CN108977382B - 一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用 - Google Patents

一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108977382B
CN108977382B CN201810888400.9A CN201810888400A CN108977382B CN 108977382 B CN108977382 B CN 108977382B CN 201810888400 A CN201810888400 A CN 201810888400A CN 108977382 B CN108977382 B CN 108977382B
Authority
CN
China
Prior art keywords
streptomyces
strain
culture
days
culturing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810888400.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108977382A (zh
Inventor
黄穗萍
莫贱友
李其利
郭堂勋
唐利华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences filed Critical Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201810888400.9A priority Critical patent/CN108977382B/zh
Publication of CN108977382A publication Critical patent/CN108977382A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108977382B publication Critical patent/CN108977382B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用，其命名为米修链霉菌Streptomyces misionensis TF78，2017年10月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号：GDMCC NO:60254。该菌株对黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、柚木溃疡病、香蕉真菌性茎腐病、稻瘟病菌、芒果拟茎点霉叶斑病、芒果拟盘多毛孢叶斑病、芒果葡萄座腔菌枝枯病、芒果炭疽病等病原菌均有抑制作用。

Description

一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，公开了一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用。
背景技术
利用微生物产生的具有抑菌活性的挥发性物质防治植物病害是近些年新兴的一种防治措施。这些挥发性物质是一类小分子量的有机、无机化合物，具有良好的细胞膜穿透性和在空气、土壤空隙中高效率的扩散能力，能快速扩大挥发性物质的作用范围，提高对靶标微生物的抑制率(Aochi et al.，2005)。在美国，内生真菌Muscodor albus已被开发成生物熏蒸剂来防治黑腐丝囊(Aphanomyces cochlioides)，南方根结线(Meloidogyneincognita)，终极腐霉(P.ulti-mum)，辣椒疫(P.capsici)，立枯丝核菌(R.solani) 和大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)等土传植物病害(Strobel GA et al.， 2001；Strobel.,2006,2011)。能产生挥发性物质的微生物主要有真菌、细菌、放线菌及藻类等(李其利，2011；Sánchez-Fernández R E et al.，2016； Kai M et al.，2009；Amin F and Razdan VK，2010；Zhang Q et al.，2015；)。目前，已鉴定超过250种来自真菌、346种来自细菌的挥发性抑菌物质成分(Schulz et al.，2007；Morath et al.，2012)。这些挥发性抑菌物质包括醇类、酯类、烃、萜、酮、含硫化合物和羧酸类物质。
目前报道有草螺菌属(Herbaspirillum spp.)、假单胞杆菌属 (Pseudomonasspp.)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、木霉属(Trichoderma)能产生抑制香蕉枯萎病菌的挥发性气体，但是目前没有关于链霉菌产生挥发性气体抑制香蕉枯萎病菌的报道。也没有对二氯苯抑制香蕉枯萎病菌的报道。
参考文献：
[1]Aochi Y O,Farmer W J.Impact of soil microstructure on themolecular transport dynamics of 1,2-dichloroethane[J].Geoderma,2005,127(1-2):137-153.
[2]Strobel G A,Dirkse E,Sears J,et al.Volatile antimicrobials fromMuscodor albus,a novel endophytic fungus[J].Microbiology,2001,147(11): 2943-2950.
[3]Strobel G.Muscodor albus and its biological promise.Journal ofIndustrialMicrobiology and Biotechnology,2006,33(7),514-522.
[4]Strobel G.Muscodor species-endophytes with biologicalpromise.Phytochemistry reviews,2011,10:165-172.
[5]李其利.链霉菌JK-1的鉴定及其防病潜能和防病机制的研究[D]. 华中农业大学,2011.
[6]Sánchez-Fernández R E,Diaz D,Duarte G,et al.Antifungal volatileorganic compounds from the endophyte Nodulisporium sp.strain GS4d2II1a:a___qualitative change in the intraspecific and interspecific interactions withPythium aphanidermatum[J].Microbial ecology,2016,71(2):347-364.
[7]Kai M,Haustein M,Molina F,et al.Bacterial volatiles and theiraction potential[J].Applied microbiology and biotechnology,2009,81(6):1001-1012.
[8]Amin F,Razdan V K.Potential of Trichoderma species as biocontrolagents of soil borne fungal propagules[J].Journal of Phytology,2010,2(10).
[9]Zhang Q,Yang L,Zhang J,et al.Production of anti-fungal volatilesby non-pathogenic Fusarium oxysporum and its efficacy in suppression ofVerticillium wilt of cotton[J].Plant and Soil,2015,392(1-2):101-114.
[10]Schulz S,Dickschat J S.Bacterial volatiles:the smell of smallorganisms[J].Natural product reports,2007,24(4):814-842.
[11]Morath S U,Hung R,Bennett J W.Fungal volatile organic compounds:areview with emphasis on their biotechnological potential[J]. Fungal BiologyReviews,2012,26(2-3):73-83.
发明内容
针对目前技术的空白，本发明提供一株产挥发性抑菌物质的链霉菌株。
该链霉菌株从广西南宁市武鸣县里建镇的健康香蕉根际土壤样品中分离筛选得到，命名为米修链霉菌(Streptomyces misionensis)TF78，于 2017年10月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNO:60254。该菌株本身分离自植物根际土壤，是土壤习居菌，根际定殖能力强；能产生挥发性抑菌物质——1，4-二氯苯，强力抑制香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp cubense)的生长；其非挥发性物质对香蕉枯萎病、黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、柚木溃疡病、香蕉真菌性茎腐病、稻瘟病、芒果拟茎点霉叶斑病、芒果拟盘多毛孢叶斑病、芒果葡萄座腔菌枝枯病、芒果炭疽病等病原菌均有抑制作用；而且培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，可开发成生物熏蒸剂防治香蕉枯萎病、黄瓜枯萎病等土传病害以及芒果炭疽菌、芒果蒂腐病等采后病害，有着良好的开发应用前景。
包括如下几个步骤：
1、链霉菌的分离
采集广西南宁市武鸣县里建镇的健康香蕉根际土壤样品，对土壤样品进行干燥和过筛处理，然后用梯度稀释法分离土壤中的放线菌。
2、链霉菌抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长
采用平板对峙法鉴定分离到的放线菌对香蕉枯萎病菌的抑制活性，得到对香蕉枯萎病菌丝生长有强抑制作用的生防菌株TF78。
3、链霉菌的鉴定
经过形态特征、生理生化特性和16S rDNA测序分析，TF78为米修链霉菌(Streptomyces misionensis)
4、链霉菌的培养
在PDA培养平板上划线、28℃培养4天，得到TF78的单菌落；挑取单菌落到ISP1液体培养基上28℃、180rpm震荡培养4天得到TF78 的培养液，即种子液；吸取1ml种子液到150g小麦培养基上28℃固体培养10天，得到TF78的固体培养物；固体培养物干燥、粉碎得到固体制剂。
5、链霉菌的保藏
米修链霉菌(Streptomyces misionensis)TF78，于2017年10月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO:60254。
6、链霉菌产生挥发性气体抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长
采用两皿对扣法，将40gTF78的固体培养物放于培养皿中，另一培养皿制成PDA平板，在平板中间接种香蕉枯萎病菌菌饼，以不加TF78的 40g小麦培养基为对照。培养7d后，测量菌落直径，计算抑制率。链霉菌产生的挥发性气体强烈抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长。
7、链霉菌产生的挥发性抑菌气体成分分析
采用顶空固相微萃取方法，收集TF78产生的挥发性气体成分；用气质联用仪分析测定挥发性气体成分，与对照相比，TF78产生的主要化合物为1，4-二氯苯。1，4-二氯苯目前为人工合成，用作家居防霉防虫剂和土壤熏蒸剂等。
8、链霉菌TF78降低香蕉枯萎病菌的发病率
将链霉菌的固体制剂与含菌土混合，密封1d后，接种香蕉组培苗，置于28℃培养50d，调查香蕉枯萎病发病率，链霉菌的防效达到72.35％。
9、1，4-二氯苯抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长
