CN111544595B - 泛素结合酶e2抑制剂和溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明首次公开了泛素结合酶E2抑制剂可以作为溶瘤病毒的抗瘤增效剂/耐药逆转剂。发明人通过抑制泛素结合酶E2可以显著增强溶瘤病毒的溶瘤效应。发明人采用了抑制泛素结合酶E2活性的化合物Bay11‑7082协同溶瘤病毒尤其是M1病毒作用于肿瘤细胞，实验结果发现，Bay11‑7082可以协同溶瘤病毒增强抗肿瘤效应。

Description

泛素结合酶E2抑制剂和溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及泛素结合酶E2抑制剂和溶瘤病毒在制备抗肿瘤药物的应用。

背景技术

溶瘤病毒(oncolytic virus)是一类靶向性感染并杀伤肿瘤细胞，而不损伤正常细胞的可复制病毒。溶瘤病毒疗法(oncolytic virotherapy)是一种创新的肿瘤靶向治疗策略，它利用天然的或经基因工程改造的病毒选择性的感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中复制，达到靶向性溶解、杀伤肿瘤细胞的作用，但是对正常细胞没有损伤。

溶瘤病毒M1是一种披膜病毒科甲病毒属盖塔样病毒，分离于中国海南岛库蚊属蚊虫。例如中国发明专利申请CN104814984A公开了溶瘤病毒M1能选择性引起肿瘤细胞死亡而不影响正常细胞存活。然而，不同肿瘤对M1病毒的敏感性不一，对于某些肿瘤，M1病毒单独用药时，溶瘤作用还不够理想。例如中国发明专利申请CN104814984A所记载的，M1作为抗肿瘤药物使用时，对于结直肠癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌的效果不如胰腺癌、鼻咽癌、***癌和黑色素瘤明显；而胶质瘤、***、肺癌则更其次；而胃癌则最不显著。若能筛选出增加溶瘤病毒肿瘤治疗效果的化合物有望增加溶瘤病毒的抗瘤谱及抗瘤强度。

发明内容

本发明第一个方面的目的，在于针对现有技术中缺少低毒、对正常细胞没有毒性的溶瘤病毒增效剂，提供泛素结合酶E2抑制剂在制备溶瘤病毒抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂中的应用。

本发明第二个方面的目的，在于提供一种抗肿瘤的药物组合物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供泛素结合酶E2抑制剂在制备溶瘤病毒抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂中的应用。

所述的泛素结合酶E2抑制剂为抑制E2结合酶活性的物质、或降解E2结合酶的物质、或降低E2结合酶水平的基因工具。泛素结合酶E2，也被称为E2酶，E2酶通过E1酶与E3酶的选择性蛋白质相互作用，并将激活与共价修饰联系起来。E2酶可以通过单个Ub/UBL分子或以链的形式区分对下游底物的影响。虽然E3酶参与底物选择，但E2酶是选择赖氨酸构建泛素链的主要决定因素，从而直接控制底物的细胞命运。目前已发现的泛素结合酶E2约40个，相比活化酶E1，结合酶E2抑制剂具有更强的特异性，在肿瘤治疗方面也有更大的价值。例如化合物CC0651是结合酶E2 CDC34的抑制剂，与CDC34结合后使其发生构象改变从而无法完成UB的传递。

进一步地，根据本发明第一个方面所述的应用，所述溶瘤病毒选自甲病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒中的一种或多种；优选地，所述甲病毒选自M1病毒、盖塔病毒中的至少一种。

进一步地，根据本发明第一个方面所述的应用，所述泛素结合酶E2抑制剂为抑制泛素结合酶E2活性的物质、或降解泛素结合酶E2的物质、或降低泛素结合酶E2表达水平的基因工具；优选地，所述抑制泛素结合酶E2活性的物质选自化合物；所述降低泛素结合酶E2表达水平的基因工具为基因沉默、基因编辑或基因敲除的工具。

优选地，根据本发明第一个方面所述的应用，所述抑制泛素结合酶E2活性的物质优选为Bay11-7082或其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、同分异构体。

或更优选地，根据本发明第一个方面所述的应用，所述降低泛素结合酶E2表达水平的基因工具为siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA。

进一步地，根据本发明第一个方面所述的应用，所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤；优选地，实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、***、***癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、或胃癌。

本发明的第二个方面，提供一种抗肿瘤的药物组合物，包括泛素结合酶E2抑制剂和溶瘤病毒。

进一步地，根据本发明第二个方面所述的药物组合物，所述泛素结合酶E2抑制剂为抑制泛素结合酶E2活性的物质、或降解泛素结合酶E2的物质、或降低泛素结合酶E2表达水平的基因工具；

优选地，所述抑制泛素结合酶E2活性的物质选自化合物；所述降低泛素结合酶E2表达水平的基因工具为基因沉默、基因编辑或基因敲除的工具。

更优选地，根据本发明第二个方面所述的药物组合物，所述抑制泛素结合酶E2活性的物质优选为Bay11-7082。

或更优选地，根据本发明第二个方面所述的药物组合物，所述降低泛素结合酶E2表达水平的基因工具为siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA。

