CN111575199A - 一株铜绿假单胞菌jt86及其在防治菌核病中的应用 - Google Patents

一株铜绿假单胞菌jt86及其在防治菌核病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株铜绿假单胞菌JT86及其在防治菌核病中的应用。本发明从土壤中筛选得到了一株铜绿假单胞菌JT86，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60799。该菌株及其挥发物能够完全抑制水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌的菌核萌发，抑制其菌核的菌丝的生长，使得菌核的菌丝出现片状、皱缩，且该菌株对水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、菜心炭疽病菌、茶炭疽病菌、辣椒炭疽病菌也具有很好的抑制效果；因此，该菌株能够针对性处理土壤中顽拗的土传病原菌，有效抑制菌核病的发生，在制备防治土传真菌病害的土壤处理剂中具有良好的应用前景。

Description

一株铜绿假单胞菌JT86及其在防治菌核病中的应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域。更具体地，涉及一株铜绿假单胞菌JT86及其在防治菌核病中的应用。
背景技术
由植物病原真菌引起的土传病害是制约我国农业生产可持续发展的重要瓶颈。与细菌、线虫等植物病原物相比，土壤理化环境一般不利于植物病原真菌生长，因此植物病原真菌通常以一些繁殖体(如菌核、厚壁分生孢子)存在于土壤中，或腐生于植物根部和作物残余物。由于植物与病原真菌在互作过程形成了高度专化又相互选择、协同进化的***，因此种类繁多的土传病原真菌具有不同的专化型；如，镰刀菌属真菌可引发棉花、黄瓜和西瓜等作物发病。有些土传病害不是单一病原菌形成，而是多种病原菌复合侵染的结果，这也使得土传病害的致病机理更为复杂。
水稻纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的水稻三大真菌病害之一，世界各产稻国家均有分布，亚洲稻区危害最为严重，水稻感染后品质出现明显下降，严重时导致绝收。在我国，该病每年的发病面积达2亿多亩，除了水稻，该菌还可以侵染200多种其它作物，引起重要的立枯病等。立枯丝核菌在自然界中通过产生菌核越冬或者渡过不良环境，其引起的植物病害是一类重要的产菌核的土传病害。我国是油菜种植大国，由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的油菜菌核病是影响我国油菜产量的主要病害。该病目前呈现逐渐严重趋势，发生轻的年份减产10％-20％，重则减产50％以上。核盘菌的寄主范围非常广，可以危害十字花科、豆科、茄科、芸香科等多达400种植物，引起菌核病。由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的白绢病和大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)引起的黄萎病，也可以危害多达200种作物，对我国的农业生产造成巨大的经济损失。以上这些真菌都能产生菌核或微菌核。菌核是一些丝状真菌形成的特殊的休眠结构体，由病原菌的菌丝高度聚集，缠绕形成初期纠结体，之后高度分化，细胞壁加厚和分泌黑色素，最终会形成类似球形的深黑色菌核。菌核在没有受到寄主植物侵染的条件下，可以在土壤里保存十多年依旧有活性。病菌主要以菌核越冬，越冬菌核的数量是以上菌核病发生的关键因素。由于菌核病具有寄主范围广、易传播、生命力顽强等特点，目前还没有特别有效的防治方法，主要通过化学农药进行防治。但是，常年使用化学农药对人类和自然环境产生了很大的损害，使病害防治变得更加困难。因此，寻找对环境友好的有益微生物，进行菌核病的生物防治已经成为研究的热点，受到了越来越多的重视。
许多生防菌都能在代谢过程中代谢出一些抑制病原菌生长的物质，如一些特殊蛋白细菌毒素、抗生素、几丁质等一些酶类等，直接抑制了病原菌的生长和代谢活动，在效果极强的抗菌物质作用下，甚至能使病原菌失活。生防细菌具有生长繁殖快、数量大，种类多，获取途径简单，作用方式多样等特点，在植物病害生物防治的研究和实践中作用显著。因此，进一步筛选出具有广谱抑菌活性的高效生防细菌，对于土传病害的生物防治和绿色生物制剂的开发具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有土传真菌病害防治技术的缺陷和不足，提供一株铜绿假单胞菌JT86及其在防治菌核病中的应用。本发明以防治菌核病为目标，从环境中筛选出了能够高效抑制菌核萌发和发育的生防细菌(铜绿假单胞菌JT86)，可用于制备土壤处理剂和杀真菌制剂，在防治土传真菌病害和植物的绿色防控中具有广阔的应用空间。
