CN111568989B - 桂枝重楼血竭提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及桂枝重楼血竭提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用。针对目前子宫腺肌病的治疗尚且没有特效治疗药物，根治较为困难的现状，本发明目的在于从临床常用活血化瘀、疏肝理气的药物中筛选具有抗子宫腺肌病活性的提取物，有助于明确子宫腺肌病治疗机制，为临床子宫腺肌病治疗提供相应的药物。本发明研究分别提供了桂枝、重楼、血竭提取物及组合提取物，并且验证了上述提取物对子宫腺肌病异位病灶细胞具有抑制作用，进一步的，还提供了上述提取物抑制病灶组织的机制。本发明提供的桂枝、重楼、血竭提取物及组合提取物有望成为临床子宫腺肌病治疗的活性成分，对一线治疗药物的开发具有重要的意义。

Description

桂枝重楼血竭提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及桂枝重楼血竭提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

子宫腺肌病是子宫内膜腺体和间质侵入子宫肌层形成弥漫或局限性的病变，与子宫内膜异位症一样，属于妇科常见病和疑难病。子宫腺肌病多发生于30～50岁左右的经产妇，但也可见于年轻未生育的女性，这可能与各种宫腔操作手术增多有一定关系，其病因尚不完全明确。约15％的患者合并子宫内膜异位症，约50％合并子宫肌瘤。该疾病目前的治疗方法包括药物治疗及手术干预手段，但是治愈率低，临床治疗方案的选择，只能结合患者的年龄、症状及生育要求进行个体化选择。

子宫腺肌病属于中医学中的“痛经”、“癥瘕”、“***”、“***”等病范畴。血瘀是其公认的病理实质，瘀血阻滞是基本病机，依据中医用药理论采用活血化瘀、消癓的药物对子宫腺肌症进行治疗，具有良好的治疗效果。其中，桂枝温通经脉、助阳化气，为《伤寒杂病论》的经典名方桂枝茯苓方的君药，该方是治疗妇科下腹部包块即癓瘕的公认经典名方，桂枝能温通经脉，即是和营、通阳、行瘀；重楼清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊为化瘀止血功效的中成药宫血宁的唯一药物，且具有抗肿瘤作用；血竭色红入血分而活血定痛、化瘀止血，为治疗妇科疼痛和出血性疾病的常用要药，三味药物均为治疗以痛经、出血及下腹包块为特征的子宫腺肌病的常用组方药味。针对上述研究现状，发明人认为，针对上述中药开发相应的提取物制剂，有利于筛选药味中的有效部位，为临床开发子宫腺肌病治疗提供特效治疗药物，还有利于开发相应的制剂标准，规范临床用药。

发明内容

针对上述研究背景，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种桂枝提取物的制备方法，所述制备方法包括采用超临界流体萃取-水蒸气蒸馏制备桂枝总挥发油提取物，所述萃取夹带剂为乙酸乙酯。

本发明第二方面，提供第一方面所述桂枝提取物制备方法制备得到的桂枝提取物。

本发明第三方面，提供一种重楼提取物的制备方法，所述制备方法包括：提取重楼的醇提取，离心后获取所述醇提取物的沉淀部分。

本发明第四方面，提供第三方面所述重楼提取物制备方法制备得到的重楼提取物。

本发明第五方面，提供一种血竭提取物的制备方法，所述制备方法包括：采用酸醇超声提取-乙酸乙酯萃取得到萃取液，除去有机试剂后得到所述血竭提取物。

本发明第六方面，提供第五方面所述血竭提取物制备方法制备得到的血竭提取物。

本发明第七方面，提供第二方面所述桂枝提取物、第四方面所述重楼提取物或第六方面所述血竭提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用。

依据本发明研究结果，上述桂枝、重楼及血竭提取物单独使用时，能够直接抑制子宫腺肌病病灶细胞的活力，其IC₅₀值为17.73μg/ml。另外，所述桂枝提取物还能够有效抑制子宫腺肌病病灶细胞的迁移和侵袭能力，并且上述对细胞活力、迁移及侵袭的抑制作用随着药物浓度的升高而增强。依据该研究结构，采用桂枝提取物作为治疗活性成分有利于直接抑制病灶组织的生长、迁移和侵袭、以及病灶组织的扩展。

其中所述重楼提取物还能够下调子宫腺肌病病灶细胞中p-CFL1水平。这意味着重楼提取物很可能通过调控细胞骨架重排达到抑制细胞迁移和侵袭的作用，该研究结论还提供了重楼提取物作为CFL1磷酸化抑制剂的应用。

本发明第八方面，提供一种组合提取物，所述组合提取物包括第二方面所述桂枝提取物、第四方面所述重楼提取物及第六方面所述血竭提取物中的至少两种。

本发明第九方面，提供第八方面所述组合提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用。

依据本发明的研究结果，该桂枝、重楼及血竭的组合提取物能够抑制模型动物体内的NF-κB通道，并且抑制其下游MMP-2、TIMP-1等迁移和侵袭相关因子的表达；另外，该组合提取物还能够抑制病灶组织血管新生、诱导病灶细胞凋亡，从多种方面实现对子宫腺肌病的抑制作用。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明研究分别提供了桂枝、重楼、血竭提取物及组合提取物，并且验证了上述提取物对子宫腺肌病异位病灶细胞具有抑制作用，进一步的，还提供了上述提取物抑制病灶组织的机制。本发明提供的桂枝、重楼、血竭提取物及组合提取物制备方法简便易行，作为临床子宫腺肌病治疗的活性成分，有望实现全面的治疗效果，作为一线治疗药物的候选成分，对于临床治疗具有重要的意义。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1中桂枝提取物对子宫腺肌病病灶衍生细胞(AMDC)活力的影响；

其中，图1A为加入不同浓度桂枝提取物后AMDC细胞存活率折线图；

图1B为加入不同浓度桂枝提取物后AMDC细胞存活率直方图。

图2为实施例1中桂枝提取物抑制AMDC细胞的迁移能力；

其中，图2A为AMDC细胞划痕实验照片图；

图2B为加入不同浓度桂枝提取物后AMDC细胞迁移率直方图。

图3为实施例1中桂枝提取物抑制AMDC细胞的侵袭能力；

其中，图3A为transwell实验照片图；

图3B为transwell实验中侵袭到下室的AMDC细胞数量直方图。

图4为实施例2中所述重楼提取物对AMDC细胞活力的影响；

其中，图4A为加入不同浓度重楼提取物后AMDC细胞存活率折线图；

图4B为加入不同浓度重楼提取物后AMDC细胞存活率直方图。

图5为实施例2中所述重楼提取物抑制AMDC细胞的迁移能力；

其中，图5A为AMDC细胞划痕实验照片图；

图5B为加入不同浓度重楼提取物后AMDC细胞迁移率直方图。

图6为实施例2重楼提取物抑制AMDC细胞的侵袭能力；

其中，图6A为transwell实验照片图；

图6B为transwell实验中侵袭到下室的AMDC细胞数量直方图。

图7为实施例2中所述重楼提取物下调AMDC中p-CFL1水平。

图8为实施例3中所述血竭提取物对AMDC细胞活力的影响；

其中，图8A为加入不同浓度血竭提取物后AMDC细胞存活率折线图；

图8B为加入不同浓度血竭提取物后AMDC细胞存活率直方图。

图9为实施例3中所述血竭提取物抑制AMDC细胞的迁移能力；

其中，图9A为AMDC细胞划痕实验照片图；

图9B为加入不同浓度桂枝提取物后AMDC细胞迁移率直方图。

图10为实施例3中所述血竭提取物抑制AMDC细胞的侵袭能力；

其中，图10A为transwell实验照片图；

图10B为transwell实验中侵袭到下室的AMDC细胞数量直方图。

图11为实施例4中所述HE染色结果；

其中，图11A为空白组，图11B为模型组，图11C为给药组。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，针对目前子宫腺肌病病因尚不完全明确以及存在难治病例的现状，为了解决如上的技术问题，本发明提出了桂枝、重楼、血竭提取物及其组合在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用。