在直径150mm的大培养皿中(体积约0.5L)放进4个直径60mm的小培养皿，其中三个小培养皿做成PDA平板，在PDA平板中央接入直径 5mm的香蕉枯萎病菌菌饼，剩下的一个小皿中放进1，4-二氯苯固体，用封口膜封口，放进干燥密封缸里28℃培养5d。设置4个浓度，0mg/L、1 mg/L、10mg/L、100mg/L。每个浓度3个重复(一个大皿一个重复)。测量每个小皿的菌落直径，计算抑菌率。1mg/L的抑菌率为4.06％，10 mg/L的抑菌率为65.70％，100mg/L的抑菌率为100％。
10、链霉菌抑制其他9种病害的病原菌生长
采用平板对峙法测定链霉菌TF78对香蕉枯萎病菌、柚木溃疡病菌、香蕉茎腐病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、黄瓜枯萎病菌、杧果拟茎点霉、杧果拟盘多毛孢、杧果葡萄座腔菌、杧果炭疽病菌的菌丝生长的抑制作用。方法如下：离PDA平板中心3cm处，涂抹链霉菌TF78菌液，28℃培养 3d；然后将直径50mm的病原菌菌碟接种于PDA平板中心，25℃培养，以不涂链霉菌TF78菌液为对照。每个处理3个重复，待对照病原菌长满一皿时测量抑菌圈大小,计算抑菌率。香蕉枯萎病菌、柚木溃疡病菌、香蕉茎腐病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、黄瓜枯萎病菌、杧果拟茎点霉、杧果拟盘多毛孢、杧果葡萄座腔菌、杧果炭疽病菌的抑菌率分别为28.14％、 50.37％、26.66％、59.09％、45.49％、29.02％、68.15％、13.95％、72.59％、47.06％。
本发明的有益效果是：
1、健康香蕉根际土壤中筛选到一株对香蕉枯萎病有较强抑制作用的链霉菌，经形态学、生理生化特性和16S rDNA序列鉴定为米修链霉菌 (Streptomyces misionensis)。该菌为土壤习居菌，能在香蕉根际定殖。
2、该菌株可以产生抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长的挥发性物质——1， 4-二氯苯，可以作为一种生物型熏蒸剂来使用和推广。
3、该菌株可以产生非挥发性代谢物质抑制香蕉枯萎病菌的生长。
4、该菌株的固体制剂可降低香蕉枯萎病的严重度，盆栽的防治效果为72.35％。
5、该菌株对黄瓜枯萎病、番茄灰霉病、柚木溃疡病、香蕉真菌性茎腐病、稻瘟病、芒果拟茎点霉叶斑病、芒果拟盘多毛孢叶斑病、芒果葡萄座腔菌枝枯病、芒果炭疽病等病原菌均有抑制作用。
6、该菌株生产工艺简单。在PDA平板上28℃培养3d即可得到单菌落，将单菌落挑到ISP1液体培养基中28℃180rpm震荡培养4d得到种子液，将1％种子液接种到小麦固体培养基上培养10d后，干燥粉碎即可得到固体制剂。
附图说明
图1是TF78在PDA培养基上的菌落形态图。
图2是米修链霉菌麦粒培养物对香蕉枯萎病菌的抑菌活性。其中，图 A为测定挥发性气体抑菌活性的方法——两皿对扣法；图B中的麦粒没有接种米修链霉菌；图C中的麦粒接种了米修链霉菌。
图3是1,4-二氯苯抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长图，其中图A为不经过 1,4-二氯苯处理的香蕉枯萎病菌菌丝生长情况，B为经过100mg/L 1,4-二氯苯处理的香蕉枯萎病菌菌丝生长情况。
图4是TF78拮抗香蕉枯萎病菌的盆栽防治效果，其中图A为不接种 TF78的香蕉枯萎病发病图，图中植株叶子发黄枯萎；图B为接种TF78 的香蕉枯萎病发病图，图中植株叶子大多浓绿，没有枯萎。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：
实施例1链霉菌的分离
在广西南宁市武鸣县里建镇华侨投资区一健康香蕉园内，用干净的铲子随机取香蕉根际土壤放于干净的密封袋中。根际土壤样品放于28℃风干4 天。采用稀释土壤平板的方法分离放线菌。按1:9(v/w)比例，称取10g土壤样本放进90ml无菌的质量浓度0.85％NaCl溶液(同时将表面含土的根段放进烧瓶中)。土壤样本设三次重复。所有土壤悬浮液在摇床上25℃， 150rpm震荡30分钟，然后静止5分钟。用质量浓度0.85％NaCl溶液将上层的土壤悬浮液连续10倍梯度稀释，吸取稀释倍数为10-4、10-5的土壤悬浮液 200μl到S培养基琼脂平板，涂布棒涂匀，每个梯度3个重复。28℃黑暗培养 7天。将放线菌菌落挑取到ISP1培养基28℃，180rpm震荡培养4d，质量浓度25％甘油保存于-20℃。
实施例2链霉菌的属种鉴定
1.形态学鉴定
用插片法培养5、7、10天后观察：放线菌TF78的孢子丝呈2-5圈紧密螺旋形，孢子呈球形、长圆形，表面光滑或略带疣。放线菌TF78在 PDA培养基上前期是白色圆形菌落，后期菌落呈灰黄色(见图1)。
2、培养特征观察
将放线菌TF78接种在甘油天冬素琼脂培养基、无机盐淀粉琼脂培养基、酵母精麦芽精琼脂培养基、燕麦粉培养基上，观察形态特征，见表1。
表1 TF78在不同培养基上的培养特征
培养基 气生菌丝体 基质菌丝体 可溶性色素
甘油天冬素琼脂培养基 浅灰色 浅灰色 无
无机盐淀粉琼脂培养基 浅灰色 浅灰色 无
酵母精麦芽精琼脂培基 灰褐色 灰褐色 无
燕麦粉培养基 灰褐色 灰褐色 无
3、生理生化试验
3.1明胶液化
将菌种接种于明胶培养基中，于28℃培养，分别在第3、5、10、20、 30天观察基液化程度。在观察前先将菌种管放入冰箱半小时左右，如明胶凝成固体状态，说明不液化，如试管有液体出现，说明明胶已被液化。
3.2淀粉水解
