CN111557908B - 一种能增敏nk细胞的组合物及应用 - Google Patents

一种能增敏nk细胞的组合物及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111557908B
CN111557908B CN202010355631.0A CN202010355631A CN111557908B CN 111557908 B CN111557908 B CN 111557908B CN 202010355631 A CN202010355631 A CN 202010355631A CN 111557908 B CN111557908 B CN 111557908B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
tgf
selenocysteine
beta inhibitor
nms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010355631.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111557908A (zh
Inventor
陈填烽
刘畅
李晓玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN202010355631.0A priority Critical patent/CN111557908B/zh
Publication of CN111557908A publication Critical patent/CN111557908A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111557908B publication Critical patent/CN111557908B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了一种能增敏NK细胞的组合物及应用。该组合物包括硒代胱氨酸和TGF‑β抑制剂。硒代胱氨酸和TGF‑β抑制剂具有协同增敏NK细胞的效果，可将该组合物制备得到增敏NK细胞药物。将该组合物制备得到的纳米乳一方面有效地增加了SeC的溶解度和稳定性，另一方面纳米化后的体系能够增强肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达，解除肿瘤微环境中的免疫抑制作用，有效地促进了NK细胞对转移性的MDA‑MB‑231细胞的免疫杀伤效果。

Description

一种能增敏NK细胞的组合物及应用
技术领域
本发明涉及一种组合物，特别涉及一种能增敏NK细胞的组合物及应用。
背景技术
近年来，癌症免疫治疗为癌症的治疗提供了一个重要的突破。激发体内固有免疫***消除肿瘤的策略以及通过免疫调节剂(如抗PD-1/PDL-1抗体和CTLA-4疗法)增强免疫反应的策略已被证明可以提高许多种类型癌症的治疗效果。然而，这些方法大多集中在工程肿瘤疫苗或外源性抗原的传递上，由于肿瘤微环境的免疫抑制，如抗原提呈细胞的非活化、调节性T细胞的过度激活、免疫抑制细胞因子诱导的CD8+T/NK细胞功能障碍以及肿瘤细胞中 HLA表达的丧失，这些方法都是高度可变和有限的。此外，免疫检查点抑制剂还被发现诱导非特异性免疫***激活，并导致严重的副作用。因此，仍然需要新的有效策略来克服这些限制，以实现有效的肿瘤消融。
目前，过继细胞治疗已被证实具有克服肿瘤治疗瓶颈的能力。自然杀伤(naturalkiller， NK)细胞是最重要的天然免疫细胞之一，具有不受主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibility Complex，MHC)限制、抗原非依赖性、不易诱发移植物抗宿主病(GVHD)等特点。越来越多的临床证据表明，活化的NK细胞与乳腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤和结直肠癌的发病率呈现负相关。NK细胞输注已被认为是治疗转移性乳腺癌的一种有吸引力的替代疗法之一。特别是，随着急性髓系白血病治疗的令人鼓舞的临床研究，NK细胞过继治疗已被披露为一种有吸引力的免疫治疗方法，可替代疫苗免疫治疗和免疫检查点阻断治疗。然而，NK细胞的免疫逃逸在很大程度上影响了NK细胞的治疗效果，这是由于肿瘤细胞上NK 激活的配体表达水平降低所致。因此，研究提高NK细胞免疫功能的联合策略引起了人们极大的兴趣。作为同种异体NK细胞，NK92细胞是唯一进入临床试验的NK细胞系，在欧美的晚期恶性黑色素瘤和肾癌患者中，NK92细胞被证实没有严重的血流动力学毒性和明显的组织副作用，提示NK92细胞可能是过继细胞免疫治疗的一个很好的候选细胞。目前，一系列的化疗药物，包括抗代谢药物，烷基化药物，蛋白酶体抑制剂和金属配合物，被发现通过上调NK细胞激活受体的刺激配体来增强NK细胞转移的杀伤能力。这些结果表明，过继免疫治疗与化疗相结合是一种很有前途的癌症治疗方法。除了化学免疫治疗的疗效外，这些药物中的大多数被发现对输注的免疫细胞具有细胞毒性，这抑制了免疫治疗的潜力。
因此，一种能一方面激活NK细胞，又能够解除肿瘤微环境中的免疫抑制作用，且毒性低的药物仍然是人们的研究热点。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种组合物。
本发明的另一目的在于提供通过上述组合物的应用。
本发明的在一目的在于提供一种载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳及其应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种组合物，包括硒代胱氨酸(SeC)和TGF-β抑制剂。
所述的TGF-β抑制剂优选为SB505124。
所述的硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂优选按质量比8～12：0.335配比；更优选按10：0.335 配比。
所述的组合物在制备增敏NK细胞药物中的应用。
所述的增敏NK细胞药物优选为纳米乳化剂。
一种载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳，含有上述组合物。