本发明的目的是提供一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86。
本发明另一目的是提供所述铜绿假单胞菌JT86在防治土传真菌病害或制备防治土传真菌病害的土壤处理剂中的应用。
本发明又一目的是提供所述铜绿假单胞菌JT86在防治真菌病害或制备杀真菌制剂中的应用。
本发明又一目的是提供一种防治土传真菌病害的土壤处理剂。
本发明再一目的是提供一种杀真菌制剂。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86，，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60799，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明从土壤中筛选得到了一株绿假单胞菌JT86，该菌株及其挥发物能够完全抑制水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌的菌核萌发，抑制其菌核的菌丝的生长，使得菌核的菌丝出现片状、皱缩，能够用做土壤处理剂以防治由菌核病引起的土传病害；且该菌株对水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、菜心炭疽病菌、茶炭疽病菌、辣椒炭疽病菌也具有很好的抑制效果；因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
所述铜绿假单胞菌JT86在防治土传真菌病害或制备防治土传真菌病害的土壤处理剂中的应用。
优选地，所述土传真菌病害为菌核病。
优选地，所述菌核病为由水稻纹枯病菌、花生白绢病菌或油菜菌核病菌引起的菌核病。
所述铜绿假单胞菌JT86在防治真菌病害或制备杀真菌制剂中的应用。
优选地，所述真菌为水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、菜心炭疽病菌、茶炭疽病菌或辣椒炭疽病菌。
本发明还提供了一种防治土传真菌病害的土壤处理剂，包括所述的铜绿假单胞菌JT86或其发酵液。
本发明还提供了一种杀真菌制剂，包括所述的铜绿假单胞菌JT86或其发酵液。
本发明具有以下有益效果：
本发明从土壤中筛选得到的铜绿假单胞菌JT86及其挥发物能够完全抑制水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌的菌核萌发，抑制其菌核的菌丝的生长，使得菌核的菌丝出现片状、皱缩，能够用做土壤处理剂以防治由菌核病引起的土传病害；另外，该菌株对水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、菜心炭疽病菌、茶炭疽病菌、辣椒炭疽病菌也具有很好的抑制效果；因此，应用该菌株防治土传真菌病害或制备防治土传真菌病害的土壤处理剂，能够减少化学农药的使用，减少农药残留，为以生物防治逐渐替代化学防治提供新的途径，具有广泛的开发应用前景。
附图说明
图1是JT86菌株的形态特征图；其中，(A)图为JT86菌株的菌落革兰氏染色图；(B)图为JT86菌株的电镜扫描图。
图2是JT86菌株的16S rDNA基因进化树。
图3是JT86菌株的gyrB基因进化树。
图4是铜绿假单胞菌JT86对花生白绢病菌的菌核的抑制效果图；其中，(A1)为对照组10μm电镜图，(A2)为对照组20μm电镜图，(B1)为对照组10μm电镜图，(B2)为对照组20μm电镜图。
图5是铜绿假单胞菌JT86对水稻纹枯病菌的抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
图6是铜绿假单胞菌JT86对花生白绢病菌的抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
图7是铜绿假单胞菌JT86对稻瘟病菌的抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
图8是铜绿假单胞菌JT86对香蕉枯萎病菌的抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