将菌种接种在淀粉琼脂平板上，于28℃培养10天后，在菌落周围滴加碘液，如菌落周围呈现透明圈时，表示菌种产生淀粉酶，若菌落周围染成蓝色，不出现透明圈者，说明该菌株不产生淀粉酶。
3.3牛奶的凝固与胨化
将菌种接种在脱脂牛奶管中，于28℃培养，分别在第3、6、10、20、 30天各观察一次，如果牛奶形成凝块，为凝固现象，再继续培养，则凝块分解，则为胨化现象。
3.4硝酸盐还原
将菌种接种在硝酸盐还原培养液中，28℃培养7天和14天，分别测定硝酸盐还原的情况。测定时，培养液倒出1ml于干净试管中，分别加入硝酸盐还原试剂甲液和乙液各2滴，如呈红色反应，即为阳性。
3.5 H2S的产生
将菌种接在柴斯纳培养基上，培养7天后观察结果，如培养基产生黑色素。则表示菌种产生H2S。
3.6黑色素的产生
将菌种接在酪氨酸琼脂培养基上，培养4天后观察结果，如培养基产生黑色素。则表示菌种产黑色素。如表2所示。
表2 TF78生理生化测试
Figure BDA0001756245230000131
(“+”表示为阳性反应，“—”表示为阴性反应)
4、16SrDNA分子鉴定
4.1 DNA提取
(1)将纯培养物接种于5ml新鲜配制的灭菌高氏一号培养基，26-28℃恒温摇床培养5-7天。
(2)培养物全部转至10ml离心管中，6000r/min，室温离心5min收集菌体。弃上清，离心管倒置于干净的吸水纸上晾干残余的液体，加入 2.7mlDNA抽提Buffer，充分悬浮菌体后，加入20μl 10mg/ml的蛋白酶K，混匀，置恒温水浴摇床水平振荡，225r/min，37℃，30min。
(3)加入0.3ml20％SDS，轻轻颠倒几次混匀，置恒温水浴箱静置，65℃温浴2h。期间每隔15-20min上下颠倒几次混匀直至裂解完全后，于室温离心10min，6000r/min。
(4)将上清转至新的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(体积比24： 1)抽提10min。6000r/min，室温离心10min。
(5)重复步骤(4)两到三次。
(6)将上清转至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置1h后于14000r/min，室温离心20min收集粗DNA。
(7)沉淀的粗DNA用体积浓度70％冰乙醇轻轻涮洗，弃涮洗液后置干净工作台上晾干。加入100-200μl无菌超纯水。
4.2 PCR扩增
PCR反应体系：50μl反应体积含1×工作浓度的浓缩反应缓冲液，各 0.2mmol/L的dNTP混合物，0.5-1.0U/50μl Taq DNA聚合酶，1.5mmol/L氯化镁，1umol/L上游引物，1umol/L下游引物，102-103拷贝的模板，加无菌水将反应体积补足至50μl。设空白对照：空白对照中应含有除模板核酸外的所有组分。
PCR反应程序：预反应(94℃，5min)，30个循环(94℃，1min；56℃， 1min；72℃，2min)，延伸(72℃，7min)。
4.3凝胶电泳检测
制备一块琼脂糖凝胶(含GoldviewDNA染料5μl/100ml)，取扩增产物与 LoadingBuffer混合，点样，100V/cm电泳15min，于UVI凝胶成像***分析结果。
得到1488bp的16S rDNA片段，菌种TF78的16S rDNA测序序列如下： TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACA CATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAAC GGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCC TGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCGTCTTGGGCATCCTTGAT GGTGTAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTG AGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT ACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGAT GCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCT TTCAGCAGGGAAGAAGCGAGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGC CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCG TTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGT CGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGG GCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGT GAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTC TGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAG GATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGT GGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCC CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGC GAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATA GTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGC TCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT GTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCAT CATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACA ATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCT CAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGC TAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT GTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCG GTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGC GATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAACCA
5、放线菌TF78的属种鉴定结果
放线菌TF78的16S rDNA测序序列与Streptomyces misionensis(米修链霉菌)的同源性达100％，其形态特征及生理生化特性与Streptomyces misionensis(米修链霉菌)最相似。根据鉴定，该样品为Streptomyces misionensis(米修链霉菌)。
实施例3链霉菌的保藏
米修链霉菌(Streptomyces misionensis)TF78，于2017年10月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59 号楼5楼，保藏编号为GDMCCNO:60254。
实施例4链霉菌次生代谢物抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长
在9cm的PDA平板上，距离平板边缘3cm处接种链霉菌TF78，置于28℃培养箱培养3d。直径5mm的香蕉枯萎病菌4号生理小种(FOC4)新鲜菌饼接种在平板另一边，距离平板边缘3cm处，置于28℃培养箱培养。空白对照为不接种链霉菌TF78，待对照处理的FOC4生长菌落半径达约3cm时测量抑菌圈大小，按照公式(R1-R2)/R1*100％计算抑菌率。一个处理三个重复。抑制率为31.28％。
实施例5链霉菌产生挥发性气体抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长
1.TF78固体培养基培养：挑取TF78的单菌落放进ISP1培养基中28℃， 180r/min震荡培养4d，然后吸取1ml的菌液到100g小麦培养基中28℃培养 15d。
2.采用对扣法，将40gTF78的小麦固体培养物放于9cm培养皿中，将直径 7mm的FOC4新鲜菌饼接种于另一9cm的PDA平板中央，用封口膜将两培养皿对扣封口，25℃培养。以没有接种TF78的小麦培养基为对照。待对照中的FOC4菌落长至平板边缘时，测量处理(见图2)的FOC4的菌落直径，计算抑制率。抑菌率＝(R1-R2)/R1*100％。抑制率为81.93％。
实施例6链霉菌产生的挥发性抑菌气体成分分析
1.链霉菌TF78的培养
取TF78的单菌落放进ISP1培养基中28℃，180r/min震荡培养4d，然后吸取100μl的菌液到20g小麦培养基中28℃培养4d，然后28℃密封培养15 天。
2.TF78产生的挥发性气体成分鉴定
采用顶空固相微萃取方法，收集TF78产生的挥发性气体成分，通过气质联用仪定性分析成份。与不接种TF78菌液的小麦为空白对照。
2.1气体收集：通过隔垫***已活化好的SpME萃取头，推出纤维头，顶空吸附40min后，***GC-MS进样口解析5min。
2.2 GC/MS操作条件：DB-5MS石英毛细管柱(30m*.32mm*.25um)，升温程序：起始温度40℃，保持2min，以2℃/min速率升温至150℃，再以100℃ /min速率升温280℃，保持2min，汽化室温度280℃，不分流进样，进样量为1ul；载气为氦气，流速1ml/min。
2.3电子轰击离子源EI，电子能量70eV，溶剂延迟0min，离子源温度200℃，传输线温度250℃，全扫描质量范围M/z45-650.计算机自动谱库检索进行定性。
2.4 TF78产生的挥发性气体成分鉴定结果
在气质图谱上，保留时间为11.690的峰为主要的气体峰，是TF78主要的气体成分，经鉴定为1，4-二氯苯。1，4-二氯苯可以作为熏蒸型的化学农药。目前1，4-二氯苯为人工合成，用作家居防霉防虫剂和土壤熏蒸剂等。
实施例7 1，4-二氯苯抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长