所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳，还包括乳化剂、助乳化剂、油剂和水。
所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳优选包括如下按质量份数计的成分：乳化剂1500～2500份、油剂2000～3000份、助乳化剂2000～3000份、硒代胱氨酸8～12份、 TGF-β抑制剂0.335份、水8000～12000份；更优选包括如下按质量份数计的成分：乳化剂 2000份、助乳化剂2400份、油剂2400份、硒代胱氨酸10份、TGF-β抑制剂0.335份、水10000份。
所述的乳化剂优选为泊洛沙姆、吐温、司盘和聚氧乙烯硬脂酸酯中的至少一种。
所述的泊洛沙姆优选为泊洛沙姆188和泊洛沙姆407中的至少一种。
所述的吐温优选为吐温80和吐温60中的至少一种。
所述的司盘优选为司盘80。
所述的助乳化剂优选为碳链长度为C1～C4的醇；更优选为乙醇、乙二醇、甘油和丙二醇中的至少一种；最优选为无水乙醇。
所述的油剂优选为植物油；更优选为橄榄油、大豆油和玉米油中的至少一种。
所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳的制备方法，包括如下步骤：
(1)将乳化剂、助乳化剂、油剂、硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂混合均匀；
(2)搅拌状态下加入水，得到初乳；
(3)将初乳均质，得到载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳。
步骤(1)中所述的混合优选为通过搅拌混合。
所述的搅拌的速度优选为500～700rpm；更优选为600rpm。
所述的均匀指的是体系呈均一相。
步骤(2)中所述的加入的方式优选为滴加。
步骤(2)中所述的搅拌的条件优选为20～40min；更优选为30min。
步骤(3)中所述的均质的步骤优选如下：首先在均质压力200～300Bar，均质2～4min，出样频率为40Hz；再于1000～1500Bar的条件下均质15～25min，出样频率为40Hz；更优选如下：首先在均质压力250Bar，均质3min，出样频率为40Hz；再于1200Bar的条件下均质20min，出样频率为40Hz。
所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳的粒径大小在100～150nm。
所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳在制备用于***的药物中的应用。
一种用于***的药物，包括NK细胞和上述载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳。
所述的肿瘤优选为乳腺癌、***癌、肺癌、肝癌、胃癌和黑色素瘤。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的组合物，对增敏NK细胞具有协同作用。
(2)本发明提供的纳米乳一方面有效地增加了SeC的溶解度和稳定性，另一方面纳米化后的体系能够增强肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达，解除肿瘤微环境中的免疫抑制作用，有效地促进了NK细胞对转移性的MDA-MB-231细胞的免疫杀伤效果。
附图说明
图1是SSB NMs纳米体系的表征图；其中，A为空白纳米乳的电镜图；B为激光粒度仪测得的空白纳米乳的粒径分布图；C为SSB NMs的电镜图；D为激光粒度仪测得的SSB NMs 的粒径分布图；E为纳米体系的Zeta电位图；F为原子力显微镜测得的SSB NMs的三维高度分布图。
图2是纳米体系的拉曼光谱图。
图3是SSB NMs的稳定性检测结果图；其中，A为SSB NMs在50％人血清及含有10％FBS的DMEM培养基中的稳定性检测结果；B为SSB NMs在去离子水及PBS中的稳定性检测结果。
图4是不同化合物的细胞毒性检测结果图；其中，A为含硒化合物SeMet、SeC、Na2SeO3及SeC NMs对肿瘤细胞MDA-MB-231细胞的毒性结果；B为含硒化合物SeMet、SeC、Na2SeO3及SeC NMs对NK92细胞的毒性结果；C为含硒化合物SeMet、SeC、Na2SeO3及SeC NMs、SSB NMs对人源T细胞的毒性结果；D为含硒化合物SeMet、SeC、Na2SeO3及SeC NMs 增强NK92杀伤MDA-MB-231细胞的活力结果。
图5是SSB NMs增强NK92细胞的杀伤能力的试验结果图；其中，A为不同浓度的SSBNMs对NK92细胞的毒性结果图；B为SSB NMs与NK92细胞同时加入MDA-MB-231细胞后MDA-MB-231细胞的存活率结果图；C为SSB NMs预处理肿瘤细胞12h后，再加入不同比例的NK92细胞和MDA-MB-231细胞的存活率结果图；D为SSB NMs预处理NK92细胞，再处理MDA-MB-231细胞，MDA-MB-231细胞的存活率结果图；E为SSB NMs预处理肿瘤细胞不同的时间后再加入NK92细胞，MDA-MB-231细胞的存活率结果图。
图6是病人来源的NK细胞的流式图；其中，A空白对照组(未染色)；B为CD3-FITC 和CD56-APC双染组。
图7是SSB NMs增强来源于病人NK细胞杀伤能力的评价结果图；其中，A为SSB NMs增强来自7个病人的NK细胞(E:T＝5:1)治疗效果的增强倍数；B为SSB NMs增强来自7 个病人的NK细胞(E:T＝10:1)治疗效果的增强倍数；C为SSB NMs联合病人来源的NK 细胞(E:T＝5:1)治疗MDA-MB-231细胞的细胞存活率；D为SSB NMs联合同一个病人不同比例的NK细胞治疗MDA-MB-231细胞的细胞存活率。
图8是Annexin V-PI检测由SeC、SeC+SB、SeC NMs及SSB NMs联合NK92细胞(E:T ＝5:1)诱导的MDA-MB-231细胞凋亡和坏死结果图。
图9是SSB NMs增强NK92细胞体内免疫治疗活性的检测结果图；其中，A为SSB NMs和NK92细胞给药方案示意图；B为荷瘤鼠肿瘤体积的变化图；C为给药结束后肿瘤的重量； D为肿瘤部位Se的浓度；E为荷瘤鼠治疗期间体重的变化；F为H&E染色考察肿瘤部位细胞坏死情况；G为荷瘤鼠肝功、肾功、心功等指标的考察。
