CN111595839A - 唾液葡萄糖检测试纸及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种唾液葡萄糖检测试纸，所述唾液葡萄糖检测试纸包括酶层和显色层，所述酶层包括葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和维生素C氧化酶。还提供了其制备方法和应用。本发明涉及一款用于快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸，用于体外检测，对于口腔疾病的早期预防、初步判断具有重要的意义，同时在糖尿病预防方面也具有一定的积极意义。

Description

唾液葡萄糖检测试纸及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种唾液葡萄糖检测试纸及其制备和应用方法。

背景技术

目前已有大量研究表明唾液葡萄糖(简称唾糖)含量的升高对人体健康有显著的负面作用。一方面，唾糖含量升高会破坏口腔环境，例如使口腔渗透压升高，pH降低，唾液流速减慢从而削弱其自洁作用等；另一方面，唾糖含量升高为变形链球菌、念珠菌、乳杆菌等菌群的生长提供了营养物质，造成口腔微生物的增殖。这两方面的因素共同导致了口干症、牙周炎、牙龈炎和龋齿等口腔疾病。同时，也有一些研究表明糖尿病患者的唾糖浓度与其血糖水平呈正相关，导致其罹患口腔疾病的概率高于正常人。

通常情况下，口腔疾病是缓慢发生的，早期多无明显临床症状，不易被患者察觉。等到出现疼痛等不适症状时就已经到了疾病的中晚期，治疗起来很复杂，患者也会遭受更大的痛苦，花费更多的费用。因此唾糖含量的测定对口腔疾病和糖尿病的预防和治疗具有重要的意义。

唾液成分复杂(如蛋白质：粘蛋白、白蛋白、球蛋白；酶：唾液淀粉酶、麦芽糖酶、磷酸脂酶；无机成分：钠、磷、钾、镁、氧化物和硫酸盐、碳酸盐等；此外还有尿素、尿酸和微量的氨、粘液素、微量元素、白细胞、上皮细胞、痕量物质、微生物等)，且理论上其葡萄糖浓度仅为血液中葡萄糖浓度的1/50-1/100(1.98-119.99mg/L),因此目前主要依靠高精度的仪器实现唾糖的检测，例如气相色谱、液相色谱、离子色谱、气/液-质联用等。这些仪器设备价格昂贵，操作复杂，很难实现即时检测，因而其应用受到限制。文献中也有报道通过电化学、光学方法实现唾糖检测，但是由于高非特异性干扰，这两种方法都难以实现真实唾液中葡萄糖的准确检测。现有技术基于硼酸基水凝胶的石英晶体微天平传感器能够实现唾糖的特异性检测。该***将唾液中的葡萄糖浓度信号转化为石英晶振传感器的频率信号，从而获得唾液葡萄糖浓度。石英晶体微天平唾糖传感器的优点是快速精准，但是因为其样品前处理过程复杂，需要专业人士才可完成检测。

试纸法检测唾糖具有操作简便、价格低廉等优点，在唾糖检测方面具有较好的应用前景。目前已有部分现有技术报道成功合成出测试葡萄糖的试纸条，利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生过氧化氢，在过氧化氢酶的催化作用下将无色的邻-联二茴香胺氧化成为有色的产物从而使试纸显色，通过测定试纸颜色变化进行葡萄糖的定量检测。虽然利用中空的聚合物纳米纤维包覆酶，具有酶用量少、储存稳定性高等优点，但是其检测对象为血糖，只能对高浓度的葡萄糖有响应，在10mmol/L才有明显的颜色变化，不能满足低浓度唾糖的检测需求。现有技术还利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生过氧化氢，在过氧化氢酶的催化作用下将10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪催化成为有色的产物，通过肉眼观察颜色的变化定性判断出葡萄糖的高低。但目前只能定性区别唾液中葡萄糖含量的高低。现有技术通过膜过滤血液，利用色原试剂、助显色剂与H₂O₂的显色反应检测血糖中的葡萄糖，但其同样只能对高浓度的葡萄糖有响应。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种唾液葡萄糖检测试纸及其制备和应用方法。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种唾液葡萄糖检测试纸，所述唾液葡萄糖检测试纸包括酶层和显色层，所述酶层包括葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和维生素C氧化酶；

优选地，所述酶层中葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和维生素C氧化酶的酶活力单位配比为：50～200：50～200：1～10，优选为50～150：100～200：1～5，最优选为100:150:2；和/或

优选地，所述酶层中葡萄糖氧化酶含量为500～1500U，进一步优选为800～1200U，最优选为1000U；辣根过氧化物酶含量为1000～2000U，优选为1200～1800U，最优选为1500U；维生素C氧化酶含量为10～50U，优选为10～30U，最优选为20U。