进一步地，根据本发明第二个方面所述的药物组合物，所述溶瘤病毒选自甲病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒中的一种或多种；优选地，所述甲病毒选自M1病毒、盖塔病毒中的至少一种。

进一步地，根据本发明第二个方面所述的药物组合物，所述肿瘤包括实体瘤或血液瘤；优选地，实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、***、***癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、或胃癌。

本发明的有益效果是：

本发明首次发现，泛素结合酶E2抑制剂可以作为溶瘤病毒的抗瘤增效剂/耐药逆转剂。

本发明提供了泛素结合酶E2抑制剂在制备溶瘤病毒抗瘤增效剂/耐药逆转剂方面的应用。

耐药逆转剂是指，当采用一些溶瘤病毒作为抗肿瘤药物用于***时，存在着一些肿瘤对溶瘤病毒并不太敏感，或者说这些肿瘤对溶瘤病毒具有抗性，此时，可以采用与泛素结合酶E2抑制剂(作为耐药逆转剂)联用溶瘤病毒的方式，以逆转肿瘤对所述溶瘤病毒的抗性。

发明人通过抑制泛素结合酶E2可以显著增强溶瘤病毒的溶瘤效应。发明人采用了抑制泛素结合酶E2活性的化合物Bay11-7082协同溶瘤病毒尤其是M1病毒作用于肿瘤细胞，实验结果发现，Bay11-7082可以协同溶瘤病毒增强抗肿瘤效应。

本发明发现了泛素结合酶E2抑制剂，尤其是Bay11-7082可以增加溶瘤病毒的抗肿瘤效应，以提高溶瘤病毒作为抗肿瘤药物时的治疗有效性。细胞学实验证明M1病毒和Bay11-7082联合应用，可显著引起肿瘤细胞的形态学病变，从而显著增强对肿瘤细胞的抑制作用。

发明人联合Bay11-7082和M1病毒作用于人肝细胞癌Hep3B株，出人意料的发现抗病毒化合物Bay11-7082和M1病毒联合应用时，显著增加肿瘤细胞形态病变，显著降低肿瘤细胞生存率。例如在本发明的一个实施例中，当M1病毒(MOI＝0.001)单独处理肝癌细胞时，肿瘤细胞存活率为72％，而当以1μM的Bay11-7082与同样MOI的M1病毒联用时，肿瘤细胞存活率大幅下降至44.1％。与单用M1病毒的抗肿瘤效果相比，Bay11-7082与M1联用时，溶瘤效果显著提升。

本发明发现，Bay11-7082与溶瘤病毒联合应用处理肿瘤细胞，对肿瘤细胞杀伤作用显著优于单用相同浓度的Bay11-7082，例如当同样例如以1μM的Bay11-7082处理肿瘤细胞时，肿瘤细胞存活率仍高达87.7％，当以1μM的Bay11-7082与M1病毒联用时，肿瘤细胞存活率大幅下降至44.1％。可见，Bay11-7082与M1联用时大幅提升的溶瘤效果，是得益于Bay11-7082与M1病毒之间的协同性机制，并非简单地通过Bay11-7082的抗肿瘤机制发挥作用。

本发明采用的溶瘤病毒增效剂还具备一个特点，其可以以极低的施用剂量，而获得明显的增效溶瘤病毒的效果。例如，尽管在如此低的(例如，低至50uM)使用剂量时，Bay11-7082对癌细胞的杀伤率几乎可以忽略(肝癌细胞存活率仍高达为87.7％)。然而，当同样以如此低的剂量与M1病毒联用时，肿瘤细胞存活率大幅下降至44.1％。极低剂量的使用，可以大大降低药物本身可能引起的其他毒副作用，使得用药对机体的影响降低。这对于正在接受癌症治疗的病人来说是十分重要的。

附图说明

图1Bay11-7082与M1病毒联合处理对人肝细胞癌株Hep3B存活率的影响。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例1BAY11-7082与M1病毒联合处理显著降低人肝细胞癌株Hep3B存活率

材料：

人肝细胞癌Hep3B(购于ATCC)，M1病毒(保藏编号CCTCC V201423)，高糖DMEM培养基(购于Corning)，多功能酶标仪。

在本发明优选的实施例中，泛素结合酶E2抑制剂为Bay11-7082，其结构式如式1所示：

式1：Bay11-7082。

方法：

a)接种细胞、给药处理：选择对数生长期细胞，DMEM完全培养液(含10％胎牛血清、1％双抗)制成细胞悬液，以每孔4×103细胞的密度接种在96孔培养板内。12小时后见细胞完全贴壁，实验分对照组、单用BAY 11-7082组、M1感染组和BAY 11-7082/M1联用组。所用剂量为：M1病毒(MOI＝0.001)感染细胞；BAY 11-7082为1μM。

b)四甲基偶氮唑盐(MTT)与细胞内的琥珀酸脱氢酶反应：药物处理48h时，每孔加入MTT 20μL(5mg/mL)，继续孵育4小时，此时镜检可观察到活细胞内形成的颗粒状蓝紫色甲臜结晶。

c)溶解甲臜颗粒：小心吸去上清，加DMSO 100μL/孔溶解形成的结晶，在微型振荡器上震荡5min，然后在酶联检测仪上用波长570nm检测各孔的光密度(OD值)。细胞存活率＝药物处理组OD值/对照组OD值×100％。

结果：

如附图1所示，M1病毒(MOI＝0.001)单独处理对肿瘤细胞Hep3B具有较小的生存率抑制作用，肿瘤细胞存活率达到72.0％，1μM的BAY 11-7082处理组肿瘤细胞存活率仍高达87.7％，然而，当同样的1μM的BAY 11-7082与M1病毒(MOI＝0.001)联用(BAY11-7082+M1)时，肿瘤细胞存活率大幅下降至44.1％，说明BAY11-7082能明显增强M1病毒的溶瘤效应。

实施例2

一种用于***的药物组合物，其包含泛素结合酶E2抑制剂以及溶瘤病毒。

还可以是用于***的药品套装，其包含泛素结合酶E2抑制剂或其衍生物或它们的组合，以及溶瘤病毒。药品套装区别于组合物的地方在于，泛素结合酶E2抑制剂不同于溶瘤病毒的剂型，而是独立包装(例如：药丸、或胶囊、或药片或安剖瓶中，含有泛素结合酶E2抑制剂；另外的药丸、或胶囊、或药片或安剖瓶中，含有溶瘤病毒)。在一些实施例中，溶瘤病毒、泛素结合酶E2抑制剂，以及溶瘤病毒和泛素结合酶E2抑制剂的组合，也可含一种或多种佐剂。所述的佐剂是指在药物组成中，可辅助药物疗效的成分。药品套装也可以包含独立包装的泛素结合酶E2抑制剂，以及独立包装的溶瘤病毒。药物套装中泛素结合酶E2抑制剂，以及溶瘤病毒的施用，可以是同时施用或者是以任意的前后顺序施用，例如在溶瘤病毒之前施用泛素结合酶E2抑制剂，或者在溶瘤病毒之后施用泛素结合酶E2抑制剂，或者两者同时施用。在各种实施例中，患者可以是哺乳动物。哺乳动物可以是人。

所述的泛素结合酶E2抑制剂包括但不限于Bay11-7082(式1)这一类的抑制泛素结合酶E2活性的化合物。或者针对泛素结合酶E2基因表达抑制工具，包括但不限于基因干扰、基因沉默以及基因编辑或敲除等工具手段。作为本发明优选的实施方式，所述的泛素结合酶E2抑制剂选自Bay11-7082。

所述的溶瘤病毒选自甲病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒中的一种或多种；其中，所述的甲病毒选自M1病毒和盖塔病毒。作为优选的实施方式，所述的溶瘤病毒选自M1病毒和盖塔病毒的至少一种。

所述的溶瘤病毒选自甲病毒、腺病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水泡口炎病毒、和单纯性疱疹病毒中的一种或多种；其中，所述的甲病毒选自M1病毒和盖塔病毒。作为优选的实施方式，所述的溶瘤病毒选自M1病毒和盖塔病毒的至少一种。M1病毒属于盖塔相似病毒，这两者的同源性高达97.8％。

优选地，采用的溶瘤病毒为保藏编号CCTCC V201423的M1病毒。

优选地，所述肿瘤为实体瘤或血液瘤。所述实体瘤为肝癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、***、***癌、胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、或胃癌。在优选的实施方式中，所述肿瘤为对溶瘤病毒不敏感的肿瘤。在更优选的实施方式中，所述肿瘤为对M1溶瘤病毒不敏感的肿瘤。

作为可选的实施方案，Bay11-7082可以是注射剂、片剂、胶囊、贴剂、试剂盒等。作为优选的实施方案，增效药物是注射剂；优选地，可采用静脉注射。

以上所述的实施例仅为阐述性例子，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进、修饰、替代、组合、简化，均应为等同的置换方式，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.泛素结合酶E2抑制剂在制备溶瘤病毒抗肿瘤增效剂或耐药逆转剂中的应用；

所述溶瘤病毒为M1病毒；

所述泛素结合酶E2抑制剂为Bay11-7082或其药学上可接受的盐；

所述肿瘤为肝癌。

2.一种抗肿瘤的药物组合物，包括泛素结合酶E2抑制剂和溶瘤病毒；

所述溶瘤病毒为M1病毒；

所述泛素结合酶E2抑制剂为Bay11-7082或其药学上可接受的盐；

所述肿瘤为肝癌。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其剂型选自：注射剂、片剂、胶囊、或贴剂。

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