图10是荷瘤鼠治疗效果图；其中，A为肿瘤的照片；B为肿瘤抑制率。
图11是肿瘤组织的免疫组化分析结果图；其中，A为肿瘤部位Ki67和CD34蛋白的表达结果；B为肿瘤部位cleaved-caspase-3、smad7、p-smad2/3和IFN-γ蛋白的表达结果；C为肿瘤部位Ki67、CD34、cleaved-caspase-3、smad7、p-smad2/3和IFN-γ蛋白阳性表达率半定量的结果。
图12是荷瘤鼠的肝功、肾功、心功及血糖血脂的血液分析结果图。
图13是主要脏器的H&E染色分析结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用的材料都是市购得到。
硒代胱氨酸(SeC)Sigma-Aldrich、SB505124Sigma-Aldrich、***钠(Na2SeO3)希恩思化学、硒代蛋氨酸(SeMet)Sigma-Aldrich、泊洛沙姆188(P188)Sigma-Aldrich。
实施例1载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳的制备
1、制备
称取2.0g泊洛沙姆188、2.4g橄榄油、2.4g无水乙醇、10mg SeC于烧杯中，再加入已配好的SB505124的储液(10mM)100μL，于室温下600rpm搅拌至体系呈均一相，然后逐滴滴入10mL去离子水，并继续搅拌30min，制得初乳。随后，将制备好的初乳转移至高压均质机中均质逐级均质：首先在均质压力250Bar，均质3min，出样频率为40Hz；再进行高压均质，即均质压力为1200Bar的条件下均质20min，出样频率为40Hz，均质结束后收集样品。在制备过程中不加SeC与SB505124，其他方法完全相同，得到空白纳米乳。
2、检测
1)纳米乳形态的表征
将制备得到的样品稀释一定的程度，用激光粒度仪测定其水合粒径与Zeta电位。将样品滴于铜网后，用2％(w/v)的磷钨酸负染，通过透射电镜(TEM)观察纳米乳的形貌与粒度大小。将样品充分稀释后，滴于铜网中，用原子力显微镜(AFM)纳米乳的高度。并采用高分辨拉曼光谱仪对纳米乳体系中的各成分进行分析。
检测结果如图1和2所示：经过2％磷钨酸负染的电镜图可以看出，空白纳米乳(图1A) 与SSB NMs(图1C)表面完整，呈现圆形，粒径分布均一，且粒径大小均在130nm左右。从激光粒度仪测得的空白纳米乳(图1B)与SSB NMs(图1D)的粒径分布可以看出，纳米乳的粒度分布均匀，水合粒度约为160nm，PDI约为0.12。从图1E结果可以看出，空白纳米乳与SSBNMs均带负电。且当加入SeC与SB505124后，纳米乳的电位的绝对值略有增大。另外，从原子力显微镜观察到，SSB NMs的高度约为3.6nm。泊洛沙姆P188、SeC、NMs、 SeC NMs和SSB NMs的拉曼光谱图如2所示，在253cm-1处，SeC、SeC NMs和SSB NMs都出现了Se-Se键的特征峰，说明SeC存在于SeC NMs和SSB NMs中。另外，泊洛沙姆P188 在855cm-1处有糖苷键的特征峰，而NMs、SeC NMs和SSB NMs在此处也出现其特征峰。最后，在1560cm-1处为苯环的特征峰，SSBNMs在此处有这个峰而其他纳米乳中均不存在，说明SB505124存在于SSB NMs中。以上结果表明，SSB NMs成功构建。
2)稳定性分析
将制备得到的样品稀释一定的浓度，分别分散于50％的人血清、含有10％FBS的DMEM 培养基、PBS及去离子水中。采用马尔文激光粒度仪于0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h测定在四种介质中的稳定性。并考察了纳米粒子在H2O及PBS中的长期稳定性。
结果如图3所示，SSB NMs在人血清和DMEM培养基中72h内的粒径基本无变化，说明SSB NMs在两种介质中都能保持较好的稳定性，因此也表明SSB NMs在体外细胞环境及机体循环过程中也能够保持较好的稳定性，从而有利于其在作用部位的效果发挥；SSB NMs在H2O 中及PBS中4周内粒径都无显著性变化，PDI也基本不变，说明SSB NMs在体外环境下较长时间内也可以稳定存在。以上结果表明，SSB NMs在体内外环境下都具有良好的稳定性，对于 SSB NMs的应用具有重要的意义。
实施例2筛选模型药物试验
从肿瘤病人提取得到的NK细胞及T细胞：从广东某三甲医院肿瘤病人志愿者外周血取50mL外周血，并用Ficoll密度梯度法提取外周血单核细胞(PBMC)；将细胞悬浮在新鲜的 ALYS505NK-AC培养基中，调整密度为2×106个细胞/mL，于细胞培养箱中培养一天；然后在细胞培养液中加入1000U/mL的重组人白细胞介素-2(rhIL-2)和10％的自体血浆，继续孵育一天；第3天加入新鲜ALYS505NK-EX培养基30mL，加入1000U/mL rhIL-2和rhIL-5，孵育两天；第五天加入60mL新鲜ALYS505NK-EX培养液，加1000U/mL的rhIL-2，继续孵育2d；培养第7～14d，根据培养液颜色变化，加入含1000U/mL rhIL-2的ALYS505NK-EX双份新鲜无血清培养基；第14天用CD3-FITC和CD56-APC双染，流式细胞仪(CytoFLEXS，Beckman Coulter)检测，鉴定NK细胞的纯度，96％的细胞都呈现CD3-CD56+，说明病人来源的细胞基本全部为NK细胞。
从广东某三甲医院肿瘤病人志愿者外周血取50mL外周血，并用Ficoll密度梯度法提取外周血单核细胞(PBMC)，用ALYS505NK-AC培养三天后，用流式细胞仪分选出CD3+T细胞为总的T细胞。
人三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，人自然杀伤细胞(NK92)购自于美国ATCC细胞资源中心。MDA-MB-231细胞用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和50U/mL链霉素的DMEM 培养基于37℃恒温培养箱培养；NK92细胞用含有12.5％胎牛血清、12.5％灭活马血清、200 U/mL hIL-2、0.2mM肌醇、0.1mMβ-巯基乙醇、0.02mM叶酸的MEM培养基于37℃恒温培养箱培养(5％CO2)。
MTT法检测细胞的存活率：
