CN111549100A

CN111549100A - 一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用

Info

Publication number: CN111549100A
Application number: CN202010415369.4A
Authority: CN
Inventors: 查克·特里里; 何露·德杰比; 周大明; ***·巴里; 孔祥东; 石彪; 田荣; 王德强
Original assignee: Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology of CAS
Current assignee: Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology of CAS
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明涉及一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用，属于分子探针技术领域。本发明提供了一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针，能在保持样本中初始miRNA数量不变的前提下实现检测信号的线性放大。由于该探针在检测过程中无需进行PCR，避免了非特异性扩增，从而提高了检测的特异性。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。

Description

一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用

技术领域

本发明属于分子探针技术领域，具体涉及一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用。

背景技术

癌症也叫恶性肿瘤，具有增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征。它可以破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终可能由于器官功能衰竭而死亡。目前，肺癌仍然是最具威胁生命的疾病，由于其发病率和死亡率的居高不下，在世界范围内越来越普遍。根据国家癌症中心发布的统计数据，2015年我国新发肺癌患者例数为78.7万，约占癌症新患病例的20％。更糟糕的是，未来几十年，肺癌新增病例数量预计将翻一番，这会给国家社保***、医疗***和家庭生活带来重大负担。

虽然近几十年来在诊治方面做了很多努力，但肺癌的预后仍然很差，肺癌在5年内生存率低于15％。这主要是由于肺癌诊断时间常在晚期，治疗性手术不再作为选择。因为肺癌在初期的发展非常隐蔽，主要表现为：呼吸短促、咳嗽和体重下降等症状，常常也属于着肺炎症状，故肺癌确诊是一个难点。传统的肺癌的早期检测技术包括胸部X线摄影、低剂量计算机断层扫描(LDCT)和肺活检。然而，这些技术在肺癌的早期检测中存在一些局限性，包括高假阳性率、侵袭性、潜在的过度诊断、过高的成本或辐射诱发的癌症。另一方面，标准免疫测定法(如ELISA、RIA、IF等)已成为检测LC生物标志物的成熟技术，但耗时、成本高，只能在集中的实验室中进行。此外，这些免疫测定法大多为单重测定法，对检测疾病早期低浓度的生物标志物不够敏感。所以需要开发一种灵敏度高的早期肺癌检测技术。

近年来，许多科学家提出了通过标志物来诊断肺癌，其中对miRNA的研究较多。miRNA是一种非编码RNA，一般是18-25个碱基长度。研究表明，人类约30％的基因受到miRNA的调控，miRNA的表达水平与人类多种疾病的发生密切相关。传统定量检测miRNA的方法主要包括Northern blotting、原位杂交、微阵列法、滚环扩增和反转录聚合酶链反应等。这些方法大体可以归为无需样本扩增的探针直接杂交法和基于样本miRNAs扩增的检测方法。它们各有优缺点：不经过扩增的方法操作简便，但对样本量需求较大，且灵敏度较低；而基于扩增的方法灵敏度较高，但其受限于无法直接检测miRNAs水平和非特异性扩增。其原因在于miRNAs的序列很短，这些扩增手段及相应的探针设计都需要非常精细和复杂的设计。传统PCR技术大都通过检查其前体而进行间接判断，

因此，现有的诊断方法并不能反映真实的miRNAs水平，并且，miRNAs在体液中的表达量远低于其在组织中的表达，因此常规检测组织中miRNAs的技术并不一定适用于体液miRNAs的检测，需要讲究新的能够增强检测信号的探针以及方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法；本发明的目的之二在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针；本发明的目的之三在于提供一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针在检测miRNA方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

(1)制备DNA探针：根据待测的miRNA分子序列合成与所述miRNA分子配对的DNA探针，所述DNA探针的一端修饰荧光基团，另一端修饰生物素；

(2)偶联培育：将所述DNA探针预热后与链霉亲和素磁珠(SMBs)悬浊液混合，在30-40℃条件下培育；

(3)清洗：首先将培育后的混合物用NaOH溶液清洗除去非特异性结合或游离的DNA探针，然后用TT缓冲液重复清洗，再次将DNA探针加入到TT缓冲液中进行重悬后在80℃下培育，除去液体以去除结合不稳定的偶联分子，最后用DEPC水清洗即可得到一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针。

优选的，步骤(1)中，所述miRNA分子包括肿瘤疾病或病毒传染性疾病的疾病标志物miRNA。

优选的，步骤(2)中，所述链霉亲和素磁珠悬浊液按照如下方法制备：

将超顺磁性微球与链霉亲和素通过共价结合形成链霉亲和素磁珠(SMBs)，在室温条件下，用IBM缓冲液清洗并用永久磁铁固定链霉亲和素磁珠后滤掉上层清液，再分散到固定清洗缓冲液(B&W buffer)中即可。

优选的，步骤(2)中，所述DNA探针与链霉亲和素磁珠在混合过程中按照每20pmolDNA与40μg MBs链霉亲和素磁珠混合的比例进行。

优选的，步骤(2)中，所述预热为在70～85℃下预热5～30min；所述培育时间为10min以上。

优选的，步骤(3)中，所述NaOH溶液的浓度为0.15M；所述TT缓冲液按照如下方法配制：向pH＝8.0的250mM的Tris-HCl缓冲液中加入0.1％的

20混合而成。

2.由上述构建方法构建得到的磁性微球DNA探针。

3.上述磁性微球DNA探针在检测miRNA分子方面的应用。

优选的，所述miRNA分子为肺癌标志物miRNA时，按照如下方法进行检测：首先向所述磁性微球DNA探针中加入所述miRNA、DSN和RNase抑制剂，在热循环仪中反应；然后用磁铁固定磁珠后提取上层清液，测试上清液的荧光强度，从荧光强度得到所述miRNA的浓度。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供了一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法，该方法简单，容易操作，通过该方法能够将两端分别修饰有荧光基团和生物素的DNA探针固定在顺磁性的微球上，使其中的生物素与链霉亲和素更好地偶联形成磁性微球DNA探针，能够针对性检测miRNA分子；

2、本发明提供了一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针，能在保持样本中初始miRNA数量不变的前提下实现检测信号的线性放大。由于该探针在检测过程中无需进行PCR，避免了非特异性扩增，从而提高了检测的特异性。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为待检测miRNA与磁性微球DNA探针杂化成双联、以及DSN酶切反应释放荧光基团的过程；

图2为本发明构建的磁性微球DNA探针对待检测miRNA检测流程；

图3为实施例1中四种不同结构的探针对肺癌标志物miRNA-21的荧光测试结果；

图4为实施例1中制备的含有P1的磁性微球DNA探针对不同待测分子的荧光检测结果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1

1、制备DNA探针：

根据肺癌标志物miRNA-21的分子序列(SEQ ID NO：1)，合成与该序列配对但带有不同修饰分子的4种DNA探针P1、P2、P3和P4，具体结构如表1所示。

表1 修饰不同基团的DNA探针

探针分子	序列(从5’到3’端)	修饰
			P1(SEQ ID NO：2)	TC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TA	5’cy3,3’biotin TEG
P2(SEQ ID NO：3)	TC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TA	5’cy3,3’biotin(T)
			P3(SEQ ID NO：4)	TC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TA	5’cy3,3’biotin
P4(SEQ ID NO：5)	TC AAC ATC AGT CTG ATA AGC TA	5’biotin TEG,3’cy3

2、制备磁性微球DNA探针：

(1)超顺磁性微球与链霉亲和素通过共价结合形成链霉亲和素磁珠(streptavidin MBs，SMBs)，在室温条件下，将SMBs用IBM缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0,0.5M NaCl,1mM EDTA)清洗，用永久磁铁固定霉亲和素磁珠后再滤掉上层清液，再分散到2倍浓度的固定清洗缓冲液中(2×B&W buffer)；

(2)取DNA探针在70～8℃下预热5～30min，再与SMBs悬浊液混合(按照20pmol DNA对应于40μg MBs的比例混合)，制成浓度为1μM的磁性微球DNA探针测试液。轻微震荡测试液，30～40℃下培育10min以上，使DNA探针上的生物素与SMBs上的链霉亲和素更好地偶连形成磁性微球探针。用0.15M的NaOH溶液清洗滤掉非特异性结合或游离的DNA探针分子，接下来用TT缓冲液(向pH＝8.0的250mM的Tris-HCl缓冲液中加入0.1％的

20混合而成)将得到的探针冲洗两次后，继续加入TT缓冲液重悬，80℃培育10min后倒掉液体以进一步去除结合不稳定的偶连分子，最后，用DEPC水把探针清洗3次即可。

3、miRNA检测和DSN酶切反应

配制20微升反应液，其中包含20μg连接有2pmoles磁性微球DNA探针、1×DSN缓冲原液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl₂and 1mM DTT)、0.4U DSN、20U RNase抑制剂和1nM miRNA，在热循环仪中45℃培育120分钟，使待测样品miRNA(肺癌标志物miRNA-21)与磁性微球DNA探针发生杂化形成双链、DSN与双链发生酶切反应、DNA水解为片段并分离出荧光基团，其中释放的miRNA-21保持完整并再次与未发生反应的磁性微球DNA探针杂化，发生新的酶切反应，从而使溶液中含有的荧光基团增加。

4、荧光检测

反应完成后，为了去除连在磁珠上的未参与反应的DNA分子，用强磁铁固定磁珠后提取上层清液，检测上层清液中荧光分子的荧光强度，由于荧光强度取决于DSN酶切反应释放的荧光分子数量，从而根据测试得到的荧光强度进一步反映了待测液中待测样品miRNA(肺癌标志物miRNA-21)的浓度。

待检测miRNA与磁性微球DNA探针杂化成双联，以及DSN酶切反应释放荧光基团的过程如图1所示，待检测miRNA检测示意图如图2所示，上述四种不同结构的探针，荧光测试结果如图3所示，P1相对荧光单位(RFU)最强为500％，P2最弱为200％，P3和P4为350％。

实施例2

为了验证本发明构建的磁性微球DNA探针对特定标志物miRNA-21的特异性检测，依据miRNA-21的分子序列，选用了不同结构的待测分子，其中M1,M2,M3与miRNA-21中存在1个或2个不同的碱基，这六种分子的具体序列如表2所示。

表2 不同结构的六种分子的序列

探针分子	序列(从5’到3’端)
		miRNA-21(SEQ ID NO：1)	UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A
Mismatch 1(M1)(SEQ ID NO：6)	UAG CUU AUC AGA C<u>C</u>G AUG UUG A
		Mismatch 2(M2)(SEQ ID NO：7)	UA<u>C</u> CUU AUC AGA C<u>C</u>G AUG UUG A
Mismatch 3(M3)(SEQ ID NO：8)	UA<u>C</u> CUU AUC AGA C<u>C</u>G AUG UUG <u>C</u>
		MiRNA-10b(SEQ ID NO：9)	UAC CCU GUA GAA CCG AAU UUG UG
NC-MiRNA(NC)(SEQ ID NO：10)	UUG UAC UAC ACA AAA GUA CUG

采用实施例1中构建得到的含有P1的磁性微球DNA探针按照实施例1中的条件对这6种不同结构的待检测物进行miRNA检测、DSN酶切反应以及荧光检测，得到的荧光测试结果如图4所示，miRNA-21与探针分子的序列匹配并完全杂化，酶切反应后得到的相对荧光单位(RFU)最强为500％，另外五中分子反应后荧光分子的相对荧光单位低于100％。

由此可以看出本发明构建的磁性微球DNA探针对特定标志物miRNA-21的特异性检测。

实施例3

根据实施例1和实施例2的操作步骤，选择真实生物样品，把含有miRNA-21的人血清稀释成10fM，1pM，100pM三种不同的浓度，采用最优的实验条件，将实施例1中制备的含有P1的磁性微球DNA探针对不同浓度的含有miRNA-21的人血清进行测试，测试结果如表3所示。对于10fM，1pM，100pM三种测试样品，在血清和缓冲液中的测试结果比较，RUF值只有微小变化，说明本发明构建的磁性微球DNA探针在真实人体癌症诊断方面具有极大的应用潜能。

表3 不同浓度的含有miRNA-21的人血清测试结果

[miRNA],pM	RFU％，缓冲液	RFU％,血清	Recovery％	RSD％
					0.01	123.71086	123.9316	99.9	0.15610
1	182.03563	177.7303	97.6	3.04433
					100	251.91515	256.9801	100.02	3.58143

由此可知，实施例1中构建的磁性微球DNA探针的能够直接应用于检测真实生物样品miRNA的浓度，从而实现早期肺癌标志物的准确、快速检测。

由于本发明构建了一种检测肺癌标志物miRNA分子的磁性微球DNA探针，引入了双链特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)放大荧光信号强度，并借助磁珠降低背景信号，用于检测肺癌标志物miRNA分子浓度，具体检测原理为：通过生物素-链霉亲和素连接将修饰荧光标记DNA探针分子探针固定在磁珠上，DNA探针序列与靶标miRNA相匹配并发生杂交形成双链；在DSN酶作用下，杂合双链中的DNA探针水解为碎片，荧光集团分子悬浮在反应液中，但miRNA却保持完整并再次与DNA探针杂交并发生DSN酶切反应。如此反复，可实现恒温条件下一个miRNA分子与多个探针杂交、酶切、释放荧光基团的循环过程，最终体系的荧光基团数量得到显著放大。反应完成后，在磁场的作用下固定磁珠以及未参与反应的探针分子，分离提取含荧光分子的上层清液，通过测试上层清液中荧光基团的信号强度即可实现对靶标miRNA的灵敏检测。

综上所述，本发明能够通过待测的miRNA分子序列构建磁性微球DNA探针，能在保持样本中初始miRNA数量不变的前提下实现检测信号的线性放大。由于该探针在检测过程中无需进行PCR，避免了非特异性扩增，从而提高了检测的特异性。与传统的分离方法相比，把磁珠用于生化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时进行，有效地提高了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度大大提升。

同样的，依据包括肿瘤疾病或病毒传染性疾病的疾病标志物miRNA的分子序列合成的与上述序列配对的磁性微球DNA探针同样能够在保持样本中初始miRNA数量不变的前提下实现检测信号的线性放大，提高了检测的特异性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 中国科学院重庆绿色智能技术研究院

<120> 一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法及其产品和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 天然序列(Natural sequence)

<400> 1

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaacatcag tctgataagc ta 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcaacatcag tctgataagc ta 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaacatcag tctgataagc ta 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaacatcag tctgataagc ta 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uagcuuauca gaccgauguu ga 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

uaccuuauca gaccgauguu gc 22

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uacccuguag aaccgaauuu gug 23

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

uuguacuaca caaaaguacu g 21

Claims

1.一种检测miRNA分子的磁性微球DNA探针的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

(2)偶联培育：将所述DNA探针预热后与链霉亲和素磁珠悬浊液混合，在30-40℃条件下培育；

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述miRNA分子包括肿瘤疾病或病毒传染性疾病的疾病标志物miRNA。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述链霉亲和素磁珠悬浊液按照如下方法制备：

将超顺磁性微球与链霉亲和素通过共价结合形成链霉亲和素磁珠，在室温条件下，用IBM缓冲液清洗并用永久磁铁固定链霉亲和素磁珠后滤掉上层清液，再分散到固定清洗缓冲液中即可。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述DNA探针与链霉亲和素磁珠在混合过程中按照每20pmol DNA与40μg MBs链霉亲和素磁珠混合的比例进行。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述预热为在70～85℃下预热5～30min；所述培育时间为10min以上。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述NaOH溶液的浓度为0.15M；所述TT缓冲液按照如下方法配制：向pH＝8.0的250mM的Tris-HCl缓冲液中加入0.1％的

20混合而成。

7.由权利要求1～6任一项所述构建方法构建得到的磁性微球DNA探针。

8.权利要求7所述的磁性微球DNA探针在检测miRNA分子方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miRNA分子为肺癌标志物miRNA时，按照如下方法进行检测：首先向所述磁性微球DNA探针中加入所述miRNA、DSN和RNase抑制剂，在热循环仪中反应；然后用磁铁固定磁珠后提取上层清液，测试上清液的荧光强度，从荧光强度得到所述miRNA的浓度。