在直径150mm的大培养皿中(体积约0.5L)放进4个直径60mm的小培养皿，其中三个小培养皿做成PDA平板，在PDA平板中央接入直径5mm的香蕉枯萎病菌菌饼，剩下的一个小皿中放进1，4-二氯苯固体，用封口膜封口，放进干燥密封缸里28℃培养5d。设置4个浓度，0mg/L、1mg/L、10mg/L、 100mg/L。每个浓度3个重复(一个大皿一个重复)。待处理0mg/L的菌落直径长至培养皿边缘时，测量处理(见图3)的菌落直径，计算抑菌率。1mg/L 的抑菌率为4.06％，10mg/L的抑菌率为65.70％，100mg/L的抑菌率为100％。
实施例8链霉菌固体制剂的制备
在PDA培养平板上划线、28℃培养4天，得到TF78的单菌落；挑取单菌落到ISP1液体培养基上28℃、180rpm震荡培养4天得到TF78的培养液，即种子液；吸取1ml种子液到150g小麦培养基上28℃固体培养10天，得到 TF78的固体培养物；固体培养物干燥、粉碎得到固体制剂。
实施例9链霉菌TF78降低香蕉枯萎病菌的发病率
将链霉菌TF78的固体制剂与含香蕉枯萎病菌土混合，密封1d后，接种香蕉组培苗，以不添加链霉菌TF78的固体制剂为对照。置于28℃培养50d，调查香蕉枯萎病发病率，处理和对照防治效果见图4，链霉菌的防效达到72.35％。
实施例10链霉菌抑制其他9种病害的病原菌生长
采用平板对峙法测定链霉菌TF78对香蕉枯萎病菌、柚木溃疡病菌、香蕉茎腐病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、黄瓜枯萎病菌、杧果拟茎点霉、杧果拟盘多毛孢、杧果葡萄座腔菌、杧果炭疽病菌的菌丝生长的抑制作用。方法如下：离PDA平板中心3cm处，涂抹链霉菌TF78菌液，28℃培养3d；然后将直径50mm的病原菌菌碟接种于PDA平板中心，25℃培养，以不涂链霉菌TF78菌液为对照。每个处理3个重复，待对照病原菌长满一皿时测量抑菌圈大小，计算抑菌率。链霉菌TF78对香蕉枯萎病菌、柚木溃疡病菌、香蕉茎腐病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、黄瓜枯萎病菌、杧果拟茎点霉、杧果拟盘多毛孢、杧果葡萄座腔菌、杧果炭疽病菌的抑菌率分别是28.14％、 50.37％、26.66％、59.09％、45.49％、29.02％、68.15％、13.95％、72.59％、 47.06％。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所
<120> 一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
tagagtttga tcctggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cttaacacat gcaagtcgaa 60
cgatgaagcc cttcggggtg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc 120
cctgcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatatgac cgtcttgggc 180
atccttgatg gtgtaaagct ccggcggtgc aggatgagcc cgcggcctat cagcttgttg 240
gtgaggtaat ggctcaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac 300
actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa 360
tgggcgaaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc 420
tctttcagca gggaagaagc gagagtgacg gtacctgcag aagaagcgcc ggctaactac 480
gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggcg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540
gagctcgtag gcggcttgtc acgtcggttg tgaaagcccg gggcttaacc ccgggtctgc 600
agtcgatacg ggcaggctag agttcggtag gggagatcgg aattcctggt gtagcggtga 660
aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg gcgaaggcgg atctctgggc cgatactgac 720
gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacggtgggc actaggtgtg ggcaacattc cacgttgtcc gtgccgcagc taacgcatta 840
agtgccccgc ctggggagta cggccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc 900
gcacaagcgg cggagcatgt ggcttaattc gacgcaacgc gaagaacctt accaaggctt 960
gacatacacc ggaaagcatt agagatagtg ccccccttgt ggtcggtgta caggtggtgc 1020
atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1080