(1)药物对MDA-MB-231的毒性：取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以4×103个/ 孔接种于96孔板中，于细胞培养箱中培养24h贴壁后，分别加入100μL不同种类及不同浓度的药物(Na2SeO3、SeMet、SeC、SeC NMs、SSB NMs；其中，Na2SeO3和SeMet用PBS 溶解，SeC用0.1MHCl溶解，配制成药物储液，使用时用DMEM稀释到需要的浓度，以下的实施例对药物的处理同此处)，每组设三个复孔，并设空白对照组。细胞与药物共孵育72h 后，每孔加入20μL的MTT储液(5mg/mL)，继续于细胞培养箱中孵育4h后，弃去上清，并向每孔中加入150μL的DMSO，充分溶解生成的甲臜后，用酶标仪检测570nm处的吸光度值。并根据如下公式计算细胞存活率：
相对于对照的细胞存活率(％)＝(Ai-Ab)/(A0-Ab)*100％(1)
其中，Ai表示加入药物组的吸光度值，Ab表示空白对照组的吸光度值，A0表示未加药物处理细胞组的吸光度值。
(2)药物联合NK细胞的细胞存活率：取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以4×103个/孔接种于96孔板中，于细胞培养箱中培养24h贴壁后，分别加入100μL不同种类及不同浓度的药物(Na2SeO3、SeMet、SeC、SeC NMs、SSB NMs)，每组设三个复孔，并设空白对照组。药物与MDA-MB-231细胞共同孵育12h后，加入不同数量的NK细胞(效应细胞：肿瘤细胞(E：T)＝20：1、10：1、5：1和2.5：1)处理8h后，吸取上清中的NK细胞，并用PBS洗三次。然后再加入含有0.5mg/mL MTT的培养基，继续于培养箱中孵育4h，最后弃去上清，每孔加入150μL的DMSO，充分溶解生成的甲臜后，用酶标仪检测570nm处的吸光度值，并根据公式(1)计算细胞存活率。
(3)药物对NK细胞及T细胞的毒性：NK细胞或T细胞以1×105个/孔接种于96孔板中，同时加入100μl不同种类及不同浓度的药物。药物与NK细胞或T细胞共同孵育24h后，每孔加入20μL CCK8，继续于培养箱中孵育4h后，用酶标仪检测450nm处的吸光度，并根据公式(1)计算细胞存活率。
(4)检测结果：如图4A和图4B所示，即使在高浓度下，SeMet对MDA-MB-231细胞和NK92细胞都基本没有毒性，说明SeMet虽然对NK没有毒性，但是对MDA-MB-231细胞也无杀伤作用，因此SeMet没有被选择用于进一步的研究；对于Na2SeO3来说，随着其浓度的增加，其对MDA-MB-231细胞的毒性显著增强，在浓度为16μM时会引起46.25％的细胞死亡，但是，其对NK92细胞也同样具有较强的杀伤作用，在浓度为16μM时会引起48.11％的细胞死亡，说明Na2SeO3对正常细胞与肿瘤细胞的杀伤没有选择性，因此Na2SeO3也没有被选作模型药物。SeC溶液对MDA-MB-231细胞和NK92细胞的毒性都比较大，在浓度为 16μM时的两种细胞的存活率分别为46.17％和52.86％，但是由于其在水中的溶解性非常差，严重限制了其应用；但是当将SeC采用高压均质法制备成纳米乳(SeC NMs)后，从结果可以看出，相比游离的SeC溶液，SeC NMs对MDA-MB-231细胞的毒性基本不变，在硒的浓度为16μM时，MDA-MB-231的存活率为73.72％。但是对NK92细胞，SeC NMs基本没有毒性，说明将SeC纳米化后能够显著增强体系的选择性，从而降低药物的毒副作用。从图4C 中可以看出，在硒的浓度在32μM以内，这几种药物对T细胞都基本没有毒性。从图4D结果可以看出，在8μM的硒浓度下，SeMet、Na2SeO3、SeC和SeC NMs分别对癌细胞的预处理12h后，加入NK92细胞(E:T＝5:1)，药物预处理肿瘤细胞增强了NK92细胞的杀伤能力，例如，与单独的NK92细胞的活性相比，SeC NMs预处理肿瘤细胞能够显著增强NK92细胞杀伤能力(增强了1.38倍)。类似地，SeC和Na2SeO3诱导的杀伤倍数分别为0.93和0.52。然而，用SeMet预处理肿瘤细胞在此剂量下对NK92细胞介导的杀伤几乎没有作用。
实施例3SSB NMs刺激NK92的研究
(1)SSB NMs和NK92联合作用的方式与NK92细胞加入的比例设置如下：
第1组：不同浓度的SSB NMs预孵育不同比例的NK92细胞12h后，两者再同时加入到MDA-MB-231细胞中；药物的浓度分别为1μM、4μM、8μM、16μM和32μM，药物的加入量是100μl/孔。肿瘤细胞按铺板时候的数量算，铺板时的量为4×103个/孔(96孔板)。效应细胞：肿瘤细胞(E:T)的比例分别为2.5：1、5：1、10：1和20：1。
第2组：不同浓度的SSB NMs预处理MDA-MB-231细胞12h后，再加入不同比例的NK92细胞；药物的浓度和效应细胞：肿瘤细胞的比例设置同第1组。
第3组：不同浓度的SSB NMs与不同比例的NK92细胞同时加入MDA-MB-231细胞中；药物的浓度和效应细胞：肿瘤细胞的比例设置同第1组。
当NK92细胞加入12h后，吸去上清并用PBS清洗后，每孔加入200μL含有0.5mg/mLMTT的培养基，考察MDA-MB-231细胞的存活率。
结果如图5A～D所示，由MDA-MB-231细胞的存活率可以看出，当SSB NMs预处理肿瘤细胞后，再加入NK92细胞，杀伤肿瘤细胞的效果最好；当E：T＝5：1时，SSB NMs的浓度为8μM时，SSB NMs预先孵育NK92细胞组的MDA-MB-231细胞的存活率为68.52％， SSB NMs与NK92细胞同时给予MDA-MB-231细胞组肿瘤细胞的存活率为74.11％，而SSB NMs预先孵育肿瘤细胞，再加入NK92细胞治疗组的细胞存活率为58.72％，显著低于另外两种作用方式。因此，我们选择先用SSB NMs预处理肿瘤细胞，再给予NK92细胞作用的方式进行后续实验。
(2)将8μM SSB NMs预先处理肿瘤细胞不同的时间(肿瘤细胞按铺板时候的数量算，铺板时的量为4×103个/孔)，再与NK92细胞(E:T＝5:1)联合作用进行试验。结果如图5E所示，随着SSB NMs预孵育时间的延长，联合治疗的效果也呈现逐步增强的效果。例如，预孵育9h后加入NK92细胞，比单独NK92细胞的效果增强了1.58倍，而预孵育12h和24h 分别增强了2.05与2.09倍。预孵育12h与24h的效果无显著性差异，因此最终选择以SSB NMs 预孵育12h，再加入NK92细胞处理12h的处理方式进行后续的实验。