图9是铜绿假单胞菌JT86对菜心炭疽病菌的抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
图10是铜绿假单胞菌JT86对茶炭疽病菌的抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
图11是铜绿假单胞菌JT86对辣椒炭疽病菌的抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
图12是铜绿假单胞菌JT86对油菜菌核病菌的抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
图13是铜绿假单胞菌JT86的挥发物对花生白绢病菌的对扣培养抑制效果图；其中，(A)图为对照组；(B)图为处理组。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86的分离与筛选
1、样品采集：
从广东省广州市天河区华南农业大学跃进北区农场的稻田采集土壤样品，放在无菌的离心管中带回实验室进行菌株的分离。
2、生防菌的分离：
将土壤样品混匀后，取5g土样放在50mL的无菌离心管中，加入无菌水至50mL，剧烈震荡悬浮土样，标记为1×10-1。接着用移液枪吸取1mL 1×10-1的土样悬浮液至装有9mL无菌水的新离心管中，依次稀释成1×10-2、1×10-3的系列浓度土壤溶液。吸取0.1mL的1×10-2、1×10-3土壤溶液至固体LB平板(yeast extract 5g，tryptone 10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.2，琼脂粉15g，121℃灭菌15min)上，以涂布棒涂布涂匀，晾干后置于30℃培养箱培养1～2d。挑取单菌落进行初筛。
3、生防菌的初筛：
用6mm打孔器打取菌块，接种在PDA平板中央。将步骤2获得的细菌(单菌落)接种在距病原菌菌块2.5cm处，每皿4株不同候选细菌，以不接细菌为对照，在28℃下进行培养，至对照组病原菌菌落长满培养皿，观察细菌周围是否出现抑菌圈。保存能够产生抑菌圈的菌株并编号。接着用6mm打孔器打取菌块，接种在PDA平板右侧，然后将上述能产生抑菌圈的菌株接种在距离病原菌块3cm处，每皿1株细菌，以不接菌为对照。在28℃下进行培养，至对照组病原菌菌落长满培养皿，观察细菌周围是否出现明显的抑菌圈。将能产生明显抑菌圈的菌株单独保存，记录其编号。
4、生防细菌的复筛：
病原菌：水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌、棉花黄萎病菌、稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、菜心炭疽病菌、茶炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、烟草靶斑病菌、番茄灰霉病菌；
病原菌接种方法与步骤3中相同，候选生防细菌接种每皿4株编号相同细菌，以不接生防细菌为对照，在28℃下进行培养，至对照组病原菌菌落长满培养皿，测量病原菌菌落直径和对照组病原菌菌落直径，记录，按照以下公式计算抑菌率：
抑菌率(％)＝(对照组菌丝直径-处理组菌丝直径)/对照组菌丝直径×100％；
以上述方法获得菌株编号为JT86的细菌，该细菌对多种病原真菌具有较高防效。
实施例2铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86的鉴定
1、形态鉴定
(1)实验方法
对实施例1筛选得到的JT86菌株在LB培养基上培养，观察形态特征，并进行生理生化鉴定。
(2)实验结果
JT86菌株的形态特征图如图1所示，可以看出，该菌株的菌落形态为圆形，淡黄色，边缘平整，中央凸起，表面光滑，无光泽，半透明，革兰氏染色阴性，电镜下显示菌体为短椭圆的杆状，单胞，菌体大小1.8×3.0μm。
另外，生理生化鉴定结果发现，JT86菌株的接触酶反应、氧化酶反应、运动性测定、V-P试验、明胶液化和硝酸盐还原等生理生化试验呈阳性，淀粉水解、甲基红反应和硫化氢反应等呈阴性，需氧，不能利用葡萄糖、果糖、乳糖、甘露醇、蔗糖和麦芽糖。
结合以上JT86菌株的形态特征和生理生化特征结果，初步鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。
2、分子鉴定
(1)实验方法