根据本发明第一方面的唾液葡萄糖检测试纸，其中，所述显色层包括2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸和4-氨基安替比林。

根据本发明第一方面的唾液葡萄糖检测试纸，其中，所述试纸的酶层或显色层中还包括酶激活剂、液体扩散控制剂和/或酶稳定剂；

优选地，所述酶激活剂选自以下一种或多种：柠檬醛、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸；优选为柠檬醛；

优选地，所述液体扩散控制剂选自以下一种或多种：聚乙二醇200、聚乙二醇600、聚乙烯醇；优选为聚乙二醇200；和/或

优选地，所述酶稳定剂为牛血清白蛋白。

本发明的第二方面提供了第一方面所述的唾液葡萄糖检测试纸的制备方法，其中，所述方法包括通过在酶液和显色液中浸泡烘干而分别制备所述试纸的酶层和显色层；

优选地，所述浸泡烘干包括以下步骤：将滤纸置于所述酶液或显色液中浸泡后，将滤纸冷藏烘干；

更优选地，所述滤纸在酶液中浸泡时间为1～10小时，优选为2～6小时，最优选为5小时；所述冷藏温度为-10～-30℃，优选为-15～-25℃，最优选为-20℃；所述冷藏时间为6～24小时，优选为6～18小时，最优选为12小时；所述烘干温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或所述烘干时间为10～60分钟，优选为20～50分钟，最优选为30分钟。

根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述酶液中，葡萄糖氧化酶的浓度为50～200U/mL，优选为50～150U/mL，最优选为100U/mL；

所述辣根过氧化物酶的浓度为50～200U/mL，优选为100～200U/mL，最优选为150U/mL；和/或

所述维生素C氧化酶的浓度为1～10U/mL，优选为1～5U/mL，最优选为2U/mL。

根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述显色液中，2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸的浓度为1～20mg/mL优选为1～10mg/mL最优选为5mg/mL；和/或

4-氨基安替比林的浓度为10～50mg/mL优选为10～30mg/mL最优选为20mg/mL。

根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述酶液中还包括：

酶激活剂，所述酶激活剂的浓度为0.5～2mg/mL优选为1～1.5mg/mL最优选为1.22mg/mL；

液体扩散控制剂，所述液体扩散控制剂的添加量为10μL～500μL/mL优选为50～200μL/mL最优选为100μL/mL；和/或

酶稳定剂，所述酶稳定剂的浓度为5～20mg/mL优选为8～12mg/mL最优选为10mg/mL。

本发明的第三方面提供了一种唾液葡萄糖检测装置，所述唾液葡萄糖检测装置包括第一方面所述的唾液葡萄糖检测试纸或按照第二方面所述的制备方法而制得的唾液葡萄糖检测试纸。

根据本发明第三方面的装置，其中，所述试纸还包括比色卡、脱脂棉、吸水垫和/或封装条；

优选地，所述封装条包括上封装条和下封装条；

更优选地，所述试纸设置于所述吸水垫上，所述脱脂棉设置于下封装条的顶部且置于试纸的上方，所述试纸的酶层靠近所述脱脂棉。

本发明的第四方面提供了一种唾液葡萄糖检测方法，所述方法包括使用第三方面所述的唾液葡萄糖检测装置进行唾液葡萄糖检测；

优选地，所述检测方法包括：将产品脱脂棉端放置于口腔中10分钟后取出，观察显色层的颜色，对照比色卡判断唾液葡萄糖含量。

本发明涉及一款用于快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸，用于体外检测，测试结果仅供参考。对于口腔疾病的早期预防、初步判断具有重要的意义，同时在糖尿病预防方面也具有一定的积极意义。

本产品的工作原理：待测唾液样本中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下与氧气发生反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢；过氧化氢进一步在过氧化物酶的催化作用下，和2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸反应生成2，4-二溴-3，6-二氧六环-1，4-二烯甲酸，生成物再和4-氨基安替比林反应，生成红色亚胺类物质。红色物质的生成量与唾液中的葡萄糖含量正相关，因此反应产物的色度可以间接指示唾糖含量。

本发明的唾液葡萄糖检测试纸可对唾液中低浓度葡萄糖(0-200mg/L)含量进行半定量检测。

本发明的唾液葡萄糖检测试纸可以具有但不限于以下有益效果：

本发明涉及一款用于快速检测唾液中葡萄糖含量的试纸，用于体外检测，对于口腔疾病的早期预防、初步判断具有重要的意义，同时在糖尿病预防方面也具有一定的积极意义。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了本发明唾液葡萄糖检测装置的结构示意图。

图2示出了本发明唾液葡萄糖检测装置的平面图。

图3示出了本发明唾液葡萄糖检测试纸的测试结果图。

图4示出了葡萄糖浓度与试纸显色亮度的线性关系。

附图标记说明：

1、比色卡；2、上封装条；3、脱脂棉；4、试纸；5、吸水垫；6、下封装条；7、酶层；8、显色层。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和材料如下：

试剂和材料：

定性滤纸，购自Whatman；

酶试剂，购自保定长城临床试剂有限公司；

葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、聚乙二醇-200、2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸、柠檬醛，购自Macklin；

维生素C氧化酶，购自Sigma；

牛血清白蛋白，购自北京克尔慧生物；

明胶、磷酸盐缓冲溶液，购自北京华力德；

4-氨基安替比林，购自北京伊诺凯科技有限公司。

实施例1

本实施例用于说明本发明唾液葡萄糖检测装置的结构和制备方法。

如图1所示，本发明唾液葡萄糖检测装置由以下几个部分组成：比色卡1；上封装条2；脱脂棉3；试纸4；吸水垫5；下封装条6。

组装过程：将试纸4粘到吸水垫5上，然后放置于下封装条6上，再将脱脂棉3放置于下封装条6顶部圆形区域，置于试纸4上方，然后利用上封装条2将整体组装起来，再向上封装条2后端打印上比色卡1。其中，所述试纸4包括酶层7和显色层8，所述酶层7靠近所述脱脂棉3。

试纸的制备方法：试纸是本产品的核心组件，以下阐述其制备方法。

将滤纸裁剪成4cm*4cm的正方形，浸入下述(1)配制的酶液中室温浸泡5小时，从酶液中取出滤纸并将滤纸上的残留物擦拭干净，将滤纸置于冰箱中-20℃冷藏12小时后再在烘箱中30℃下保持30分钟；之后将滤纸直立(浸没高度约0.5cm)放入下述(2)中的显色液中室温浸泡1-2小时，从显色液中取出滤纸并将滤纸上的残留物擦拭干净，将滤纸置于冰箱中-20℃冷藏12小时后再在烘箱中30℃下保持30分钟。最后将滤纸裁剪成合适大小即可。

第一步是滤纸完全浸入酶液，第二步是滤纸直立放入显色液(高度约为0.5cm)中，此时，显色剂将被吸附到滤纸的下端。显色液中也添加有明胶，所以整体溶液均匀。此外，由于毛细现象，滤纸下端约有0.5-1cm处分布有显色剂。此处显色剂同时也和前面附着的酶剂混合，有利于增加反应速度。且这种2步浸泡的方法使得试纸显示无色或淡黄色，和生成物―红色可以有效区分，便于观察结果。

(1)酶液的配制：用移液枪取10mL酶试剂注入70*40培养皿中，向培养皿中依次添加1000U葡萄糖氧化酶，1500U辣根过氧化物酶，20U维生素C氧化酶，1mL聚乙二醇-200，10uL柠檬醛，100mg牛血清白蛋白后混匀，然后再加入2mL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)；

(2)显色液的配制：用移液枪取10mL pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)注入70*40培养皿中，向培养皿中依次添加50mg 2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸，200mg 4-氨基安替比林，后混匀，然后再加入2mL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)。

试验例1

本实施例用于说明本发明唾液葡萄糖检测试纸的使用方法和效果。

使用方法：将产品圆形顶端放置于口腔中10分钟后取出，肉眼直接观察显色层的颜色，对照比色卡判断唾液葡萄糖含量。

本发明可实现唾液中葡萄糖浓度的半定量测定，实验验证结果如下：配制葡萄糖浓度依次为0、10、20、50、100、200mg/L的PBS溶液用以测试试纸的有效性。将滤纸显色部分裁剪成1cm*1cm正方形，移液枪取30uL样本滴加到滤纸上。从图3可以看出，当葡萄糖浓度逐渐增加时，反应生成的红色越来越重(试纸显色区域为白色或者淡黄色)。之后，利用唾液(将唾液采集管中的棉团放入口腔中咀嚼3-5分钟，然后放回置采集管中，4000r/min离心10分钟，获得唾液)取代PBS溶液并向唾液中依次添加不同含量的葡萄糖，获得浓度依次为0、10、20、50、100、200的人工唾糖溶液，重复上述实验。由图3可以看出，当唾液中葡萄糖浓度逐渐增加时，反应生成的红色越来越重。

将图3中的测试结果以三原色(RGB)中红色的亮度为指标进行量化(取试纸中央100个像素点的均值)，可得表1中所列的数据。由图4可以看出，唾糖试纸的显色亮度会随PBS缓冲液及唾液中葡萄糖浓度的升高而单调降低，通过线性拟合可知试纸的显色亮度与糖浓度之间呈较好的线性关系(R²～0.9)，据此线性关系即可由试纸的颜色半定量地判定测试唾糖的浓度。

表1唾糖浓度与试纸显色亮度

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种唾液葡萄糖检测试纸，其特征在于，所述唾液葡萄糖检测试纸包括酶层和显色层，所述酶层包括葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和维生素C氧化酶；

优选地，所述酶层中葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶和维生素C氧化酶的酶活力单位配比为：50～200：50～200：1～10，优选为50～150：100～200：1～5，最优选为100:150:2；和/或

优选地，所述10mL酶液中葡萄糖氧化酶含量为500～1500U，进一步优选为800～1200U，最优选为1000U；辣根过氧化物酶含量为1000～2000U，优选为1200～1800U，最优选为1500U；维生素C氧化酶含量为10～50U，优选为10～30U，最优选为20U。

2.根据权利要求1所述的唾液葡萄糖检测试纸，其特征在于，所述显色层包括2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸和4-氨基安替比林。

3.根据权利要求1或2所述的唾液葡萄糖检测试纸，其特征在于，所述试纸的酶层中还包括酶激活剂、液体扩散控制剂和/或酶稳定剂；

优选地，所述酶激活剂选自以下一种或多种：柠檬醛、谷胱甘肽、乙二胺四乙酸；优选为柠檬醛；和/或

优选地，所述液体扩散控制剂选自以下一种或多种：聚乙二醇200、聚乙二醇600、聚乙烯醇；优选为聚乙二醇200；和/或

优选地，所述酶稳定剂为牛血清白蛋白。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的唾液葡萄糖检测试纸的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过在酶液和显色液中分别浸泡烘干而制备所述试纸的酶层和显色层；

优选地，所述浸泡烘干包括以下步骤：将滤纸置于所述酶液或显色液中浸泡后，将滤纸冷藏烘干；

更优选地，所述滤纸的浸泡时间为1～10小时，优选为2～6小时，最优选为5小时；所述冷藏温度为-10～-30℃，优选为-15～-25℃，最优选为-20℃；所述冷藏时间为6～24小时，优选为6～18小时，最优选为12小时；所述烘干温度为20～35℃，优选为25～35℃，最优选为30℃；和/或所述烘干时间为10～60分钟，优选为20～50分钟，最优选为30分钟。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酶液中，葡萄糖氧化酶的浓度为50～200U/mL，优选为50～150U/mL，最优选为100U/mL；

所述辣根过氧化物酶的浓度为50～200U/mL，优选为100～200U/mL，最优选为150U/mL；和/或

所述维生素C氧化酶的浓度为1～10U/mL，优选为1～5U/mL，最优选为2U/mL。

6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述显色液中，2，4，6-三溴-3-羟基苯甲酸的浓度为1～20mg/mL优选为1～10mg/mL最优选为5mg/mL；和/或

4-氨基安替比林的浓度为10～50mg/mL优选为10～30mg/mL最优选为20mg/mL。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶液中还包括：

酶激活剂，所述酶激活剂的浓度为0.5～2mg/mL优选为1～1.5mg/mL最优选为1.22mg/mL；

液体扩散控制剂，所述液体扩散控制剂的添加量为10μL～500μL/mL优选为50～200μL/mL最优选为100μL/mL；和/或

酶稳定剂，所述酶稳定剂的浓度为5～20mg/mL优选为8～12mg/mL最优选为10mg/mL。

8.一种唾液葡萄糖检测装置，其特征在于，所述液葡萄糖检测装置包括根据权利要求1至3中任一项所述的唾液葡萄糖检测试纸或按照权利要求4至7中任一项所述的制备方法而制得的唾液葡萄糖检测试纸。

9.根据权利要求8所述的唾液葡萄糖检测装置，其特征在于，所述试纸还包括比色卡、脱脂棉、吸水垫和/或封装条；

优选地，所述封装条包括上封装条和下封装条；

更优选地，所述试纸设置于所述吸水垫上，所述脱脂棉设置于下封装条的顶部且置于试纸的上方，所述试纸的酶层靠近所述脱脂棉。

10.一种唾液葡萄糖检测方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求9所述的唾液葡萄糖检测装置进行唾液葡萄糖检测；

优选地，所述检测方法包括：将产品脱脂棉端放置于口腔中10分钟后取出，观察显色层的颜色，对照比色卡判断唾液葡萄糖含量。

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