本发明第一方面，提供一种桂枝提取物的制备方法，所述制备方法包括采用超临界流体萃取-水蒸气蒸馏制备桂枝总挥发油提取物，所述萃取夹带剂为乙酸乙酯。

优选的，所述制备方法具体步骤如下：将桂枝置于萃取釜内，采用乙酸乙酯作为夹带剂，在通入CO₂条件下进行萃取得到萃取液；将所述萃取液置于挥发油提取器中通过水蒸气蒸馏法继续微沸提取，得到棕黄色挥发油，即所述桂枝提取物。

进一步优选的，所述桂枝经粗粉碎后进行提取；一方面有利于药材中的挥发油物质充分溶出，另一方面，粗粉有利于药材在装置中进行转移，方便处理。

进一步优选的，所述萃取温度为38～42℃。

进一步优选的，所述萃取压力为280～320bar。

进一步优选的，所述萃取时间为1.8～2.2h。

进一步优选的，所述CO₂流量为13～17ml/min。

进一步优选的，所述乙酸乙酯为0.22～0.28ml/min。

进一步优选的，所述微沸提取为0.8～1.2小时。

上述优选技术方案的一些具体实施方式中，所述桂枝提取物的制备方法如下：将桂枝粗粉置于萃取釜内，在萃取压力300bar，萃取温度40℃，动态萃取时间2h，CO₂流量15ml/min，夹带剂乙酸乙酯0.25ml/min，得到棕红色萃取液；将所述棕红色萃取液通过挥发油提取器按水蒸气蒸馏法微沸提取1小时，分取棕黄色挥发油，即为桂枝提取物。

本发明第二方面，提供第一方面所述桂枝提取物制备方法制备得到的桂枝提取物。

本发明第三方面，提供一种重楼提取物的制备方法，所述制备方法包括：制备重楼的醇提取物，离心后获取所述醇提取物的沉淀部分。

优选的，所述制备方法的具体步骤如下：

向重楼中加入醇溶液回流，合并醇提取液滤过并浓缩除醇；加水后冷藏静置一段时间再进行离心，获取沉淀部分即为重楼提取物。

进一步优选的，所述重楼经粉碎成最粗粉后再进行回流提取。

进一步优选的，所述醇溶液为乙醇溶液；更进一步的，为60～80％的乙醇溶液。

进一步优选的，所述醇提取液合并后浓缩至密度为1.0～1.2。所述减压浓缩的同时进行适当加热，以帮助除去提取液中的醇，本领域技术人员可以通过检测密度的方式进行快速判断是否已经将醇除尽。

进一步优选的，所述离心的转速为5000～7000r/min，离心时间为4～6min。

上述优选的技术方案的一些具体实施方式中，所述制备方法如下：将重楼粗粉加入其体积5～7倍量的乙醇溶液回流提取三次，每次1.5小时，合并提取液滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度约为1.10，加2倍量水搅匀，静置冷藏(2～10℃)6小时，离心取沉淀，并对沉淀减压干燥(65～70℃，-0.08Mpa)，粉碎得到所述重楼提取物。

本发明第四方面，提供第三方面所述重楼提取物制备方法制备得到的重楼提取物。

本发明第五方面，提供一种血竭提取物的制备方法，所述制备方法包括：采用酸醇超声提取-乙酸乙酯萃取得到萃取液，除去有机试剂后得到所述血竭提取物。

优选的，所述制备方法包括以下步骤：

向血竭中加入磷酸的乙醇溶液进行超声提取，合并超声提取液并减压浓缩除去有机试剂得到稠膏，加水搅匀所述稠膏并继续加入乙酸乙酯进行萃取，取乙酸乙酯部分进行减压浓缩除去有机溶剂得到所述血竭提取物。

进一步优选的，所述血竭粉碎成为细粉加入磷酸的乙醇溶液进行超声提取。

进一步优选的，所述磷酸的乙醇溶液浓度为2～4％。

在上述优选的技术方案一些具体实施方式中，所述制备方法如下：向血竭细粉中加入其体积4～6倍量的磷酸乙醇超声提取二次，每次1.0小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至稠膏，加2倍量水搅匀，加2倍量乙酸乙酯振摇萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收至近干，提取物减压干燥(45～50℃，-0.08Mpa)，粉碎，即得。

本发明第六方面，提供第五方面所述血竭提取物制备方法制备得到的血竭提取物。

本发明第七方面，提供第二方面所述桂枝提取物、第四方面所述重楼提取物或第六方面所述血竭提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物中包括所述桂枝提取物或重楼提取物或血竭提取物、药学上所必需的辅料，还包括其他具有抗子宫腺肌病活性的成分。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物由所述桂枝提取物或重楼提取物或血竭提取物、药学上所必需的辅料组成。

本发明第八方面，提供一种组合提取物，所述组合提取物包括第二方面所述桂枝提取物、第四方面所述重楼提取物及第六方面所述血竭提取物中的至少两种。

优选的，所述组合提取物为桂枝提取物、重楼提取物及血竭提取物的混合物。

进一步优选的，所述组合提取物的制备方法如下：将所述桂枝提取物采用环糊精包合，干燥后得到桂枝-环糊精包合物；将所述桂枝-环糊精包合物与重楼提取物、血竭提取物混均即可。

上述优选技术方案的一些具体实施方式中，所述桂枝-环糊精包合物、重楼提取物及血竭提取物的重量份数比为3～5:1:2。

本发明第九方面，提供第八方面所述组合提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物中包括所述组合提取物及药学上所必须的辅料。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物中，所述组合提取物作为NF-κB抑制剂。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物中，所述组合提取物作为病灶血管抑制剂。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物中，所述组合提取物作为TIMP-1激动剂。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物中，所述组合提取物作为MMP-2抑制剂。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物中，所述组合提取物作为BCL-2及TGF-β1的抑制剂剂。

优选的，所述子宫腺肌病治疗药物中，所述组合提取物作为BAX抑制剂。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案，以下实施例中所述试剂均为市售产品。

实施例1桂枝提取物的制备及对子宫腺肌病异位病灶细胞的干预作用

1、桂枝提取物的制备

采用超临界流体萃取-水蒸气蒸馏技术制备桂枝总挥发油提取物。具体工艺路线：取桂枝2kg，粗粉碎，置于10L萃取釜内，萃取压力300bar，萃取温度40℃，动态萃取时间2h，CO₂流量15ml/min，夹带剂乙酸乙酯0.25ml/min。取萃取所得浓郁香味棕红色的液体，置500ml圆底烧瓶中，用挥发油提取器按水蒸气蒸馏法微沸提取1小时，分取棕黄色挥发油(65ml)，即得桂枝总挥发油提取物。

2、桂枝提取物对子宫腺肌病异位病灶细胞的干预作用

(1)IC₅₀值的检测与不影响细胞活性的低药物浓度的筛选

用桂枝提取物处理AMDC细胞，进行IC₅₀值检测与不影响细胞活性的低药物浓度的筛选。经检测，桂枝提取物对应的IC₅₀值为17.73μg/ml(图1A)，8μg/ml及以下的药物浓度不影响AMDC细胞的细胞活力(图1B)。

(2)桂枝提取物抑制AMDC细胞的迁移能力

浓度梯度的桂枝提取物(RCVO，0μg/ml、4μg/ml和8μg/ml)处理AMDC，划痕实验检测RCVO对AMDC细胞迁移能力的影响，拍照结果表明随着药物浓度的升高，迁移到划痕区域的细胞数量减少(图2A)，统计结果表明RCVO能够显著抑制AMDC的迁移能力，并且具有剂量依赖效应(图2B)。

(3)桂枝提取物抑制AMDC细胞的侵袭能力

利用浓度梯度的桂枝提取物(0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml)处理AMDC细胞，transwell实验检测其对AMDC细胞侵袭能力的影响，拍照结果表明桂枝提取物能有效抑制侵袭到transwell小室下底面的细胞数量(图3A)，统计结果表明与对照组相比，AMDC细胞的侵袭能力受到桂枝提取物的显著抑制(图3B，P<0.001)。

实施例2重楼提取物的制备及对子宫腺肌病异位病灶细胞的干预作用

1、重楼提取物的制备方法

采用醇提水沉-高速离心技术制备重楼提取物。具体工艺路线为：取重楼2kg，粉碎成最粗粉，加6倍量70％乙醇回流提取三次，每次1.5小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度约为1.10(60℃)，加2倍量水搅匀，静置冷藏(2～10℃)6小时，离心(6000r/min,5min)，取沉淀，沉淀减压干燥(65～70℃，-0.08Mpa)，粉碎，即得。

2、重楼提取物对子宫腺肌病异位病灶细胞的干预作用

(1)IC₅₀值的检测与不影响细胞活性的低药物浓度的筛选

用重楼总提取物(PPE)处理AMDC细胞，进行IC₅₀值的检测与不影响细胞活性的低药物浓度的筛选。重楼提取物对应的IC₅₀值为47.58μg/ml(图4A)，10μg/ml及以下的药物浓度不影响AMDC细胞的细胞活力(图4B)。

(2)重楼提取物抑制AMDC细胞的迁移能力

用药物浓度为0μg/ml、10μg/ml的重楼总提取物对AMDC细胞进行处理，划痕实验检测细胞迁移能力。经检测，10μg/ml重楼总提取物能有效抑制AMDC细胞向划痕区域的迁移(图5A)，统计结果表明重楼提取物处理AMDC细胞24h和36h均能显著抑制细胞迁移率(图5B，P<0.05)。

(3)重楼提取物抑制AMDC细胞的侵袭能力

利用重楼提取物(0μg/ml、10μg/ml)处理AMDC细胞，transwell实验检测其对AMDC细胞侵袭能力的影响，拍照结果表明10μg/ml的重楼提取物能够有效抑制侵袭到transwell小室下底面的细胞数量(图6A)，统计结果表明与对照组相比，重楼提取物对AMDC的侵袭能力具有显著抑制效果(图6B，P<0.001)。

(4)重楼提取物下调AMDC中p-CFL1水平

用药物浓度为0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml的重楼总提取物处理AMDC细胞，WesternBlot检测细胞骨架调控相关CFL1的磷酸化水平。结果表明，10μg/ml、20μg/ml重楼总提取物能够下调AMDC细胞中p-CFL1蛋白的表达水平(图7)。这表明重楼提取物很可能通过调控细胞骨架重排抑制AMDC细胞的迁移和侵袭能力。

实施例3血竭提取物的制备及对子宫腺肌病异位病灶细胞的干预作用

1、血竭提取物的制备方法

采用酸醇超声提取-乙酸乙酯萃取技术制备血竭提取物。具体工艺路线为：取血竭0.5kg，粉碎成细粉，加5倍量3％磷酸乙醇超声提取二次，每次1.0小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至稠膏，加2倍量水搅匀，加2倍量乙酸乙酯振摇萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收至近干，提取物减压干燥(45～50℃，-0.08Mpa)，粉碎，即得。

2、血竭提取物对子宫腺肌病异位病灶细胞的干预作用

(1)IC₅₀值的检测与不影响细胞活性的低药物浓度的筛选

用浓度梯度的血竭提取物(SDE)处理AMDC细胞，CCK-8试剂盒检测IC₅₀值为69.62μg/ml(图8A)，低浓度的SDE处理AMDC，CCK-8试剂盒检测细胞活力，统计数据表明24μg/ml及以下的SDE浓度处理细胞不会影响其细胞活力，选取24μg/ml SDE作为后续侵袭和迁移实验的最高药物浓度(图8B)。

(2)血竭提取物抑制AMDC细胞的迁移能力

浓度梯度的SDE(0μg/ml、12μg/ml和24μg/ml)处理AMDC，划痕实验检测SDE对AMDC细胞迁移能力的影响，结果表明随着药物浓度的升高，迁移到划痕区域的细胞数量减少(图9A)，统计结果表明SDE能够显著抑制AMDC的迁移能力，并且具有剂量依赖效应(图9B)。

(3)血竭提取物抑制AMDC细胞的迁移能力

浓度梯度的SDE(0μg/ml、12μg/ml和24μg/ml)处理AMDC，transwell实验检测SDE对AMDC细胞侵袭能力的影响，拍照结果表明随着药物浓度的升高，侵袭到transwell小室下底面的细胞数量减少(图10A)，统计结果表明SDE能够显著抑制AMDC的侵袭能力，并且具有剂量依赖效应(图10B)。

实施例4桂枝重楼血竭提取物及对子宫腺肌病大鼠模型的干预作用

1、子宫腺肌病大鼠模型构建

(1)采用放置异体垂体造模法，将雌性大鼠麻醉、固定于手术台上，常规消毒下腹部及鼠尾近端三分之一处，使用自照明大鼠***窥器暴露并消毒宫颈口，将大鼠宫腔缓释***放置器的探针探入宫腔至适宜位置，从末端套入放置器套管，探入宫腔直至探针前端，抽离探针，无创建立宫腔通道；同时处死雄鼠，立即取出垂体并剪碎放置于套管壶腹口，用探针将其推入至套管前段1-2mm，使探针在套管口内外做2-4mm范围的活塞运动，并保持其与套管的相对位置，同时匀速撤离套管。所有动物造模结束后，肌肉注射青霉素800,000U/mL 1mL，连续三天，饲养3个月后取材。

(2)模型评价：异体雄鼠垂体子宫移植是诱发子宫腺肌病的有效方法，其原理是导致高泌乳素血症，故泌乳素(PRL)是检测造模成功率的关键指标之一。糖类抗原125(CA125)是子宫腺肌病常见指标。故选用以上二个指标来验证造模结果。模型成功标准：

①子宫大体观察可见颗粒状如小米粒大小结节；②HE染色可观察到肌层改变，或可见子宫内膜组织或腺体侵入基底层甚至肌层；③PRL水平升高、CA125水平升高。

检测结果：

表1大鼠子宫CA125、PRL的ELISA结果

注：单位：只；与空白组比较，^☆P＜0.05；

2、桂枝重楼血竭提取物给药及指标检测

(1)桂枝重楼血竭提取物制备：取桂枝提取物1份，加入4倍量β-环糊精和4倍量水，胶体磨包合25min，取所得包合物减压干燥(40～45℃，-0.09MPa),粉碎，得桂枝-β-环糊精包合提取物。取桂枝-β-环糊精包合提取物4份、重楼提取物1份、血竭提取物2份混合均匀，即得。

(2)指标检测选择：异位腺上皮细胞能通过NF-κB通道诱导***表达和分泌更多的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等迁移和侵袭调控因子；VEGF能引起内皮细胞内Rho活化并向膜内表面募集，引起F-肌动蛋白细胞骨架的重组，抑制VEGF诱导的内皮细胞迁移可减弱VEGF介导的血管新生。基质金属蛋白酶是一类蛋白水解酶，主要负责组织重塑与细胞外基质的降解，其中MMP-2、MMP-9过度表达可能是子宫内膜癌和具有相似的生物学行为(向基底膜浸润)的原因之一；金属蛋白酶组织抑制物是MMPs的天然组织抑制剂。综合考虑采用ELISA法对大鼠子宫组织中VEGF、NF-κB、TIMP-1、MMP-2、BCL-2、BAX、TGF-β1指标进行检测。

3、动物分组与给药方式

分空白组、模型组、灌胃给药组。灌胃给药剂量0.2g/kg，连续干预30天。

4、实验结果

(1)HE染色方法

A：正常形态子宫。B：肌层不连续，可见少量腺体侵入深内膜层及肌层，深内膜层可见纤维化病灶。C：肌层完整，可见少量腺体侵入深内膜层，可见少量纤维化病灶(图11)。

(2)VEGF、NF-κB检测结果

表2大鼠子宫VEGF、NF-κB的ELISA结果

注：单位：只；与空白组比较，^☆P＜0.05；与模型组比较，^★P＜0.05；

在VEGF及NF-κB表达方面，模型组较空白组升高，给药组均较模型组及空白组明显降低(P<0.05)，证明异体垂体子宫移植可促进大鼠体内VEGF、NF-κB的升高，可能与促进异位灶血管生成、激活NF-κB通路有关，给药组大鼠体内VEGF、NF-κB均较模型组与空白组降低，证明桂枝重楼血竭提取物对抑制病灶血管生成、抑制NF-κB均有一定疗效。

(3)TIMP-1、MMP-2检测结果

表3大鼠子宫TIMP-1、MMP-2的ELISA结果

注：单位：只；与空白组比较，^☆P＜0.05；与模型组比较，^★P＜0.05；

在TIMP-1表达方面，模型组较空白组降低，给药组均较模型组升高(P<0.05)，证明异体垂体子宫移植可抑制大鼠体内TIMP-1的生成。给药组大鼠体内TIMP-1较模型组升高，证明桂枝重楼血竭提取物对TIMP-1有上调作用。在MMP-2表达方面，模型组较空白组升高，给药组较模型组明显降低(P<0.05)，证明异体垂体子宫移植可促进大鼠体内MMP-2的升高，可能与激活NF-κB通路有关，给药组大鼠体内MMP-2均较模型组降低，证明桂枝重楼血竭提取物对抑制MMP-2、降低病灶侵袭有一定疗效。

(4)BCL-2、BAX、TGF-β1检测

表4大鼠子宫BCL-2、BAX、TGF-β1的ELISA结果

注：单位：只；与空白组比较，^☆P＜0.05；与模型组比较，^★P＜0.05；

在BCL-2及TGF-β1表达方面，模型组较空白组升高，给药组较模型组明显降低(P<0.05)，证明异体垂体子宫移植可促进大鼠体内BCL-2、TGF-β1的升高，桂枝重楼血竭提取物对抑制BCL-2、TGF-β1、抑制病灶局部细胞增殖、局部上皮化转化均有一定疗效。在BAX方面，模型组空白组降低，给药组较模型组升高(P<0.05)，证明垂体移植可抑制大鼠体内细胞凋亡过程，这与BCL-2水平变化所引起的最终效果一致，给药组大鼠体内BAX较模型组升高，证明桂枝重楼血竭提取物对细胞凋亡有促进作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (19)

1.一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述组合提取物为桂枝提取物、重楼提取物及血竭提取物的混合物；

所述组合提取物的制备方法为：将所述桂枝提取物采用环糊精包合，干燥后得到桂枝-环糊精包合物；将所述桂枝-环糊精包合物与重楼提取物、血竭提取物混均即可；所述桂枝-环糊精包合物、重楼提取物及血竭提取物的重量份数比为3~5:1:2；

所述桂枝提取物的制备方法为：将桂枝置于萃取釜内，采用乙酸乙酯作为夹带剂，在通入CO₂条件下进行萃取得到萃取液；将所述萃取液置于挥发油提取器中通过水蒸气蒸馏法继续微沸提取，得到棕黄色挥发油，即所述桂枝提取物；

所述重楼提取物的制备方法为：向重楼中加入醇溶液回流，合并醇提取液滤过并浓缩除醇；加水后冷藏静置一段时间再进行离心，获取沉淀部分即为重楼提取物，所述醇溶液为乙醇溶液；

所述血竭提取物的制备方法为：向血竭中加入磷酸的乙醇溶液进行超声提取，合并超声提取液并减压浓缩除去有机试剂得到稠膏，加水搅匀所述稠膏并继续加入乙酸乙酯进行萃取，取乙酸乙酯部分进行减压浓缩除去有机溶剂得到所述血竭提取物。

2.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述桂枝提取物的制备方法中，所述桂枝经粗粉碎后进行提取。

3.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述桂枝提取物的制备方法中，所述萃取温度为38~42℃。

4.根据权利要求1或3所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述桂枝提取物的制备方法中，所述萃取压力为280~320bar。

5.根据权利要求1或3所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述桂枝提取物的制备方法中，所述萃取时间为1.8~2.2h。

6.根据权利要求1或3所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述桂枝提取物的制备方法中，所述CO₂流量为13~17ml/min。

7.根据权利要求1或2所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述桂枝提取物的制备方法中，所述乙酸乙酯流量为0.22~0.28ml/min。

8.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述桂枝提取物的制备方法中，所述微沸提取为0.8~1.2小时。

9.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述桂枝提取物的制备方法如下：将桂枝粗粉置于萃取釜内，在萃取压力300bar，萃取温度40℃，动态萃取时间2h，CO₂流量15ml/min，夹带剂乙酸乙酯流量0.25ml/min，得到棕红色萃取液；将所述棕红色萃取液通过挥发油提取器按水蒸气蒸馏法微沸提取1小时，分取棕黄色挥发油，即为桂枝提取物。

10.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述重楼提取物的制备方法中，重楼经粉碎成最粗粉后再进行回流提取。

11.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述重楼提取物的制备方法中，所述醇溶液为60~80%的乙醇溶液。

12.根据权利要求1或11所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述重楼提取物的制备方法中，所述醇提取液合并后浓缩至密度为1.0~1.2。

13.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述重楼提取物的制备方法中，所述离心的转速为5000~7000 r/min，离心时间为4~6min。

14.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述重楼提取物的制备方法如下：将重楼粗粉加入其体积5~7倍量的乙醇溶液回流提取三次，每次1.5小时，合并提取液滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.10，加2倍量水搅匀，静置冷藏6小时，离心取沉淀，并对沉淀减压干燥，粉碎得到所述重楼提取物。

15.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述血竭提取物的制备方法中，所述血竭粉碎成为细粉加入磷酸的乙醇溶液进行超声提取。

16.根据权利要求1或15所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述血竭提取物的制备方法中，所述磷酸的乙醇溶液浓度为2~4%。

17.根据权利要求1所述的一种用于子宫腺肌病治疗的组合提取物，其特征在于，所述血竭提取物的制备方法如下：向血竭细粉中加入其体积4~6倍量的磷酸乙醇超声提取二次，每次1.0小时，合并提取液，滤过，滤液减压回收乙醇至稠膏，加2倍量水搅匀，加2倍量乙酸乙酯振摇萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收至近干，提取物减压干燥，粉碎，即得。

18.权利要求1-17任一项所述组合提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用。

19.如权利要求18所述组合提取物在制备子宫腺肌病治疗药物中的应用，其特征在于，所述子宫腺肌病治疗药物中包括所述组合提取物及药学上所必须的辅料。

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