JT86菌株的基因组DNA提取步骤参照产品(Bacterial DNA Kit D3350，OMEGA)说明书，DNA浓度用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo Scientific，Wilmington，DE)进行检测。
将所提取的JT86菌株的基因组DNA作为模板，采用细菌16S rDNA通用引物(正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')和gyrB基因通用引物(正向引物：5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'，反向引物：5'-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'，Y表示C或T，N表示A、T、C或G R表示A或G)，进行PCR扩增；细菌16S rDNA通用引物和gyrB基因通用引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。
PCR扩增的反应体系为(25μL)：2×PCR Mix 12.5μL，正向引物(10μmol/L)1.0μL，反向引物(10μmol/L)1μL，DNA模板1μL，去离子水补至25μL。反应液分装于PCR管中，混匀后进行PCR反应。PCR扩增的反应程序为：98℃预变性2min，98℃10s，56℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃最终延伸10min。
PCR扩增反应得到的片段经回收纯化后，由北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，测得序列提交到NCBI进行序列比对。根据JT86菌株的16S rDNA序列、gyrB基因序列与数据库中已有的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的序列进行比对，构建***进化树。
(2)实验结果
JT86菌株的16S rDNA基因进化树如图2所示，JT86菌株的gyrB基因进化树如图3所示，结果表明JT86菌株与铜绿假单胞菌聚为一支。
结合形态和分子鉴定，将JT86菌株鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)JT86，并于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNO：60799，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86对菌核萌发的抑制实验
1、实验方法
取-80℃甘油保存的铜绿假单胞菌JT86，在LB固体培养基上30℃活化48h，蘸取活化后的铜绿假单胞菌JT86的单菌落至100mL NA液体培养基，28℃下200rpm摇菌培养48h。之后按照10％接种量二次培养，即取10％菌液于100mL NA液体培养基中，28℃下200rpm摇菌培养48h，得到铜绿假单胞菌JT86发酵液。
挑取大小一致的水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌的菌核各120个，设置对照组和处理组各3次重复，对菌核进行表面消毒，即用10％次氯酸钠(有效氯含量)消毒5分钟后，用无菌水冲洗干净，置于无菌滤纸上充分晾干，晾干后置于100mL的铜绿假单胞菌JT86发酵液中，对照组为NA液体培养基。在28℃、200rpm的摇床上摇菌培养24h后，取出菌核后，再用无菌水冲洗菌核，无菌滤纸上充分晾干，放在水琼脂平板上，记录菌核萌发的数目，按照以下公式计算菌核的萌发抑制率：
抑制率/％＝[(对照组萌发数-处理组萌发数)/对照组萌发数]×100。
在28℃、200rpm的摇床上摇培24h摇出菌丝球后(油菜核盘菌菌核萌发的较慢，需要延长摇培时间)，实验组用灭过菌的镊子挑取菌丝球放入铜绿假单胞菌JT86发酵液中，再培养24h，对照组在NA液体培养基中摇培。设置3组重复。分别挑取一个菌核分装1.5mL离心管中，然后加入三倍菌丝体体积的戊二醛固定两三天即可。扫描电镜观察，首先固定样品，然后用系列浓度酒精对样品进行脱水处理，再用专门的仪器进行干燥。样品干燥后用真空喷镀仪器喷碳，再喷镀，喷镀均匀，完成所有步骤后用电镜(XL-30-ESEM)，荷兰FEI观察菌体形态。
2、实验结果
铜绿假单胞菌JT86对三种产菌核真菌的菌核萌发抑制率如表1所示，可以看出，对照组三种产菌核真菌(水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌)的菌核全部萌发，而经过铜绿假单胞菌JT86发酵液处理后的三种产菌核真菌的菌核均不能萌发，菌核的萌发抑制率均为100％；说明铜绿假单胞菌JT86能够完全抑制水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌的菌核萌发。
表1铜绿假单胞菌JT86对三种产菌核真菌的菌核萌发抑制率
Figure BDA0002460292950000081
铜绿假单胞菌JT86对花生白绢病菌的菌核的抑制效果图如图4所示，其中，(A1)为对照组10μm电镜图，(A2)为对照组20μm电镜图，(B1)为对照组10μm电镜图，(B2)为对照组20μm电镜图；可以看出，对照组中花生白绢病菌的菌核的菌丝能够正常生长，菌丝表面光滑、形态饱满；而经过铜绿假单胞菌JT86发酵液处理后的的菌核的菌丝出现片状、皱缩；说明铜绿假单胞菌JT86能够完全抑制花生白绢病菌的菌核的菌丝的生长。
实施例4铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86对病原真菌的对峙实验
1、实验方法
采用皿内对峙法来测定铜绿假单胞菌JT86对病原真菌(水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、菜心炭疽病菌、茶炭疽病菌、辣椒炭疽病菌)的抑菌率。
把直径为5mm的病原真菌菌饼接种到PDA平板的中央，在距离病原真菌25mm的四个方位放上直径为5mm的无菌滤纸片，用移液枪分别取10μL无菌水/铜绿假单胞菌JT86发酵液(对照组为无菌水、处理组为铜绿假单胞菌JT86发酵液)滴在滤纸片上，放在无菌通风台上晾干。28℃恒温培养1-2d后进行观察，测量抑菌圈直径并按照以下公式计算抑菌率：
抑菌率＝(对照组病原菌生长直径-处理组病原菌生长直径)/对照病原菌生长直径×100％。
2、实验结果
铜绿假单胞菌JT86对病原真菌的抑菌率结果如表2所示，铜绿假单胞菌JT86对水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、菜心炭疽病菌、茶炭疽病菌、辣椒炭疽病菌的抑制效果图依次如图5-图12所示，从表2和图5-图12可以看出，铜绿假单胞菌JT86对以上8种病原真菌均有较高的抑制率，抑制率为59.48％～87.02％。
表2铜绿假单胞菌JT86对病原真菌的抑菌率结果
Figure BDA0002460292950000091
实施例5铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86的挥发物对病原真菌的抑菌效果
1、实验方法
挥发物对扣实验：滴加100μL的铜绿假单胞菌JT86发酵液于LB平板上后，用涂布棒涂布均匀，置于30℃培养箱内培养24h；在PDA平板上覆盖一层灭菌后的玻璃纸，排除气泡使之平整，处理组接三种产菌核真菌(水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌)于PDA平板中央，两者对扣，密封好，置于30℃培养箱内；对照组涂布无菌水。观察时撕下玻璃纸，剪取少量最外缘菌丝于显微镜下观察。通过与正常菌丝的形态比较，判断铜绿假单胞菌JT86是否对水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌菌丝的生长有影响。
用SPME-GC-MS(气相色谱-质谱联用)的方法对铜绿假单胞菌JT86的VOCs进行鉴定。将1mL铜绿假单胞菌JT86发酵液接种至含有20mL PDA液体培养基的50mL三角瓶中，用锡箔纸封口，在28℃、200rpm摇床中振荡培养2d，然后用SPME萃取头萃取产生的VOCs，进行GC-MS(气相色谱-质谱联用)分析。
GC-MS(气相色谱-质谱联用)条件：7890A-5975C GC/MSD气质联用仪；色谱柱为HP-5石英毛细管柱(30m×0.25m×0.25μm，Agilent)。进样口温度280℃，传输线温度250℃。程序升温如下：起始柱温100℃停留1min；以5℃min升至200℃；然后以10℃/min升至300℃；最后以8℃/min升至250℃停留5min。载气为高纯氦(99.999％)；柱流量1mL/min。进样量1.0μL(不分流)。
GC-MS分析：GC条件如上所述。MS条件如下：离子源温度280℃；电离方式EI，电离能量70eV；全扫描采集，质谱检测器(MSD)检测。通过NIST(2011)谱库检索，确定待测成分。
2、实验结果
铜绿假单胞菌JT86的挥发物对病原真菌的抑菌效果如表3所示，可以看出，铜绿假单胞菌JT86的挥发物对三种产菌核真菌的抑菌率均为100％。
铜绿假单胞菌JT86的挥发物对花生白绢病菌的对扣培养抑制效果图如图13所示，可以看出，对照组的花生白绢病菌在PDA平板上萌发、菌丝正常生长、延伸，而处理组经过铜绿假单胞菌JT86的挥发物处理的花生白绢病菌在PDA平板上不能够萌发，菌丝不能够很没有生长、延伸；说明铜绿假单胞菌JT86的挥发物具有明显的抑制水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌菌丝生长的作用。
另外，通过SPME-GC-MS分析了铜绿假单胞菌JT86产生的挥发物，VOCs实验结果显示：其挥发物大部分是烯类、烷类、溴仿类、烃类等化合物。
表3铜绿假单胞菌JT86的挥发物对病原真菌的抑菌效果
Figure BDA0002460292950000101
Figure BDA0002460292950000111
实施例6铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86对土壤中菌核的抑制效果
1、实验方法
用经过灭菌的20cm高的塑料盆，预先装2kg无菌混合土(营养土和沙土)，土高至盆的10cm处。平整土面，每个盆在土层10cm处放用无菌茶泡袋装已经表面消毒的菌核3包，每包10个菌核，每盆共计30个菌核。一种病原菌各用一个盆进行处理。供试的菌核包括水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌产生的菌核。之后覆盖无菌混合土(营养土和沙土)至满盆。即土的总深度20cm，菌核样品放在土样的中部。每盆土浇上铜绿假单胞菌JT86发酵液400mL，确保土层完全湿润。设置对照组，对照组浇上400mL NA培养基。土样处理好后放在实验室工作台室温存放。之后每天每盆土样浇20mL无菌水，保持土样湿润。每隔3天各从一个盆中取出1包菌核，用无菌水冲洗3次后，放在水琼脂上培养，观察菌核的萌发情况，按照以下公式计算萌发抑制率：
抑制率/％＝[(对照组萌发数-处理组萌发数)/对照组萌发数]×100。
2、实验结果
铜绿假单胞菌JT86土壤处理对三种产菌核真菌的菌核萌发抑制率如表4所示，可以看出，经过铜绿假单胞菌JT86发酵液处理的土壤中的菌核3d后，土壤中菌核的萌发受到完全的抑制，萌发抑制率均为100％；说明铜绿假单胞菌JT86发酵液能够用于土壤处理，以用于防治水稻纹枯病菌、花生白绢病菌和油菜菌核病菌引起的菌核病的防治。
表4铜绿假单胞菌JT86土壤处理对三种产菌核真菌的菌核萌发抑制率
Figure BDA0002460292950000112
Figure BDA0002460292950000121
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)JT86，其特征在于，该菌株已于2019年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60799。
2.权利要求1所述铜绿假单胞菌JT86在防治土传真菌病害或制备防治土传真菌病害的土壤处理剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述土传真菌病害为菌核病。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菌核病为由水稻纹枯病菌、花生白绢病菌或油菜菌核病菌引起的菌核病。
5.权利要求1所述铜绿假单胞菌JT86在防治真菌病害或制备杀真菌制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述真菌为水稻纹枯病菌、花生白绢病菌、油菜菌核病菌、稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、菜心炭疽病菌、茶炭疽菌或辣椒炭疽菌。
7.一种防治土传真菌病害的土壤处理剂，其特征在于，包括权利要求1所述的铜绿假单胞菌JT86或其发酵液。
8.一种杀真菌制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的铜绿假单胞菌JT86或其发酵液。
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