实施例4SSB NMs增强来源于病人的NK细胞的免疫杀伤效果
(1)按实施例2步骤获得来源于不同病人的NK细胞，通过流式细胞仪检测，结果如图 6所示，96％的细胞都呈现CD3-CD56+，说明病人来源的细胞基本全部为NK细胞。
(2)以不同浓度的SSB NMs预孵育MDA-MB-231 12h，再加入NK92细胞处理12h 的处理方式进行试验，其中，E：T的比例分别设置为2.5：1、5：1、10：1、20：1。从图7 的结果可以看出，预孵育不同浓度的SSB NMs(1～32μM Se)分别提高了0.94～13.8和0.2～ 30.6倍。由图7D可知，来源不同的病人的NK细胞单独作用MDA-MB-231细胞都具有一定的杀伤能力，但杀伤能力也存在较大区别，MDA-MB-231的细胞存活率在64.88％～97.77％。而经过SSB NMs预孵育肿瘤细胞，尤其是药物浓度比较高的时候，能够较大程度地增强NK 细胞的杀伤能力。并且，从E:T＝2.5:1到E:T＝20:1，SSB NMs都能在一定程度上增强NK细胞的杀伤能力。
综上可知，单独的NK细胞能在一定程度上杀伤MDA-MB-231细胞，而SSB NMs预孵育MDA-MB-231细胞使其致敏后，能够显著增强NK细胞的杀伤作用，说明SSB NMs可以显著增强NK细胞的抗肿瘤活性。
实施例5Annexin V-iFluor 488/PI双染实验检测细胞凋亡
取对数期生长的MDA-MB-231细胞，以1×105个/mL的密度接种于10cm细胞培养皿中，于细胞培养箱中培养24h贴壁后，分别加入SeC+SB、SeC NMs、SSB NMs孵育12h后，需要NK细胞处理的组别再加入一定数量的NK细胞(E:T＝5:1)作用8h。用不含有EDTA 的0.25％的胰酶消化细胞，用PBS清洗两次，2000rpm离心5min，弃去上清，收集5×105个细胞。加入500μL的结合缓冲液(Binding buffer，Annexin V-iFluor 488/PI试剂盒里，品牌是Roche)重悬细胞，加入5μL Annexin V-iFluor 488混匀后，再加入5μL PI混匀，室温下避光反应20min。孵育后将样本置于冰上，用流式细胞仪检测。
结果如图8所示，单独的药物较少引起细胞的凋亡或坏死，SSB NMs也仅引起了5.4％的细胞凋亡或坏死；而单独的NK细胞可以一定程度上引起细胞的死亡，从结果可以看出，单独的NK细胞作用肿瘤细胞，可以引起13.4％的细胞死亡。当SeC、SeC+SB、SeC NMs及SSB NMs预处理后再给予NK细胞后，引起的MDA-MB-231凋亡和坏死由13.4％分别上升至17％、23.8％、29.8％和36.2％。综上所述，SSB NMs预孵育肿瘤细胞能够使肿瘤细胞致敏，显著增强NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。
实施例6体内抗肿瘤活性及安全性评价
(1)荷瘤裸鼠模型的建立
取对数生长期的MDA-MB-231细胞，消化，离心后，用PBS重悬并调整细胞密度为2×107个细胞/mL，然后将100μL细胞悬液注射于雌性BALB/c-nude裸鼠(北京维通利华生物科技有限公司)右侧腋窝下部位。待肿瘤生长至约50mm3时开始实验。
(2)实验分组与给药
将荷瘤裸鼠随机分成6组，每组8只。给药组别设置为：1)生理盐水组；2)NK组；3)SeC+SB溶液组；4)SSB NMs组；5)SeC+SB溶液联合NK92细胞组；6)SSB NMs联合NK92细胞组。所有组别都以尾静脉注射的方式给药，给药剂量按SeC计算为2mg/kg，NK92 细胞每次注射1×106个细胞/只。每隔两天注射一次药物，每隔四天注射一次NK92细胞。隔天用游标卡尺测量并记录各个肿瘤的体积并称量裸鼠的体重，根据公式V＝(a×b2)/2计算肿瘤体积(其中a为肿瘤的长，b为肿瘤的宽)。于实验第24天时，结束实验。采用眼球取血的方式收集裸鼠的血液，3000rpm条件下离心收集血清置于-20℃备用。采集血液后将裸鼠安乐死，收集肿瘤及主要脏器心、肝、脾、肺、肾等组织。称量肿瘤记录重量，并按照组别拍照。收集的组织一部分以4％多聚甲醛固定后留作后续研究或直接置于-80℃备用。过程如图9A所示。
(3)血液生化指标的测定
将分离得到的血清送至暨南大学附属第一医院检验科，分别检测肝功、肾功、心功及血糖，血脂等指标，对药物的安全性进行评估。
(4)组织病理学检测
H&E染色：其染色原理为苏木素为碱性染料，与细胞核中的脱氧核糖核酸的酸性组分结合后，细胞核被染成蓝紫色；伊红为酸性染料，与细胞质中的碱性组分结合后，细胞质被染成粉红色。将切片置于二甲苯溶液(I，II)中各20min脱蜡，然后依次置于100％～70％的乙醇溶液中依次水化，然后用PBS洗三次，每次5min，然后将苏木素溶液滴在组织部位浸染5min后，用自来水清洗，再用伊红溶液浸染2min后，用自来水清洗。然后与水化相反的步骤依次脱水后，用中性树脂封片，在显微镜下观察。
DAB染色实验方法：首先将切片的组织充分水化，水化后的组织用3％的H2O2室温孵育 10min，然后用PBS清洗3次，每次5min，再将切片置于抗原修复液中，并置于微波炉中加热进行抗原修复。待切片自然冷却后，用PBS清洗3次×5min。将切片周围的水渍擦干，用5％BSA溶液室温封闭30min后，将封闭液甩去，滴加稀释好的一抗置于4℃反应14h。将切片置于室温中恢复至室温后，用PBS清洗3次×5min。甩干后，滴加二抗，室温孵育10 min后，用PBS清洗3次×5min。滴加适量的显色剂DAB，通过显微镜观察染色，着色后水洗终止反应，再滴加苏木素，约3min后用PBS洗净，然后再盐酸乙醇中分化再用PBS反蓝。最后脱水后用中性树胶封片，并用显微镜拍照，用ImageJ软件分析阳性着色面积。拍照后并用ImageJ软件对阳性面积进行统计分析。
(5)肿瘤部位Se浓度的检测
精确称取一定重量的肿瘤组织(约0.1g)于烧杯中，加入4mL混酸(硝酸：高氯酸＝3: 1)置于通风橱中冷消化过夜。次日，在加热板上180℃下消化至液体剩余1～2mL，烧杯中有白雾出现。取下烧杯冷却至室温，再加入4mL 50％的HCl(v/v)溶液，并消化至烧杯中液体剩余1～2mL，烧杯中有白雾出现。取下烧杯冷却至室温，收集液体至离心管中，并用 10％的盐酸清洗烧杯并定容至10mL。用原子荧光光谱仪检测硒的浓度。