ttgtcccgtg ttgccagcag gcccttgtgg tgctggggac tcacgggaga ccgccggggt 1140
caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca 1200
cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgataccgt gaggtggagc gaatctcaaa 1260
aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagtcgctag 1320
taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct 1440
gtcgaaggtg ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtaacca 1488

Claims (5)

1.一株产挥发性抑菌物质的链霉菌株，其特征在于，其命名为米修链霉菌Streptomyces misionensis TF78，2017年10月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:60254。
2.如权利要求1所述的链霉菌株，其特征在于，其产生的1，4-二氯苯强力抑制香蕉枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp cubense的生长。
3.如权利要求1所述的链霉菌株，其特征在于，对柚木溃疡病菌、香蕉茎腐病菌、稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、黄瓜枯萎病菌、杧果拟茎点霉、杧果拟盘多毛孢、杧果葡萄座腔菌以及杧果炭疽病菌的菌丝生长具有抑制作用。
4.如权利要求1所述的链霉菌株，其特征在于，包括：
步骤1：在PDA培养平板上划线，28℃培养4天，得到菌株TF78的单菌落；
步骤2：挑取单菌落到ISP1培养基上28℃、180rpm震荡培养4天得到菌株TF78的培养液，即种子液；
步骤3：吸取1ml种子液到150g小麦培养基上28℃固体培养10天，得到菌株TF78的固体培养物；
步骤4：固体培养物干燥、粉碎得到固体制剂。
5.如权利要求2所述的链霉菌株，其特征在于，包括：
步骤1：培养米修链霉菌株TF78；
取菌株TF78的单菌落放进ISP1培养基中28℃，180r/min震荡培养4d，然后吸取100μl的菌液到20g小麦培养基中28℃培养4d，然后28℃密封培养15 天；
步骤2：收集米修链霉菌株TF78产生的挥发性气体；
通过隔垫***已活化好的SpME萃取头，推出纤维头，顶空吸附40min后，***GC-MS进样口解析5min。
CN201810888400.9A 2018-08-07 2018-08-07 一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用 Active CN108977382B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810888400.9A CN108977382B (zh) 2018-08-07 2018-08-07 一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810888400.9A CN108977382B (zh) 2018-08-07 2018-08-07 一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108977382A CN108977382A (zh) 2018-12-11
CN108977382B true CN108977382B (zh) 2021-07-13

Family

ID=64555988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810888400.9A Active CN108977382B (zh) 2018-08-07 2018-08-07 一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108977382B (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110373344B (zh) * 2019-04-29 2022-07-29 广西科学院 鲤链霉菌及其应用
CN110029078B (zh) * 2019-05-31 2021-04-30 河南科技大学 具有防病杀虫双重作用的链霉菌及其应用、培养方法、生防菌剂
CN110301455B (zh) * 2019-07-05 2020-09-08 海南大学 阿孙链霉菌产生的挥发性物质在植物病害防治中的应用
CN110819561B (zh) * 2019-11-08 2021-06-11 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一株放线菌tl-007及其应用
CN112029691B (zh) * 2020-09-28 2023-03-10 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所 贝莱斯芽孢杆菌ym-11-c在防治芒果炭疽病中的应用
CN112760248B (zh) * 2020-12-30 2022-08-05 西南大学 一种可防治桃褐腐病的林肯链霉菌及其应用
CN113930355B (zh) * 2021-09-15 2023-03-28 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一株白蚁来源的生防链霉菌w7及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105062920A (zh) * 2015-08-07 2015-11-18 中国热带农业科学院海口实验站 一种多产色链霉菌菌株及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105062920A (zh) * 2015-08-07 2015-11-18 中国热带农业科学院海口实验站 一种多产色链霉菌菌株及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Growth promotion and disease suppression ability of a Streptomyces sp. CB-75 from banana rhizosphere soil.;Yufeng Chen et al.;《Front Microbiol》;20180117;第1-18页 *
海洋放线菌A3202的分离鉴定及其对柑橘采后病害的防效;鹿连明等;《植物保护学报》;20140630;第41卷(第3期);第330页表1，第332页第2栏第1段 *
黄赭色链霉菌固体菌剂的研制及其对小麦幼苗生长的影响;何文等;《生物技术通报》;20171231;第33卷(第12期);第119-124页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108977382A (zh) 2018-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108977382B (zh) 一株产挥发性抑菌物质的链霉菌及其应用
Myo et al. Evaluation of Bacillus velezensis NKG-2 for bio-control activities against fungal diseases and potential plant growth promotion
CN109749974B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用
CN113151062B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌ljbv19及其应用
CN105886428A (zh) 一株微白黄链霉菌及其在微生物肥料中的应用
CN107151641B (zh) 一株抑制水稻纹枯病菌的侧孢短芽孢杆菌及其应用
CA2984509A1 (en) Designed complex endophyte compositions and methods for improved plant traits
CN101525587B (zh) 一株链霉菌菌株及其应用
CN111575199B (zh) 一株铜绿假单胞菌jt86及其在防治菌核病中的应用
CN110452832B (zh) 一株耐酸性解淀粉芽孢杆菌Kc-5及其应用
CN109468243B (zh) 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
CN112266881A (zh) 一株解淀粉芽胞杆菌及其在防治苹果重茬障碍中的应用
CN110408578B (zh) 一株皱纹假单胞菌及其应用
CN107099484B (zh) 一株产酶溶杆菌及其应用
CN115261283A (zh) 一种蜡样芽孢杆菌及其在旱作马铃薯病害防控中的应用
CN105039168B (zh) 一株橘绿木霉及其用途
CN106540283A (zh) 一种防治番茄青枯病的土壤厌氧消毒法
CN114891670A (zh) 一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌ZJh及其应用
CN115181693A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN114214220A (zh) 一株苏云金芽孢杆菌及其在促进植物生长中的应用
CN112592856B (zh) 一种烟草赤星病拮抗放线菌菌株及其应用
CN107541468B (zh) 一种短密木霉、菌剂、方法及在降解咪唑乙烟酸的应用
KR101107331B1 (ko) 식물 병원균에 대하여 항균 활성을 갖는 신규한 스트렙토마이세스 아르젠테오루스 균주
Türkölmez et al. Clonostachys rosea Strain ST1140: An endophytic plant-growth-promoting fungus, and its potential use in seedbeds with wheat-grain substrate
CN117448192A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌xu183及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant