CN110387401A - 一种miRNA-21的检测方法 - Google Patents
一种miRNA-21的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110387401A CN110387401A CN201910653576.0A CN201910653576A CN110387401A CN 110387401 A CN110387401 A CN 110387401A CN 201910653576 A CN201910653576 A CN 201910653576A CN 110387401 A CN110387401 A CN 110387401A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mirna
- solution
- sucrose
- detection
- double
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 49
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 32
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims abstract description 30
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 28
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000002568 Multienzyme Complexes Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010093369 Multienzyme Complexes Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 16
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 29
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 claims 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 claims 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 abstract description 15
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 abstract description 14
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 abstract description 14
- 239000001573 invertase Substances 0.000 abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 3-phosphanylpropanoic acid Chemical class OC(=O)CCP QEDXSHCYPROEOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 108091032109 Homo sapiens miR-423 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091023276 Homo sapiens miR-4640 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000013580 millipore water Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种miRNA‑21的检测方法，该方法在磁珠上偶联底物链‑蔗糖酶复合物，当靶标miRNA出现后与底物链杂交，双链特异性核酸酶能选择性地裂解在DNA/RNA双链中的DNA并保持RNA的活性，释放的miRNA进行下一轮杂交循环；最后上清液中的蔗糖酶将蔗糖水解为葡萄糖，通过血糖仪检测获得输出信号。本发明通过引入双链特异性核酸酶和蔗糖酶对miRNA的检测信号进行双酶放大作用，提高了检测灵敏度，在10‑200pM具有线性关系，检测限为1.8pM，具有简便、快捷、灵敏、高效等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微小RNA的检测方法，特别涉及一种miRNA-21的检测方法。
背景技术
microRNAs(miRNAs)是一类长约18-25nt的内源性非编码小分子，存在于血清、血浆或尿液等体液中，它通过与其靶mRNA分子的3’端非编码区(3’UTR)互补结合，在翻译水平上调控后基因的表达。因此，miRNAs参与生物体多种生理过程，控制细胞分化、增殖和凋亡。然而，由于其在体液中低浓度，短长度和高同源性的特殊性，实现快速，简单，可靠和超灵敏的测定仍具有挑战性。
现有miRNA检测方式，大多需要昂贵的仪器设备和复杂的操作、冗长的等待时间。目前用于核酸检测的方法主要有四种：southern和northern印迹法、聚合酶链反应(PCR)、DNA微阵列、新一代测序(NGS)。这些方法普遍具有耗时较长、检测成本较高、需要大型昂贵仪器等的不足，此外对于操作人员专业知识有很高要求。这限制了miRNA检测在家庭和临床上的应用。
血糖仪具有小巧易携、价格便宜、方便使用等优点，是目前一种在家庭中广泛使用的血糖浓度测量仪器。双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease，DSN)是一种热稳定核酸酶，不需要特意的识别位点，能够选择性降解双链DNA和DNA/RNA杂交体中的DNA，但对单链DNA/RNA核酸分子和双链RNA分子几乎没有作用，能够区分完全和不完全匹配的双链体。链霉亲和素磁珠既具有磁性，又能进一步和修饰生物素的蛋白质、抗体及核酸等多种生物分子偶联，被广泛应用于免疫沉淀、免疫检测(ELASA)及各类核酸、蛋白质反应。如何利用上述材料的特性，结合化学修饰的技术，研究出可以简便检测miRNA的方法，是值得本行业技术人员思考的。
现有技术中的miRNA检测方法检测时间长，操作复杂，还需要使用PCR才能完成检测，或者荧光分光光度计等配合，对技术人员的操作技能要求比较高。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供一种检测灵敏度高和选择性高的基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法。
技术方案：本发明提供一种miRNA-21的检测方法，包括如下步骤：
(1)以链霉亲和素修饰磁珠为载体连接底物链(SEQ ID NO.1)-蔗糖酶复合物，形成检测探针；
所述底物链的结构为5’-生物素-自由链片段1-杂交片段-自由链片段2-3’；
所述自由链片段1的序列为：5’-aaaaa-3’；所述自由链片段2的序列为：5’-aaaaaaaaaa-3’；所述杂交片段的序列为：5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’；底物链序列为5’-aaaaatcaacatcagtctgataagctaaaaaaaaaaa-3’(SEQ ID NO.1)。
(2)检测探针弃去澄清溶液后加入待检测miRNA-21(SEQ ID NO.2)、DEPC处理水、双链特异性核酸酶缓冲液和DSN，进行反应，待测miRNA-21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA-21，之后进入下一轮杂交循环；
(3)将反应溶液进行磁分离，然后将澄清的上清液转移到含有缓冲液A的蔗糖溶液中，进行反应；
(4)检测产生的葡萄糖信号，获得葡萄糖浓度值，根据miRNA-21与葡萄糖浓度的线性关系，计算miRNA-21的浓度值。
进一步地，所述步骤(2)中的双链特异性核酸酶缓冲液包含50mM Tris-HCl，pH8.0，5mM MgCl2和1mM DTT和1μL DSN(1U/uL)。
进一步地，所述步骤(4)中利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号。应用血糖仪检测，大大降低检测成本和检测时的技术要求：不需要各种工具酶以及多步、复杂难懂的放大步骤，无需冗长的等待时间，大型昂贵的仪器，复杂专业的操作技术，血糖仪读数与标准曲线对照，直接得出miRNA含量，更加简便快捷，适合普通民众使用。
进一步地，所述检测探针的制备方法为：
(1)制备底物链溶液：用DEPC水配制底物链，加入磷酸钠缓冲液和溶解在DEPC水中的TCEP，将混合物在室温下静置后超滤纯化；
(2)制备纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液：用缓冲液A配制蔗糖酶溶液，与sulfo-SMCC混合；涡旋后，于室温条件置于振荡器上反应，离心除去过量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和缓冲液A将溶液超滤纯化；
(3)制备底物链-蔗糖酶复合物：将纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液与底物链溶液混合，室温下静置；然后使用缓冲液A、超滤纯化除去未反应的底物链；
(4)将底物链-蔗糖酶复合物和链霉亲和素修饰磁珠偶联：向磁珠溶液中加入缓冲液B，室温下混合反应，最后，用缓冲液B洗涤除去未连接的DNA链。
进一步地，所述步骤(4)中miRNA与葡萄糖浓度的线性关系为：当miRNA-21浓度在10-200pM范围内符合线性方程y＝2.98+0.12x，其中，y为血糖仪读数，x为miRNA-21浓度。
进一步地，所述步骤(3)缓冲液A中含有氯化钠和磷酸钠，pH值7.3。
本发明方法的原理阐述如下：
在磁珠上偶联底物链-蔗糖酶复合物，当靶标miRNA出现后与底物链杂交，双链特异性核酸酶能选择性地裂解在DNA/RNA双链中的DNA并保持RNA的活性，释放的miRNA进行下一轮杂交循环；同时释放的蔗糖酶将蔗糖水解为葡萄糖，通过血糖仪检测获得输出信号。(见图1)。
为了克服现有miRNA检测技术中存在的操作复杂、时间冗长、仪器昂贵等缺点，本发明新型提供一种基于血糖仪的miRNA检测新方法。血糖仪作为一种被广泛应用的床旁即时检测仪器，具备体积小巧、便携易带、操作简单的优点。为了实现超高灵敏度，应用双链特异性核酸酶循环miRNA及蔗糖酶双酶放大的信号扩大策略。探针以链霉亲和素修饰磁珠为载体，通过生物素偶联底物链。与qRT-PCR不同，整个检测过程可以通过短链核酸miRNA启动，双链特异性核酸酶的选择性地裂解在DNA/RNA双链中的DNA并保持RNA的催化活性作用导致底物链的裂解和蔗糖酶与磁珠的分离。最终，收集到上清液中总蔗糖酶量增加，实现miRNA检测信号的有效放大。
第一方面，选用的双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease，DSN)是一种热稳定核酸酶，不需要特意的识别位点，能够选择性降解双链DNA和DNA/RNA杂交体中的DNA，但对单链DNA/RNA核酸分子和双链RNA分子几乎没有作用，能够区分完全和不完全匹配的双链体。
第二方面，为了构建由特定序列miRNA启动的反应体系，设计了杂交片段，其含有与靶标miRNA-21互补的靶结合序列(5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’)。并且在杂交片段的3’端具有10nt的游离序列，为与蔗糖酶的结合提供足够的空间距离。靶标miRNA通过杂交反应与底物链杂交片段形成双链，底物链中的DNA/RNA杂交双链能够被双链特异性核酸酶裂解，释放出目标miRNA，然后目标miRNA又会返回到下一轮反应，继续与未被裂解的底物链杂交形成DNA/RNA的杂交双链，继续被双链特异性核酸酶裂解，释放出目标miRNA。最终释放出大量蔗糖酶，实现信号的放大作用。
有益效果：本发明双酶放大效应，可提高miRNA检测灵敏度。相比其他需要加入引物多次扩增的检测方法，此方法通过双链特异性核酸酶和蔗糖酶使得只需少量特定miRNA的激活即可启动体系，转化得到明显的检测信号。底物链的互补片段结构增强miRNA检测的特异性：可以对特异性靶标进行进行有效识别，对于单碱基错配的目标miRNA也具有良好的识别能力。底物链与磁珠通过亲和链霉素与生物素结合：高效稳定，磁珠比表面积大，可修饰性强，成本低廉，且每个磁珠上含有成千上万底物链，进一步增大了放大效果。
附图说明
图1为本发明miRNA检测原理示意图；
图2为实施1制备得到的底物链-蔗糖酶复合物的6％SDS-PAGE表征示意图；
图3为实施1制备得到的探针的动态光散射粒径变化示意图；
图4为实施2制备得到的探针检测miRNA-21线性标曲；
图5为实施3所述的识别miRNA-21靶标的选择性考察结果。
具体实施方式
以下实施例中，检测所述的血糖仪型号为：罗氏诊断产品(上海)有限公司的ACCU-CHEK Performa NC血糖仪；检测所用的电泳***为：上海天能科技有限公司型号为VE 180的微型垂直电泳槽；美国BIO-RAD伯乐公司Chemi Doc凝胶成像***；美国BIO-RAD伯乐公司型号为PowerPac 1000的垂直电泳仪；
每升缓冲液A中含有：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.3。
每升缓冲液B中含有：0.1M氯化钠，0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.3，0.05％Tween-20。
以上缓冲液的配制溶液为DEPC水。
实施例1：底物链-蔗糖酶复合物以及探针合成成功验证
1、制备底物链和蔗糖酶连接复合物：
用DEPC水配制30μL浓度为1mM的底物链，加入2μL pH 5.5的磷酸钠缓冲液(1M)和2μL溶解在Millipore水中的浓度为30mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，将该混合物在室温下静置1小时，然后使用Amicon-10K超滤管超滤纯化8次。
蔗糖酶连接底物链：用缓冲液A配制400μL浓度为20mg/mL的蔗糖酶溶液，与1mgsulfo-SMCC混合；涡旋5分钟后，室温条件置于振荡器上反应1小时，1000r离心5分钟除去过量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和缓冲液A将溶液超滤纯化8次。
将纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液与底物链溶液混合，室温下静置48小时；然后使用缓冲液A、通过Amicon-100K纯化该溶液8次，以除去未反应的底物链。
在6％SDS-PAGE胶中验证底物链-蔗糖酶复合物的成功合成。
图2给出了实施1制备得到的底物链-蔗糖酶复合物的6％SDS-PAGE表征示意图。泳道1代为蔗糖酶，泳道2为底物链-蔗糖酶复合物。
由图可知，连接底物链后的蔗糖酶的相对分子量变大，表明底物链成功连接上去。
2、将底物链-蔗糖酶复合物与磁珠偶联：
将底物链-蔗糖酶复合物和链霉亲和素修饰磁珠偶联：向磁珠溶液中加入缓冲液B，室温下混合反应60分钟。最后，最后，使用缓冲液B洗涤三次以除去过量的未连接DNA链。
通过马尔文粒度仪测定亲和链霉素修饰磁珠和合成的探针的粒径变化。
图3给出了实施1制备得到的探针的粒径变化表征示意图。
由图可知，动态光散射(DLS)光谱表明亲和链霉素修饰磁珠的平均水合直径为1.13±0.058μM，在修饰底物链-蔗糖酶复合物后，水合粒径增加至约1.90±0.12μM，表明探针的成功合成。
实施例2：miRNA-21的检测灵敏度实验
1、实验所需仪器和试剂和实施1一致；
2、考察基于脱氧核酶和蔗糖酶的双酶放大体系测定miRNA-21标准溶液的灵敏度，包括以下步骤：
(1)配制样品：用DEPC水分别配制10pM-200pM浓度的miRNA-21标准溶液，使其浓度分别为10pM，20pM，50pM，100pM，150pM，200pM；
(2)进行反应：将20uL检测探针置于磁架中2分钟，弃去澄清溶液，然后加入10μL不同浓度的待检测miRNA-21(SEQ ID NO.2)，7μL DEPC处理水，2μL双链特异性核酸酶缓冲液(包含50mM Tris-HCl，pH 8.0，5mM MgCl2和1mM DTT)和1μL DSN(1U/uL)。并处45℃下反应50分钟。待测miRNA-21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA-21，进入下一轮杂交循环；
(3)磁分离：然后将澄清的上清液转移到用缓冲液A配制的浓度为2 M的蔗糖溶液中，处于55℃反应40分钟；
(4)读数：利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号，获得血糖仪读数值；
(5)绘制标准曲线：以miRNA-21标准溶液浓度为横坐标，以每一浓度标准曲线对应的血糖仪读数为纵坐标，绘制标准曲线。
图4给出了miRNA-21浓度与血糖仪读数的标准曲线。
由图4可知，目标物的浓度在10pM-200pM范围内符合线性方程y＝2.98+0.12x，其中，y为血糖仪读数，x为miRNA-21浓度。miRNA-21的浓度与血糖仪读数成线性相关(r2＞0.997)，以空白平均值的3倍SD值除以斜率的方法计算，最低检测限位1.8pM，可用于miRNA的测定。.
实施例3：考察对miRNA-21的选择性
1、实验所需仪器、试剂和探针合成方法与实施1一致；
2、本实验所需的序列除申请权利保护的序列，还需用到以下序列(如表1所示)：
表1寡核苷酸序列一览表
3、基于脱氧核酶和蔗糖酶的双酶放大体系测定miRNA-21及错配序列的选择性，包括以下步骤：
(1)配制样品：用DEPC水分别配制hsa-miR-200c、hsa-mir-423、hsa-miR-4640、has-miR-21、Mis-1、Mis-2、Mis-3和NC序列的200pM浓度的标准溶液，空白对照(Blank)为DEPC水；
(2)进行反应：将20uL检测探针置于磁架中2分钟，弃去澄清溶液，然后加入10μL不同浓度的待检测miRNA-21(5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’：SEQ ID NO.2)，7μLDEPC处理水，2μL双链特异性核酸酶缓冲液(包含50mM Tris-HCl，pH8.0，5mM MgCl 2和1mM DTT)和1μL DSN(1U/uL)。并处45℃下反应50分钟。待测miRNA-21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA-21，进入下一轮杂交循环。
(3)磁分离：然后将澄清的上清液转移到用缓冲液A配制的浓度为2 M的蔗糖溶液中，处于55℃反应40分钟。
(4)读数：利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号，获得血糖仪读数值。
(5)绘制柱状图：绘制血糖仪读数柱状图。以每种靶标的名称为横坐标，每种靶标所得血糖仪读数为纵坐标，绘制柱状图。
图5为本实施例所述的识别miRNA-21靶标的选择性的考察结果。
由图5可知，单碱基错配(Mis-2、Mis-3)和三碱基错配(Mis-1)与miRNA-21相比，有着明显的选择性差别，而其他miRNA序列的测定值与空白背景差别不大，说明它们无法有效地启动探针；上述结果也证明了本实施所述检测体系有良好的选择性。
实施例4：考察在尿液样品中对miRNA-21的加样回收率
1、实验所需仪器、试剂和探针合成方法实施1一致；
2、体液环境为小鼠尿液环境；
3、实验所用的工作曲线和实施2一致；
4、考察检测探针体系在尿液环境中测定miRNA-21的回收率，步骤如下所示：
(1)配制样品：用DEPC水分别配制10pM、100pM、200pM浓度的miRNA-21标准溶液；
(2)进行反应：将20uL检测探针置于磁架中2分钟，弃去澄清溶液，然后加入10μL不同浓度的待检测miRNA-21(SEQ ID NO.2)，7μL DEPC处理水，2μL双链特异性核酸酶缓冲液(包含50mM Tris-HCl，pH 8.0，5mM MgCl2和1mM DTT)和1μL DSN(1U/uL)。并处45℃下反应50分钟。待测miRNA-21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA-21，进入下一轮杂交循环；
(3)磁分离：然后将澄清的上清液转移到用缓冲液A配制的浓度为2M的蔗糖溶液中，处于55℃反应40分钟；
(4)读数：利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号，获得血糖仪读数值；
(5)测定回收率：以实施2所得工作曲线为标准曲线，计算加样后实验对应的回收率；
(6)所述计算方法为：已知在尿液中的加样浓度为C0，将血糖仪测定值代入标准曲线拟合公式求出测量浓度C，将浓度C代入公式C/C0X 100％，即得到回收率。
表2给出了实施4所述的对于体液体系样品中miRNA-21回收的考察结果。
经计算可知，所述回收率在90-110％之间，变异系数小于10％，结果表明，本实施例检测体系可以有效地屏蔽复杂体液环境的干扰，检测方法具有良好的精密度和重现性。
表2尿液中的加样回收实验结果
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种miRNA-21的检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaatcaac atcagtctga taagctaaaa aaaaaaa 37
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uagcuuauca gacugauguu ga 22
Claims (6)
1.一种miRNA-21的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)以链霉亲和素修饰磁珠为载体连接底物链(SEQ ID NO.1)-蔗糖酶复合物，形成检测探针；
所述底物链的结构为5’-生物素-自由链片段1-杂交片段-自由链片段2-3’；
所述自由链片段1的序列为：5’-aaaaa-3’；自由链片段2的序列为：5’-aaaaaaaaaa-3’；杂交片段的序列为：5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’；
(2)检测探针弃去澄清溶液后加入待检测miRNA-21(SEQ ID NO.2)、DEPC处理水、双链特异性核酸酶缓冲液和DSN，进行反应，待测miRNA-21与检测探针的杂交区域特异性结合，然后底物链中的杂交片段被双链特异性核酸酶裂解，释放miRNA-21，之后进入下一轮杂交循环；
(3)将反应溶液进行磁分离，然后将澄清的上清液转移到含有缓冲液A的蔗糖溶液中，进行反应；
(4)检测产生的葡萄糖信号，获得葡萄糖浓度值，根据miRNA-21与葡萄糖浓度的线性关系，计算miRNA-21的浓度值。
2.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的双链特异性核酸酶缓冲液包含50mM Tris-HCl，5mM MgCl2和1mM DTT和1μL DSN(1U/uL)，pH值8.0。
3.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中利用血糖仪检测产生的葡萄糖信号。
4.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述检测探针的制备方法为：
(1)制备底物链溶液：用DEPC水配制底物链，加入磷酸钠缓冲液和溶解在DEPC水中的TCEP，将混合物在室温下静置后超滤纯化；
(2)制备纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液：用缓冲液A配制蔗糖酶溶液，与sulfo-SMCC混合；涡旋后，于室温条件置于振荡器上反应，离心除去过量sulfo-SMCC，然后用Amicon-100K和缓冲液A将溶液超滤纯化；
(3)制备底物链-蔗糖酶复合物：将纯化的sulfo-SMCC活化蔗糖酶溶液与底物链溶液混合，室温下静置；然后使用缓冲液A、超滤纯化除去未反应的底物链；
(4)将底物链-蔗糖酶复合物和链霉亲和素修饰磁珠偶联：向磁珠溶液中加入缓冲液B，室温下混合反应，最后，用缓冲液B洗涤除去未连接的DNA链。
5.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中miRNA与葡萄糖浓度的线性关系为：当miRNA-21浓度在10-200pM范围内符合线性方程y＝2.98+0.12x，其中，y为血糖仪读数，x为miRNA-21浓度。
6.根据权利要求1所述的miRNA-21的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)缓冲液A中含有氯化钠和磷酸钠，pH值7.3。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910653576.0A CN110387401A (zh) | 2019-07-18 | 2019-07-18 | 一种miRNA-21的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910653576.0A CN110387401A (zh) | 2019-07-18 | 2019-07-18 | 一种miRNA-21的检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110387401A true CN110387401A (zh) | 2019-10-29 |
Family
ID=68286797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910653576.0A Pending CN110387401A (zh) | 2019-07-18 | 2019-07-18 | 一种miRNA-21的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110387401A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110747257A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-04 | 天津大学 | 非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒 |
| CN112961904A (zh) * | 2021-03-03 | 2021-06-15 | 江南大学 | 一种基于便携式血糖仪的microRNA检测方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103278621A (zh) * | 2013-04-25 | 2013-09-04 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种利用生物传感器与血糖仪检测转录因子的方法 |
| CN107385037A (zh) * | 2017-07-24 | 2017-11-24 | 广州海力特生物科技有限公司 | 一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法 |
| CN108034697A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-05-15 | 天津大学 | 一种基于双酶信号级联放大的微小rna-21超灵敏检测方法 |
| CN108588178A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-28 | 山东师范大学 | 一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法 |
| CN108841923A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-11-20 | 南京邮电大学 | 一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法 |
| CN109825519A (zh) * | 2019-02-22 | 2019-05-31 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种基于血糖仪检测的检测载体 |
| CN109856215A (zh) * | 2019-03-07 | 2019-06-07 | 广西师范学院 | 羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法 |
-
2019
- 2019-07-18 CN CN201910653576.0A patent/CN110387401A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103278621A (zh) * | 2013-04-25 | 2013-09-04 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种利用生物传感器与血糖仪检测转录因子的方法 |
| CN107385037A (zh) * | 2017-07-24 | 2017-11-24 | 广州海力特生物科技有限公司 | 一种miRNA间接实时荧光定量PCR检测方法 |
| CN108034697A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-05-15 | 天津大学 | 一种基于双酶信号级联放大的微小rna-21超灵敏检测方法 |
| CN108588178A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-09-28 | 山东师范大学 | 一种检测碱性磷酸酶的试剂盒及其方法 |
| CN108841923A (zh) * | 2018-06-07 | 2018-11-20 | 南京邮电大学 | 一种基于DSN酶的量子点-磁珠miRNA传感器及其制备方法和检测方法 |
| CN109825519A (zh) * | 2019-02-22 | 2019-05-31 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种基于血糖仪检测的检测载体 |
| CN109856215A (zh) * | 2019-03-07 | 2019-06-07 | 广西师范学院 | 羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 刘景荣等: "基于酶辅助循环放大和银纳米簇技术构建荧光传感器用于MicroRNA的检测", 《化学试剂》 * |
| 吴婷婷: "便携式生物传感器的构建及其在核酸现场检测中的应用", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑B014》 * |
| 方杰等: "便携式血糖仪对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的灵敏检测方法研究", 《分析仪器》 * |
| 李晓利等: "双链特异性核酸酶介导的高灵敏度microRNA分析", 《化学学报》 * |
| 王奎宇等: "DSN结合CHA用于miRNA的可视化检测", 《黑龙江畜牧兽医》 * |
| 陈秋香等: "基于磁珠和双链特异性核酸酶辅助目标循环技术构建荧光传感器用于MicroRNA的检测", 《分析试验室》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110747257A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-04 | 天津大学 | 非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒 |
| CN112961904A (zh) * | 2021-03-03 | 2021-06-15 | 江南大学 | 一种基于便携式血糖仪的microRNA检测方法 |
| CN112961904B (zh) * | 2021-03-03 | 2023-01-06 | 江南大学 | 一种基于便携式血糖仪的microRNA检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2011001496A1 (ja) | 検体解析方法およびそれに用いるアッセイキット | |
| Zhang et al. | An ultrasensitive label-free electrochemical biosensor for microRNA-21 detection based on a 2′-O-methyl modified DNAzyme and duplex-specific nuclease assisted target recycling | |
| CN110241181A (zh) | 一种基于脱氧核酶和蔗糖酶的血糖仪检测miRNA-21方法 | |
| CN110106290A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas***用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒 | |
| CN104278088A (zh) | 一种基于恒温指数扩增反应与表面增强拉曼光谱检测的miRNA检测方法及其应用 | |
| CN110093415A (zh) | 检测cyp3a5基因的方法、试剂盒、引物对及探针 | |
| CN110387401A (zh) | 一种miRNA-21的检测方法 | |
| Huang et al. | Dual signal amplification for microRNA-21 detection based on duplex-specific nuclease and invertase | |
| CN110923314A (zh) | 一组检测SNP位点rs9263726的引物、crRNA序列及其应用 | |
| CN110029150A (zh) | 用于检测微小rna的小分子金属螯合剂标记寡核苷酸探针的制备方法 | |
| CN110241200B (zh) | Flt3-itd突变高灵敏度检测方法及试剂盒 | |
| CN110951831A (zh) | 一种基于核酸识别诱导的荧光生物传感器及应用 | |
| JP5515121B2 (ja) | 酵素の反応性を改善する方法 | |
| EP3170898A1 (en) | Method for detecting nucleic acid, capture probe, detection probe set, microarray, nucleic acid detection kit, nucleic-acid-immobilized solid phase, and fluid device | |
| CN118185924A (zh) | 基于CRISPR/Cas13a***的一步法无靶标扩增可视化RNA病毒检测方法 | |
| CN112553379B (zh) | 基于液相芯片检测呼吸道传染病病毒的方法及试剂盒 | |
| WO2022251711A1 (en) | Massive generation of chemically ligateable probes for multiplexed fish | |
| CN110938675B (zh) | siRNA定向自组装量子点生物传感器及其检测方法和应用 | |
| CN113249378A (zh) | 检测ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段及其应用 | |
| CN112538521A (zh) | 一种检测miRNA的方法及一种用于检测miRNA的生物探针 | |
| CN102344970B (zh) | 同时检测人cmv和bk病毒dna的引物序列及定量检测试剂盒 | |
| JP2011004733A (ja) | 複数検体中の標的核酸を検出するマイクロアレイ | |
| CN116479116A (zh) | 可排除smn2干扰的smn1基因检测的试剂盒及检测方法 | |
| CN110747257A (zh) | 非诊断目的基于一步荧光循环衰减法检测miRNA的方法及试剂盒 | |
| CN114540503B (zh) | 基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let-7a检测试剂盒及其使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191029 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |