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用及染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感与成像技术领域，尤其是涉及一种点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用及染色方法。点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
其中R1和R2各自独立的选自烷基。本发明采用点亮型荧光化合物能够在无外在靶向基团修饰的前提下，可实现快速精准的甄别与定位癌细胞与正常细胞，且毒副作用下、耗时短、成本低。为肝肿瘤切除的术中病灶性质快速诊断、肝癌切除手术切缘鉴定和荧光手术导航提供新的临床策略。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感与成像技术领域，尤其是涉及一种点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用及染色方法。
背景技术
肝细胞癌(以下简称肝癌)是最常见的肝脏恶性肿瘤，其来源于肝脏上皮细胞，近年来其发病率增高且死亡率居高不下。手术切除是目前肝癌最有效的治疗手段，术前常借助于影像学检查，譬如增强CT、增强MRI或超声造影结合肿瘤标志物做出临床诊断，但是有些患者并不具有典型的影像学特征，以及20～30％患者肿瘤标志物并不升高。而病灶的良恶性性质决定了手术方式和肝脏切除范围，常规病理学检查需要等待数个工作日，进行复杂的组织固定、制片和染色等步骤才能获得最终结果，对手术中的指导价值有限。术中快速冰冻切片是目前临床常用的手术中判别病灶良恶性的技术手段，经过组织获取、制片、固定、染色和诊断后，一般在30分钟内临床医生可获得初步病理学诊断结果，但是一旦出现组织质量差、制片不合格、病理科医生经验不足时则可能无法获得准确的结论，甚至造成误诊，最终选择了不合理的手术方案。
肝癌的手术切除能否达到根治与切除范围密切相关，传统手术仅能靠外科医生的临床经验预判切除范围，目前临床多借助于术中超声引导。术中超声虽可准确反应肿瘤和肝实质的关系，但需反复多次的调整和超声科医生的指导配合，不具备简单、快捷的特点。近年来，术中荧光成像技术逐步推广应用于肝胆外科手术，即采用吲哚菁绿分子经静脉注射后摄入肝细胞和肝癌细胞中，利用肝细胞和肝癌细胞的分泌功能的差异特点(肝癌组织不易分泌***，大量吲哚菁绿分子滞留而荧光成像)，但是在实际临床应用中发现，当患者伴有肝硬化时，肝组织***也受阻而出现肝癌病灶显示不清、假阳性等异常情况。
若能得到仅对肝癌组织响应，而正常肝组织、非典型增生结节、肝腺瘤、脂肪肝组织不响应的荧光分子，势必可弥补上述不足。(Z.Kaufman,S.Lew,B.Griffel,A.Dinbar.Frozen-section diagnosis in surgical pathology:a prospectiveanalysis of 526frozen sections.Cancer,1986,57,377-379；R.L.Dietz,D.J.Hartman,L.Zheng.Review of the use of telepathology for intraoperativeconsultation.Expert Rev Med Devic,2018,15,DOI:10.1080/17434440.2018.1549987；张绍祥，姜洪池，梁力建，方驰华，莫志康，陆绮萍。计算机辅助联合吲哚菁绿分子荧光影响技术在肝脏肿瘤诊断和手术导航中的应用专家共识.中国实用外科杂志,2017,37,531-538；Y.Liu,Y.M.Zhao,W.Akers.First in-human intraoperative imaging of HCC usingthe fluorescence goggle system and transarterial delivery of near-infraredfluorescent imaging agent:a pilot study.Transl Res,2013,162,324-331；Y.Morita,T.Sakaguchi,N.Unno,Y.Shibasaki,A.Suzuki,K.Fukumoto,K.Inaba,S.Baba,Y.Takehara,S.Suzuki,H.Konno.Detection of hepatocellular carcinomas with near-infraredfluorescence imaging using indocyanine green:its usefulness andlimitation.Int J Clin Oncol,2013,8,232-241.)
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，以解决现有技术中存在的诊断效率低的技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种点亮型荧光化合物在标记肝癌细胞方面的非诊断和治疗目的的应用。
本发明的又一目的在于提供一种点亮型荧光化合物对肝癌细胞的非诊断目的的染色方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
本发明采用点亮型荧光化合物能够在无外在靶向基团修饰的前提下，可实现快速精准的甄别与定位癌细胞与正常细胞，且毒副作用下、耗时短、成本低。
在本发明一优选实施方式中，所述R1和R2独立的选自碳数为1-6的烷基，更优选的R1和R2独立的选自碳数为1-3的烷基。
如在不同实施方式中，所述R1和R2可以各自独立的为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基及其同分异构体等。
在本发明一优选实施方式中，所述R1和R2为相同的基团。
在本发明一优选实施方式中，所述R1和R2为甲基。
可选的，所述试剂盒的检测对象包括肝癌组织、肝硬化结节、非典型增生结节、肝腺瘤、正常肝组织、脂肪肝组织中的任一种。
可选的，所述试剂盒中还包括无毒的有机溶剂，如二甲基亚砜。
可选的，所述试剂盒中还包括稀释液。可选的，所述稀释液选自高糖DMEM培养基、1640培养基、生理盐水、磷酸盐缓冲液和灭菌水。
可选的，所述试剂盒中，点亮型荧光化合物的浓度为1×10-8mol/L～1×10-4mol/L。
在本发明一优选实施方式中，将所述点亮型荧光化合物溶解于二甲基亚砜中，再加入所述稀释液。其中，将所述点亮型荧光化合物溶解于二甲基亚砜中，使所述点亮型荧光化合物的浓度为1×10-4mol/L～1×10-2mol/L。
本发明还提供了一种点亮型荧光化合物对肝癌细胞的非诊断目的的染色方法，包括如下步骤：
固定处理的含肝癌细胞的体系与染色溶液混合进行染色处理；
其中，所述染色溶液中包括点亮型荧光化合物，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
在本发明一优选实施方式中，所述R1和R2独立的选自碳数为1-6的烷基，更优选的R1和R2独立的选自碳数为1-3的烷基。
如在不同实施方式中，所述R1和R2可以各自独立的为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基及其同分异构体等。
在本发明一优选实施方式中，所述R1和R2为相同的基团。
在本发明一优选实施方式中，所述R1和R2为甲基。
在本发明一优选实施方式中，所述染色处理包括：染色5～10min后除去染色溶液，洗涤。可选的，所述洗涤采用的洗涤液选自生理盐水、磷酸盐缓冲液和灭菌水。洗涤的次数为2～3次。
可选的，采用固定剂对所述含肝癌细胞的体系进行固定处理。可选的，所述固定剂为4％多聚甲醛溶液。加入固定剂后，静置10±5min，洗涤，完成固定处理。
优选的，所述染色溶液浸没固定处理的含肝癌细胞的体系。
染色处理后，通过荧光光源照射可以显示肝癌细胞，区分肝癌细胞和肝正常细胞。优选的，所述荧光光源的波长为365～488nm，如可以为365nm、400nm、488nm等等。
可选的，所述含肝癌细胞的体系包括肝癌组织、肝硬化结节、非典型增生结节、肝腺瘤、正常肝组织、脂肪肝组织中的任一种。可经过冰冻切片处理或新鲜组织切片。
本发明还提供了一种点亮型荧光化合物在标记肝癌细胞方面的非诊断和治疗目的的应用。如细胞成像等。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用点亮型荧光化合物能够在无外在靶向基团修饰的前提下，可实现快速精准的甄别与定位癌细胞与正常细胞，且毒副作用下、耗时短、成本低；
(2)本发明可以采用点亮型荧光化合物对肝癌细胞进行染色，具有特异性荧光标记作用，而对正常肝细胞无荧光标记作用；
(3)本发明可以采用点亮型荧光化合物用于标记肝癌细胞，用于细胞成像等，区别于其他正常细胞等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中点亮型荧光化合物在肝组织切片中荧光成像图；
图2为本发明中点亮型荧光化合物在肝组织切片中癌细胞内及正常细胞内的荧光强度图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明具体实施方式中采用的部分试剂和仪器信息可以如下：
高糖DMEM培养基，细胞培养级别，康宁(CORNING，美国)公司；
磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，细胞培养级别，康宁(CORNING，美国)公司；
多聚甲醛，分析纯，国药集团化学试剂公司；
二甲基亚砜，细胞培养级别，康宁(CORNING，美国)公司；
激光共聚焦显微镜，TCS SP5，德国徕卡仪器有限公司；
细胞培养皿的直径为10cm。
本发明具体实施方式中采用的点亮型荧光化合物以如下化合物为例进行说明：
ZZ-HPB-NC的制备方法可包括如下步骤：
(1)将1.00mmol 4-甲酰基苯硼酸、1.00mmol二苯乙炔、0.025mmol醋酸钯、1.00mmol碳酸银以及3mL正丙醇和水的混合溶剂加入到25mL的三口瓶中，通入氮气，在搅拌下，于120℃反应60min，抽滤并将滤液旋干，得到反应粗产物Ⅰ；将反应粗产物Ⅰ溶解于3mL二氯甲烷中，以石油醚和二氯甲烷为洗脱剂，用柱色谱分离提纯，得到淡黄色固体；
(2)将0.2mmol步骤(1)所得到的淡黄色固体和0.48mmol 2-氰基乙酸甲酯加入到100mL三口烧瓶中，再加入15mL甲醇和0.03mL哌啶，在搅拌下于60℃反应3h，反应结束析出固体，得到反应粗产物Ⅱ；将反应粗产物Ⅱ用不良溶剂正己烷进行冲洗，得到黄色固体，即为ZZ-HPB-NC。
实施例1
本实施例提供了一种点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
具体包括如下步骤：
(1)将ZZ-HPB-NC溶解于DMSO中配制成ZZ-HPB-NC的浓度为1×10-2mol/L的溶液a；
(2)用高糖DMEM培养基稀释步骤(1)得到的溶液a，配制成ZZ-HPB-NC的浓度为1×10-5mol/L的溶液b，得到荧光探针，可作为试剂盒。
实施例2
本实施例提供了一种点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
具体包括如下步骤：
(1)将ZZ-HPB-NC溶解于DMSO中配制成ZZ-HPB-NC的浓度为1×10-4mol/L的溶液a；
(2)用生理盐水稀释步骤(1)得到的溶液a，配制成ZZ-HPB-NC的浓度为1×10-8mol/L的溶液b，得到荧光探针，可作为试剂盒。
实施例3
本实施例提供了一种点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
具体包括如下步骤：
(1)将ZZ-HPB-NC溶解于DMSO中配制成ZZ-HPB-NC的浓度为1×10-3mol/L的溶液a；
(2)用灭菌水稀释步骤(1)得到的溶液a，配制成ZZ-HPB-NC的浓度为1×10-6mol/L的溶液b，得到荧光探针，可作为试剂盒。
实施例4
本实施例提供了一种点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
具体包括如下步骤：
(1)将ZZ-HPB-NC溶解于DMSO中配制成ZZ-HPB-NC的浓度为1×10-4mol/L的溶液a；
(2)用生理盐水稀释步骤(1)得到的溶液a，配制成ZZ-HPB-NC的浓度为1×10-5mol/L的溶液b，得到荧光探针，可作为试剂盒。
实施例5
采用实施例1制备得到的荧光探针的应用，具体方法如下：
取一肝组织冷冻切片，加入5mL 4％多聚甲醛溶液处理，静置10min，用PBS冲洗3次，加入5mL实施例1中得到的溶液b，染色5min移除溶液b，用PBS冲洗3次，激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)下可以观察到切片中癌细胞区域呈现出较强的绿色荧光，如图1所示；图2为图1中对应的癌细胞区域和正常细胞区域的荧光强度图(其中横坐标代表不同病例的肝组织切片编号)，说明了，本发明的荧光探针对正常肝细胞区域无明显荧光标记，且组织中血红细胞、血小板、白细胞、脂肪块等均对成像结果无明显干扰，为后续的新鲜肝组织切片成像提供了实验基础。
实施例6
采用实施例2制备得到的荧光探针的应用，具体方法如下：
取一新鲜肝组织切片，加入5mL 4％多聚甲醛溶液处理，静置10min，用PBS冲洗3次，加入8mL实施例2中制备得到的溶液b，染色10min移除溶液b，用生理盐水冲洗3次，激光共聚焦显微镜(激发波长为488nm)下可以观察到切片中癌细胞区域呈现出较强的绿色荧光，而对正常肝细胞区域无明显荧光标记，说明ZZ-HPB-NC可用于肝癌细胞的早期活检快速定位，并为后续的肝癌切除手术创面、肝癌病灶的实时动态荧光成像的应用提供了实验基础。
实施例7
采用实施例3制备得到的荧光探针的应用，具体方法如下：
当手术切除肝癌病灶后，将实施例3制备得到的溶液b喷洒于手术创面，待5min后，采用手持式光源或者手术用荧光显微镜照射手术创面区域，肉眼下观察荧光情况，或者于荧光采集装置下观察荧光信号。根据绿色荧光信号鉴别手术创面有无癌组织残留：有则提示肿瘤组织残留，无则提示根治性切除，可为肝癌切除手术提供术中即时鉴别是否根治切除癌灶的技术手段。
实施例8
采用实施例4制备得到的荧光探针的应用，具体方法如下：
在肝癌切除术前外周静脉注射实施例4制备得到的溶液b，抑或肝癌切除术术中经门静脉或者外周静脉注射溶液b，术中采用手持式光源或者腹腔镜下光源照射后，采用肉眼下或者荧光采集装置收集探针荧光信号，进行数据分析重建获得可视化图像。可以根据绿色荧光的位置明确癌灶范围、有无转移灶、有无周围血管脏器侵犯等，以评估肿瘤进展情况和更精准的肿瘤分期；术中实时监测肿瘤切除边缘而调整肝肿瘤切除断面，从而避免肿瘤残留。该方法可为肝癌切除手术提供直观、可视化、实时监测的技术手段。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.点亮型荧光化合物在制备肝癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述R1和R2独立的选自碳数为1-6的烷基。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述R1和R2为相同的基团。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的检测对象包括肝癌组织、肝硬化结节、非典型增生结节、肝腺瘤、正常肝组织、脂肪肝组织中的任一种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括无毒的有机溶剂。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括稀释液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中，点亮型荧光化合物的浓度为1×10-8mol/L～1×10-4mol/L。
8.点亮型荧光化合物对肝癌细胞的非诊断目的的染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
固定处理的含肝癌细胞的体系与染色溶液混合进行染色处理；
其中，所述染色溶液中包括点亮型荧光化合物，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
9.根据权利要求8所述的染色方法，其特征在于，所述染色处理包括：染色5～10min后除去染色溶液，洗涤。
10.点亮型荧光化合物在标记肝癌细胞方面的非诊断和治疗目的的应用，所述点亮型荧光化合物的结构式如下：
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