(6)数据统计
上述所述实验至少重复三次，所得的数据均以平均值±标准差表示。实验数据组间比较用SPSS 25统计学软件采用ANOVA方差分析，两组之间用双尾t-检验方法，以P<0.05表示有显著性差异。
(7)结果：
结果如图9B和9C所示，单独给予NK92细胞具有一定的抗肿瘤能力，与空白对照组相比，能够显著地抑制肿瘤的生长，在实验结束时，肿瘤的体积从1913.8±117.5mm3下降至1661.9 ±99.8mm3，平均肿瘤抑制率为30.5％±7.7％(图10B)。单独给予荷瘤鼠SeC+SB溶液，与对照组相比肿瘤的平均抑制率为35.7％±4.4％，与单独给予NK92细胞的抗肿瘤效果无显著性差异。而单独给予荷瘤鼠SSB NMs，与对照组相比其平均抑瘤率为47.0％±4.9％，显著地高于 SeC+SB溶液和NK92细胞组。而当荷瘤鼠先尾静脉给予SeC+SB或SSB NMs两次后，再给予 NK92细胞，结果如图9B、9C和图10B所示，小鼠的肿瘤生长进一步得到了抑制。SeC+SB +NK92组在实验结束时肿瘤体积为828.5±118.9mm3，与空白对照组相比抑瘤率为60.3％± 5.7％。SSB NMs联合NK92细胞治疗组的效果最为显著，在实验结束时小鼠的肿瘤体积为569.8 ±94.8mm3，与空白对照组相比抑瘤率为78.2％±5.3％。实验结束后各组小鼠的肿瘤的重量(图 9C)和图片(图10A)也同样说明当荷瘤鼠先用SeC+SB或SSB NMs致敏后，再联合NK92 细胞治疗效果最好，尤其是SSB NMs联合NK92细胞组。从以上结果可以看出，单独SSB NMs 治疗效果好于SeC+SB组，且SSB NMs+NK92细胞组效果好于SeC+SB+NK92细胞组，其原因可能是SSB NMs能够把更多的药物带到肿瘤部位，因此，我们又检测了肿瘤组织部位的SeC 的含量，由图9D可以看出，SSB NMs+NK92和SSB NMs组的硒的含量显著高于其他组别，说明将药物纳米化后，通过被动运输与肿瘤部位的EPR效应，药物更多的被带到肿瘤部位。另外，在治疗过程中，如图9E所示，荷瘤小鼠的体重基本没有变化，也说明该给药体系对小鼠的生存没有显著的毒副作用。由图9F可以看出，给予生理盐水的对照组表现出明显的肿瘤的病理特征，癌细胞呈片状密集分布，粉红色胞浆较少，核异型性明显。当给予单独的NK92 细胞，肿瘤组织的病理特征与生理盐水组基本一致，没有出现明显的细胞核皱缩。而给予单独的药物时，肿瘤组织出现一定程度的细胞核皱缩，粉色的胞浆面积增加，且SSB NMs治疗组细胞核皱缩强度强于SeC+SB治疗组，表现为更小的细胞核面积。更近一步地，当SeC+SB和 SSB NMs联合NK92细胞治疗时，其效果显著强于单独的药物治疗组和单独的NK92细胞组。 SeC+SB+NK92细胞治疗组粉色的胞浆面积比SSB NMs治疗组进一步增大，出现大量的细胞间隙，具有更强的核皱缩的效果。SSB NMs+NK92细胞治疗组的肿瘤组织表现出最强的作用，其诱导细胞核皱缩，粉色的胞浆面积最大，导致的细胞间隙的大量出现及扩大。这一结果进一步证实了SSB NMs+NK92细胞能够有效地抑制肿瘤的生长。
肿瘤的发展和转移会伴随着细胞增殖和大量血管的生成，因此采用免疫组化的方法首先检测了肿瘤组织中血管生成的标志性蛋白CD34和有丝***与细胞增殖的相关蛋白Ki67的表达。结果如图11A和图11C所示，仅用生理盐水处理组的CD34和Ki67的表达都比较高，单独的 NK92细胞、SeC+SB和SSB NMs都能在一定程度上抑制CD34和Ki67的表达，当SeC+SB、 SSB NMs和NK92细胞联合治疗时，CD34和Ki67的表达更进一步的降低。因此，SSB NMs和NK92细胞联合治疗的方法能够有效抑制肿瘤部位血管的生成，并能降低肿瘤部位细胞的增殖。接着，我们又检测了与细胞凋亡相关的蛋白Cleaved-caspase 3的表达，Cleaved-caspase 3 蛋白的高表达能够促进细胞的凋亡。从图11B和图11C可知，SeC+SB和SSB NMs联合NK92 细胞治疗能够显著增强肿瘤组织中Cleaved-caspase 3的表达，尤其是SSB NMs+NK92细胞联合治疗组，Cleaved-caspase 3的表达最多，说明SSB NMs联合NK92细胞能够显著增强肿瘤细胞的凋亡。为了考察SSB NMs对肿瘤部位TGF-β相关的蛋白表达的影响，我们又检测了肿瘤部位的Smad 7蛋白和p-Smad 2/3蛋白的表达。从图11B和图11C可以看出，给予SeC+SB溶液与SSB NMs都能显著地增强Smad 7蛋白的表达并显著降低p-Smad 2/3蛋白的表达。SeC+SB 溶液与SSB NMs与NK92细胞联合治疗后Smad 7蛋白的表达会进一步上升，p-Smad 2/3蛋白的表达会进一步下降。以上结果说明SSB NMs能够有效地抑制肿瘤微环境中TGF-β的作用，解除肿瘤部位的免疫抑制效果。最后，我们又考察了NK92细胞在肿瘤部位分泌IFN-γ的情况。由图11B和图11C可知，与空白对照组相比，单独的NK92细胞治疗的肿瘤组织中的IFN-γ的表达增加，但是表达量很低，说明单独的NK92仅有少部分到达肿瘤组织部位发挥作用。当 NK92细胞与SeC+SB溶液与SSB NMs联合治疗后，IFN-γ的表达量又更进一步地增加，说明 SeC+SB溶液与SSB NMs都能显著增强NK92细胞的杀伤能力，尤其是与SSBNMs联用的组别，IFN-γ的表达量最高。总之，SSB NMs联合NK92细胞治疗能够显著抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤部位血管的生成，促进细胞的凋亡，用显著地抑制了肿瘤部位TGF-β的作用，解除肿瘤细胞的免疫抑制作用，增强NK92细胞的杀伤作用。
为了评价SSB NMs联合NK92细胞治疗体系的毒副作用，在实验结束后取各实验组小鼠的血清和主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，分别对血清的生化指标和各脏器HE染色进行分析。血清分析结果如图9G和图12所示，SSB NMs联合NK92细胞处理组可以有效的缓解裸鼠体内异种移植肿瘤引起的病变，表现在血液指标向着接近正常裸鼠改变，尤其是血清白蛋白(ALB)，谷丙转氨酶(ALT)，乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶同工酶(CKMB)，肌酐(CREA) 和血糖(GLU)等。HE染色的结果也没有显示出明显的损伤(图13)，所有的治疗组心肌HE 染色都呈粉红色，胞浆、胞核及组织结构清晰；心肌纵切面肌纤维细长呈圆柱形，分支并互相连成网。所有治疗组的肝脏细胞形态完整，细胞核大小均一。所有治疗组的脾脏组织与对照组相比也无明显变化；所有治疗组肺部组织的细胞与对照组比无明显的变化，未出现炎症和出血现象；所有组别的肾脏组织形态完整，肾小球肾小管等均未出现明显的异常。以上结果显示所有的治疗体系对主要脏器均无明显的毒副作用。综上所述，SSB NMs联合NK92细胞治疗体系作为安全有效的体系用于MDA-MB-231细胞的治疗具有可行性和潜在的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳，其特征在于：由硒代胱氨酸、TGF-β抑制剂、乳化剂、助乳化剂、油剂和水组成；
所述的TGF-β抑制剂为SB505124；
所述的硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂按质量比8～12：0.335配比。
2.根据权利要求1所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳，其特征在于：所述的硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂按质量比10：0.335配比。
3.根据权利要求1所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳，其特征在于由如下按质量份数计的成分组成：乳化剂1500～2500份、油剂2000～3000份、助乳化剂2000～3000份、硒代胱氨酸8～12份、TGF-β抑制剂0.335份、水8000～12000份。
4.根据权利要求3所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳，其特征在于由如下按质量份数计的成分组成：乳化剂2000份、助乳化剂2400份、油剂2400份、硒代胱氨酸10份、TGF-β抑制剂0.335份、水10000份。
5.根据权利要求1～4任一项所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳，其特征在于：
所述的乳化剂为泊洛沙姆、吐温、司盘和聚氧乙烯硬脂酸酯中的至少一种；
所述的助乳化剂为碳链长度为C1～C4的醇；
所述的油剂为植物油。
6.权利要求1～5任一项所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将乳化剂、助乳化剂、油剂、硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂混合均匀；
(2)接着加入水，搅拌得到初乳；
(3)将初乳均质，得到载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳。
7.根据权利要求6所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的混合为通过搅拌混合；
步骤(2)中所述的加入的方式为滴加；
步骤(3)中所述的均质的步骤如下：首先在均质压力200～300Bar，均质2～4min，出样频率为40Hz；再于1000～1500Bar的条件下均质15～25min，出样频率为30～40Hz。
8.权利要求1～5任一项所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳在制备增敏NK细胞药物中的应用。
9.权利要求1～5任一项所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳在制备用于***的药物中的应用。
10.一种用于***的药物，其特征在于：包括NK细胞和权利要求1～5任一项所述的载硒代胱氨酸和TGF-β抑制剂的纳米乳。
11.根据权利要求10所述的用于***的药物，其特征在于：所述的肿瘤为乳腺癌、***癌、肺癌、肝癌、胃癌和黑色素瘤。
CN202010355631.0A 2020-04-29 2020-04-29 一种能增敏nk细胞的组合物及应用 Active CN111557908B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010355631.0A CN111557908B (zh) 2020-04-29 2020-04-29 一种能增敏nk细胞的组合物及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010355631.0A CN111557908B (zh) 2020-04-29 2020-04-29 一种能增敏nk细胞的组合物及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111557908A CN111557908A (zh) 2020-08-21
CN111557908B true CN111557908B (zh) 2022-04-29

Family

ID=72073237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010355631.0A Active CN111557908B (zh) 2020-04-29 2020-04-29 一种能增敏nk细胞的组合物及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111557908B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114177194A (zh) * 2021-11-13 2022-03-15 广东暨创硒源纳米研究院有限公司 功能化纳米硒联合二甲双胍制备的nk细胞增敏剂及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014153230A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 The Regents Of The University Of California In vitro production of medial ganglionic eminence precursor cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Activin A Signaling Regulates IL13Rα2 Expression to Promote Breast Cancer Metastasis;Maria Kalli;《Frontiers in Oncology》;20190205;第1-12页 *
Selenocystine Induces S-Phase Arrest and Apoptosis in Human Breast Adenocarcinoma MCF-7 Cells by Modulating ERK and Akt Phosphorylation;Tianfeng Chen;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;20081029;第10574–10581页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111557908A (zh) 2020-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113613673A (zh) 用于治疗胰腺癌的药物组合物
EP3842529A1 (en) Exosome-based antitumor vaccine
Wang et al. A Microenvironment Dual‐Responsive Nano‐Drug Equipped with PD‐L1 Blocking Peptide Triggers Immunogenic Pyroptosis for Prostate Cancer Self‐Synergistic Immunotherapy
JP2002511870A (ja) 活性化骨髄性樹状細胞表現型の誘導
CN114558146B (zh) 一种荷载中药自组装胶束的“免疫外泌体”纳米粒及其制备方法和应用
CN111557908B (zh) 一种能增敏nk细胞的组合物及应用
KR20150139529A (ko) 활성 자가조직 면역 요법을 위한 고순도 난소암 줄기세포
JP2016540770A (ja) 新生物の処置方法
KR20200135936A (ko) 전립선 암 특이적 골수 침윤성 림프구 및 이의 용도
CN106943432A (zh) 一种脐带间充质干细胞来源的外泌体及其在制备治疗肝癌药物中的应用
JP2002523332A (ja) 移植片対宿主病の阻止
Haruna et al. Docetaxel upregulates HMGB1 levels in non-small cell lung cancer
Liu et al. Norcantharidin liposome emulsion hybrid delivery system enhances PD-1/PD-L1 immunotherapy by agonizing the non-canonical NF-κB pathway
Yu et al. Boosting B Cell and Macrophage‐Mediated Humoral Immunity with Fusion Nanovesicles for Triple‐Negative Breast Cancer Combined Therapy
Ding et al. Photosensitive small extracellular vesicles regulate the immune microenvironment of triple negative breast cancer
CN113577064B (zh) 一种增强肿瘤免疫的联合用药物组合物及其应用
Zhang et al. Cholesterol Metabolism Modulation Nanoplatform Improves Photo‐Immunotherapeutic Effect in Oral Squamous Cell Carcinoma
Law et al. World’s first myoblast treatment of human cancer found safe and efficacious
EP3058957A1 (en) Improved photodynamic process and product obtained therefrom
Zang et al. Immunogenic dead cells engineered by the sequential treatment of ultraviolet irradiation/cryo-shocking for lung-targeting delivery and tumor vaccination
Huang et al. Midostaurin (PKC412) modulates differentiation and maturation of human myeloid dendritic cells
JP2021516052A (ja) 胸腺組織に由来する制御性ｔ細胞を入手する方法および免疫系障害における細胞免疫療法としての前記細胞の使用
CN114259469B (zh) 一种能够逆转肿瘤相关免疫衰老的唾液酸协助递送药物组合物及其制备方法和应用
Bukovsky Novel Immunological Aspects for the Treatment of Age‐induced Ovarian and Testicular Infertility, Other Functional Diseases, and Early and Advanced Cancer Immunotherapy
Su et al. Effects of dendritic cells from cord blood CD34+ cells on human hepatocarcinoma cell line BEL-7402 in vitro and in SCID mice

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant