CN111542599A - 编码多种异源抗原的重组非致病性马尔克氏病病毒构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了编码和表达来自三种或更多种禽病毒的外来抗原的新型重组多价非致病性马立克氏病病毒构建体连同使用多价家禽病毒疫苗的方法。

Description

编码多种异源抗原的重组非致病性马尔克氏病病毒构建体
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求在2017年10月12日提交的临时申请美国系列号62/571,524和在2018年9月11日提交的美国系列号62/729,673的优先权，所述临时申请两者的内容以其整体通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及编码和表达来自三种或更多种禽病毒的外来抗原的新型重组多价重组非致病性马立克氏病病毒构建体以及在家禽疫苗中采用这些多价重组非致病性马立克氏病病毒构建体的方法。
发明背景
致病性家禽病毒不仅使鸡虚弱，而且它们还使鸡养殖者损失惨重，因为大多数的所得疾病是传染性的，并且家禽产业严重依赖于封闭的大规模饲养设施。向幼鸡接种疫苗经常是对抗这些病毒的唯一可行方式。尽管减毒或杀死的家禽病毒疫苗仍是市场中重要的，近年来，已花费大量资源用于开发含有表达致病性病毒蛋白抗原的重组病毒构建体的疫苗。此外，已进行大量努力以构建稳定且有效的表达来自多种病毒病原体的外来基因的多价重组非致病性马立克氏病病毒(缩写为rMDVnp)载体。此类多价疫苗将用于使给予小鸡的注射次数最小化，并且由此减少对接种疫苗的小鸡的不适和应激，以及显著降低人工和材料的费用。用此类单一多价构建体接种疫苗还将优于含有多种重组单价rMDVnp构建体的替代的多价rMDVnp疫苗，因为至少迄今为止，这些替代疫苗已导致仅针对单一病毒病原体的保护。此类替代疫苗的失败可能是由于单价rMDVnp构建体之一生长超过其他单价rMDVnp构建体，由此防止这些其他单价rMDVnp构建体诱导显著的免疫应答。在任何情况下，尽管事实上过去大量努力以构建稳定且有效的表达来自多种病毒病原体的外来基因的多价rMDVnp载体，但在超过二十年前已经提示此类疫苗[参见，例如，US 5,965,138]，仅近来，包含编码来自超过一种其他病原体的抗原的重组火鸡疱疹病毒(缩写为rHVT)的多价疫苗已被显示既稳定又有效。
可通过接种疫苗控制的一种家禽病毒疾病是马立克氏病(Marek's disease)。马立克氏病是在全世界不利地影响鸡的致病性疾病。马立克氏病主要发生在2和5月龄之间的幼鸡中。临床体征包括：四肢中的一个或多个的进行性麻痹，由于腿的麻痹导致的动作失调，由于累及翅膀而导致的肢下垂，以及由于累及颈部肌肉而导致的头位置降低。在急性情况下，可产生严重的抑郁。还可发生法氏囊和胸腺萎缩。
马立克氏病的病原体是马立克氏病病毒血清型1 (缩写为MDV1)，一种具有双链DNA基因组的细胞相关病毒。MDV1是嗜淋巴细胞的禽类α疱疹病毒，其：(i) 感染B细胞，这可导致细胞溶解，和(ii) 潜伏地感染T细胞，这可诱导T-细胞淋巴瘤。与毒性MDV1毒株密切相关的马立克氏病病毒血清型2 (缩写为MDV2)，先前称作禽疱疹病毒3，是天然的减毒MDV毒株，其已显示具有极少或没有在鸡中的致病性[Petherbridge等人，J. Virological Methods 158:11-17 (2009)]。SB-1是特定的MDV2毒株，其已显示可用于针对MDV1的疫苗中[参见例如，Murthy和Calnek，Infection and Immunity 26(2) 547-553 (1979)]。
另一种密切相关的α疱疹病毒，马立克氏病病毒血清型3 (缩写为MDV3)，更广泛地称作火鸡疱疹病毒(缩写为HVT)，是驯养火鸡的非致病性病毒[参见例如，Kingham等人，J. of General Virology 82:1123-1135 (2001)]。两种通常使用的HVT毒株是PB1毒株和FC126毒株。尽管HVT在鸡中也是非致病性的，但它确实在鸡中诱导针对MDV1的长期持续的保护性免疫应答。因此，HVT已多年用于针对毒性MDV1的家禽疫苗中，其通常与SB-1组合，所述SB-1比HVT病毒血性更高，但认为其安全性较低。或者，当禽群用特别毒性的MDV1毒株的攻击时，HVT可以与Rispens疫苗(Rispen's vaccine)组合。Rispens疫苗是源自温和毒性MDV1毒株、随后通过细胞传代进一步弱化的分离株。然而，Rispens毒株保留对高易感性鸡品系的某种毒力。
已公开HVT的完整基因组的序列[Afonso等人，J. Virology 75(2):971-978(2001)]，并且如同大多数α疱疹病毒，HVT具有显著数量的潜在的非必需的***位点[参见例如，U.S. 5,187,087；U.S. 5,830,745；U.S. 5,834,305；U.S. 5,853,733；U.S. 5,928,648；U.S. 5,961,982；U.S. 6,121,043；U.S. 6,299,882 B1]。还已显示HVT易于基因修饰，并且因此已多年用作重组载体[WO 87/04463]。因此，已报道重组HVT载体表达编码抗原的外来基因，所述抗原来自，例如，新城疫病毒(NDV) [Sondermeijer等人，Vaccine, 11:349-358 (1993)；Reddy等人，Vaccine, 14:469-477 (1996)]、传染性法氏囊病病毒(IBDV)[Darteil等人，Virology, 211:481-490 (1995)；Tsukamoto等人，J. of Virology 76(11):5637-5645 (2002)]，和传染性喉气管炎病毒(ILTV) [Johnson等人，Avian Disease,54(4):1251-1259 (2010)；WO 92/03554；U.S. 6,875,856]。MDV2的完整基因组序列也是已知的[参见GenBank acc. nr：AB049735.1，和Petherbridge等人，同上]。MDV2的基因组组织非常类似于HVT的基因组组织，并且特别地，US区域与HVT的US区域相同[参见Kingham等人，同上]。
此外，已构建了称作新型禽疱疹病毒(NAHV)的重组嵌合病毒，其中已将HVT基因组的特定区域替换成MDV1基因组的相应区域。NAHV还已用于表达编码来自其他家禽病毒的抗原的外来基因[U.S. 5,965,138；U.S. 6,913,751]。
如同MDV，传染性喉气管炎病毒(缩写为ILTV或ILT)是在全世界不利地影响鸡的α疱疹病毒[Fuchs等人，Veterinary Research 38:261-279 (2007)]。ILTV在鸡中引起急性呼吸道疾病，其特征在于呼吸抑制、喘息和血性渗出物的咳痰。病毒复制限于呼吸道的细胞，其中，在气管中，感染导致组织糜烂和出血。
新城疫是鸡的另一种高度传染性且导致衰弱的疾病。新城疫的病原体是新城疫病毒(NDV)。NDV属于单股反链病毒目(Mononegavirales)，并且在副粘病毒科(Paramyxoviridae)中。新城疫病毒具有不分段的、反义、单链RNA基因组。已根据其毒力，将NDV分组成3个不同的致病型。NDV的非致病性弱毒毒株对家禽的感染是基本上无症状的。与此直接相比，中等毒力(中等致病性)和强毒(高致病性) NDV毒株引起可致命的广泛疾病。大多数类型的NDV感染呼吸***和/或神经***，并可导致喘息和斜颈。
传染性法氏囊病病毒(缩写为IBDV或IBD)，也称作甘布罗病病毒(Gumborodisease virus)，是传染性法氏囊病的病原体。IBDV引起鸡淋巴组织的急性、高度传染性的病毒感染，其中其主要靶标是禽的基本免疫器官：法氏囊。易感禽群中的发病率高，具有快速的体重损失和中等至高的死亡率。因为法氏囊(或其部分)的破坏，从该疾病恢复的小鸡可具有免疫缺陷。这使它们特别易受二次感染的影响。
IBDV是双RNA病毒科(Birnaviridae)的成员。该科中的病毒具有由双链RNA的两个区段(A和B)组成的基因组。存在IBDV的两种血清型，血清型1和2，其可通过病毒中和(VN)测试而区分。血清型1病毒已显示对鸡具有致病性，而血清型2病毒仅在火鸡中引起亚急性疾病。在历史上，IBDV血清型1病毒仅由一种类型组成，其现在称为“经典”IBD病毒。更近来，已出现所谓的“变体”IBDV毒株。IBDV的经典和变体毒株可通过使用一组单克隆抗体的病毒中和测试，或通过RT-PCR而鉴定和区分[Wu等人，Avian Diseases, 51:515-526(2007)]。众所周知的经典IBDV毒株包括D78、Faragher 52/70和STC，而89/03是众所周知的变体毒株。许多活的或灭活的IBDV疫苗是市售的，例如活疫苗，诸如NOBILISR Gumboro D78 (MSDAnimal Health)。
如上所示，因为HVT可以充当提供针对马立克氏病的显著保护的抗原和充当重组载体，目前将其用作平台载体用于多价疫苗，诸如Innovax®-ILT (由Merck Animal Health销售)，其针对ILTV进行保护；Innovax®-ND-SB (由Merck Animal Health销售)、Vectormune® HVT-NDV (由Ceva销售)，其两者均针对NDV进行保护；和Vaxxitek® HVT+IBD(Merial；先前命名为：Gallivac™ HVT-IBD)，和Vectormune™ HVT-IBD (Ceva)，两者均针对IBDV进行保护。值得注意地，Innovax®-ILT包含两个外来基因，即ILTV gD和ILTV gI，其已证明为安全、有效且稳定的。然而，这两个外来基因来自相同的病原体，并且此外，它们天然重叠且需要共表达以允许针对ILTV的正确免疫。更近来，已经公开了包含HVT-ILTV-NDV的重组安全、有效和稳定的多价疫苗[US 8,932,604 B2和U.S. 9,409,954 B2，其内容以其整体通过引用并入本文]。还已经公开了早期的HVT-NDV-IBDV，尽管在开发相应产品期间进行了长时间测试，但发现主要构建体之一HVP309既没有展现足够的遗传稳定性，也没有展现异源***物的持续表达[WO 2013/057,235]。随后，开发了更稳定和有效的构建体[WO2016/102647]。还已经描述了其他重组HVT构建体[参见，例如，US 9,114,108、US 9,555,016、US 9,555,096和US 2018/0163230 A1]。
然而，尽管可以有效表达来自三种或更多种不同病原体的异源抗原的稳定、多价、重组MDVnp构建体具有清楚的优点，以及用于设计它们的大量努力，但迄今为止，没有任何进展。确实，先前构建此类重组MDVnp构建体的不成功的尝试已导致该领域的以下普遍共识：将来自三种或更多种不同的病毒病原体的外来抗原***MDVnp构建体中使该构建体负担过度，导致观察到的稳定性缺乏。因此，当重组MDVnp包含从三种或更多种家禽病毒的独特集合获得的异源抗原的组合时，任何给定的多价重组MDVnp作为疫苗的适当性至多仍然是不可预测的。因此，显然需要通过构建新型、稳定的重组MDVnp载体来克服集体行业失败，所述新型、稳定的重组MDVnp载体可作为唯一活性剂用于多价疫苗中以针对三种或更多种不同的非-MDV1家禽病毒病原体进行保护。
本文中对任何参考文献的引用不应解释为承认此类参考文献可用做本申请的“现有技术”。
发明概述
因此，本发明提供了新型的多价重组非致病性马立克氏病病毒(rMDVnp)，其作为载体使用以表达来自多种病毒病原体的外源基因。在具体实施方案中，所述rMDVnp是重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。在替代实施方案中，所述rMDVnp是重组马立克氏病病毒血清型2 (rMDV2)。本发明的rMDVnp，例如rHVT或rMDV2，可用于针对致病性家禽病毒的安全且有效的多价疫苗中。因此，本发明提供了重组非致病性马立克氏病病毒(rMDVnp)载体(包括HVT载体)，其编码和表达来自三种或更多种外来鸡病毒病原体的抗原。在具体实施方案中，所述rMDVnp编码来自喉气管炎病毒(ILTV)的一种或多种抗原、来自传染性法氏囊病病毒(IBDV)的一种或多种抗原和来自新城疫病毒(NDV)的一种或多种抗原。在更具体实施方案中，此类rMDVnp载体帮助保护鸡接种疫苗者免于由来自致病性MDV、致病性IBDV、致病性NDV和/或致病性ILTV的感染引起的临床体征。所述疫苗优选对于在胚胎的18-19天的健康动物的接种疫苗和日龄小鸡和更大小鸡是有效的。
在具体实施方案中，所述重组非致病性马立克氏病病毒(rMDVnp)在其基因组的一个或多个非必需位点中包含编码来自第一鸡病原体的一种或多种抗原的第一异源核苷酸序列、编码来自第二鸡病原体的一种或多种抗原的第二异源核苷酸序列和编码来自第三鸡病原体的一种或多种抗原的第三异源核苷酸序列。在具体实施方案中，所述第一鸡病原体、所述第二鸡病原体和所述第三鸡病原体都是禽病毒。在更具体实施方案中，所述第一鸡病原体、所述第二鸡病原体和所述第三鸡病原体都是彼此不同的病毒物种，并且是与马立克氏病病毒不同的病毒物种。在该类型的某些实施方案中，所述第一鸡病原体是传染性法氏囊病病毒(IBDV)，所述第二鸡病原体是传染性喉气管炎病毒(ILTV)，且所述第三鸡病原体是新城疫病毒(NDV)。
在具体rMDVnp实施方案中，所述第一异源核苷酸序列编码传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2 (IBDV VP2)；和/或所述第二异源核苷酸序列编码传染性喉气管炎病毒糖蛋白D(ILTV gD)、传染性喉气管炎病毒糖蛋白I (ILTV gI)或ILTV gI和ILTV gD两者；和/或所述第三异源核苷酸序列编码新城疫病毒融合蛋白(NDV F)。在更具体rMDVnp实施方案中，所述第一异源核苷酸序列编码传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2 (IBDV VP2)，所述第二异源核苷酸序列编码传染性喉气管炎病毒糖蛋白D (ILTV gD)和传染性喉气管炎病毒糖蛋白I(ILTV gI)两者，且所述第三异源核苷酸序列编码新城疫病毒融合蛋白(NDV F)。
因此，在本发明的具体rMDVnp实施方案中，所述第一异源核苷酸序列、所述第二异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列位于rMDVnp基因组中的三个不同的非必需位点中。在具体实施方案中，三个不同的位点单独地选自US2位点、UL54.5位点、UL7/8位点、UL40位点、UL43位点、UL45/46位点、UL55位点、US10位点、US10和SORF3之间的区域、US2和SORF3之间的区域、IG1位点、IG2位点和IG3位点。在该类型的具体实施方案中，所述第一非必需位点是US2位点，所述第二非必需位点是UL54.5位点，且所述第三非必需位点是UL45/46位点。
在替代实施方案中，所述第一异源核苷酸序列、所述第二异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列位于rMDVnp基因组中的第一非必需位点中或rMDVnp基因组中的第二非必需位点中。在该类型的具体实施方案中，所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是相同的(即，存在唯一的非必需位点)。在该类型的具体实施方案中，所述唯一的非必需***位点是US2位点。在该类型的其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL54.5位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL7/8位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL40位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL45/46位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL55位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是US10位点。在该类型的还有其他实施方案中，唯一的非必需***位点是US10和SORF3之间的区域。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是US2和SORF3之间的区域。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是IG1位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是IG2位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是IG3位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL43位点。
在还有其他类型的实施方案中，所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是不同的。两个不同的位点单独地选自US2位点、UL54.5位点、UL7/8位点、UL40位点、UL43位点、UL45/46位点、UL55位点、US10位点、US10和SORF3之间的区域、US2和SORF3之间的区域、IG1位点、IG2位点和IG3位点。在具体实施方案中，所述第一异源核苷酸序列和所述第二异源核苷酸序列位于第一非必需位点中，且所述第三异源核苷酸序列位于第二非必需位点中。在其他实施方案中，所述第一异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列位于第一非必需位点中，且所述第二异源核苷酸序列位于第二非必需位点中。在还有其他实施方案中，所述第二异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列位于第一非必需位点中，且所述第一异源核苷酸序列位于第二非必需位点中。在该类型的优选实施方案中，所述第一异源核苷酸序列编码传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2 (IBDV VP2)，所述第二异源核苷酸序列编码传染性喉气管炎病毒糖蛋白D (ILTV gD)、传染性喉气管炎病毒糖蛋白I (ILTV gI)或ILTV gI和ILTV gD两者，且所述第三异源核苷酸序列编码新城疫病毒融合蛋白(NDV F)。
在该类型的某些实施方案中，构建包含第一非必需位点中的编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白和IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列以及第二非必需位点中的编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列的rMDVnp，使得编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列在编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列的5’。在该类型的其他实施方案中，构建rMDVnp，使得编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列在编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列的5’。
在替代实施方案中，构建包含第一非必需位点中的编码NDV F蛋白和IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列以及第二非必需位点中的编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列的rMDVnp，使得编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列在编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列的5’。在该类型的其他实施方案中，构建rMDVnp，使得编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列在编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列的5’。
在还有其他替代实施方案中，构建包含第一非必需位点中的编码NDV F蛋白、ILTVgD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列以及第二非必需位点中的编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列的rMDVnp，使得编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列在编码ILTV gD蛋白和ILTVgI蛋白的异源核苷酸序列的5’。在该类型的替代实施方案中，构建rMDVnp，使得编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列在编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列的5’。
在该类型的具体实施方案中，所述第一非必需位点是US2位点且所述第二非必需位点是UL54.5位点。在替代实施方案中，所述第一非必需位点是UL54.5位点且所述第二非必需位点是US2位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是US2位点且所述第二非必需位点是UL45/46位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是UL45/46位点且所述第二非必需位点是US2位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是UL54.5位点且所述第二非必需位点是UL45/46位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是UL45/46位点且所述第二非必需位点是UL54.5位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是US2位点且所述第二非必需位点是UL55位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是UL55位点且所述第二非必需位点是US2位点。
因此，本发明的rMDVnp载体可以包含编码这些外来蛋白抗原的任何组合的异源核苷酸序列。在具体实施方案中，所述ILTV gD蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在其他实施方案中，所述ILTV gI蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在还有其他实施方案中，所述IBDV VP2蛋白包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。在还有其他实施方案中，所述NDV F蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在还有其他实施方案中，所述NDV F蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。此外，本发明还提供了rMDVnp载体，其包含编码这些氨基酸序列中的一种或多种的核苷酸序列的任何组合，包括编码其中全部的具体实施方案。
在rMDVnp的还有其他实施方案中，所述ILTV gD蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，且所述ILTV gI蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在该类型的某些实施方案中，所述ILTV gD蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述ILTV gI蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，且所述IBDV VP2蛋白包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。在相关实施方案中，所述ILTVgD蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述ILTV gI蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，且所述NDV F蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在类似实施方案中，所述ILTV gD蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述ILTV gI蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，且所述NDV F蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在更具体实施方案中，所述ILTV gD蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述ILTV gI蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，所述IBDVVP2蛋白包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，且所述NDV F蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
在相关实施方案中，所述ILTV gD蛋白由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列编码。在其他实施方案中，所述ILTV gI蛋白由SEQ ID NO: 3的核苷酸序列编码。在还有其他实施方案中，所述IBDV VP2蛋白由SEQ ID NO: 5的核苷酸序列编码。在还有其他实施方案中，所述NDV F蛋白由SEQ ID NO: 7的核苷酸序列编码。在还有其他实施方案中，所述NDV F蛋白由SEQ ID NO: 9的核苷酸序列编码。
类似地，本发明的rMDVnp载体可以包含异源核酸，其包含此类异源核苷酸序列的任何组合。在某些实施方案中，所述rMDVnp包含位于rMDVnp基因组中的第一非必需位点中的第一异源核酸和位于rMDVnp基因组中的第二非必需位点中的第二异源核酸，其中所述第一异源核酸包含第一异源核苷酸序列和第二异源核苷酸序列两者，而所述第二异源核酸包含第三异源核苷酸序列。
在该类型的某些实施方案中，所述第一异源核酸包含编码传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D (gD)蛋白、传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白I (gI)蛋白和传染性法氏囊病病毒(IBDV)病毒蛋白2 (VP2)的异源核苷酸序列，而所述第二异源核酸包含编码新城疫病毒(NDV) F蛋白的异源核苷酸序列。在该类型的某些实施方案中，将所述第一异源核酸构建和/或***rMDVnp基因组中，使得编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列在编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列的5’。在该类型的其他实施方案中，将所述第一异源核酸构建和/或***rMDVnp基因组中，使得编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列在编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列的5’。
在替代实施方案中，所述第一异源核酸包含编码NDV F蛋白和IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列，而所述第二异源核酸包含编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列。在该类型的某些实施方案中，将所述第一异源核酸构建和/或***rMDVnp基因组中，使得编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列在编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列的5’。在该类型的替代实施方案中，将所述第一异源核酸构建和/或***rMDVnp基因组中，使得编码IBDVVP2蛋白的异源核苷酸序列在编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列的5’。
在还有其他替代实施方案中，所述第一异源核酸包含编码NDV F蛋白、ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列，而所述第二异源核酸包含编码IBDV VP2蛋白的异源核苷酸序列。在该类型的某些实施方案中，将所述第一异源核酸构建和/或***rMDVnp基因组中，使得编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列在编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列的5’。在该类型的替代实施方案中，将所述第一异源核酸构建和/或***rMDVnp基因组中，使得编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的异源核苷酸序列在编码NDV F蛋白的异源核苷酸序列的5’。
此外，本发明还提供了编码这些核苷酸序列的任何组合的rMDVnp载体，包括这样的具体实施方案，其中第一异源核酸编码SEQ ID NO:1、3和5的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在替代实施方案中，所述第一异源核酸编码SEQ IDNO:1、3和5的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:9的核苷酸序列。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
在具体实施方案中，rMDVnp的两个不同的非必需位点单独地选自US2位点、UL54.5位点、UL7/8位点、UL40位点、UL 43位点、UL45/46位点、UL55位点、US10位点、US10和SORF3之间的区域、US2和SORF3之间的区域、基因间区域1 (IG1)位点、基因间区域2 (IG2)位点和基因间区域(IG3)。
在某些实施方案中，所述rMDVnp的第一非必需位点是US2位点，而所述rMDVnp的第二非必需位点是除了US2位点以外的非必需位点。在其他实施方案中，所述rMDVnp的第一非必需位点是UL 54.5位点，而所述rMDVnp的第二非必需位点是除了UL 54.5位点以外的非必需位点。在该类型的具体实施方案中，所述第一非必需位点是US2位点且所述第二非必需位点是UL54.5位点。在替代实施方案中，所述第一非必需位点是UL54.5位点且所述第二非必需位点是US2位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是US2位点且所述第二非必需位点是UL45/46位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是UL45/46位点且所述第二非必需位点是US2位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是UL54.5位点且所述第二非必需位点是UL45/46位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是UL45/46位点且所述第二非必需位点是UL54.5位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是US2位点且所述第二非必需位点是UL55位点。在该类型的又另一个实施方案中，所述第一非必需位点是UL55位点且所述第二非必需位点是US2位点。在相关实施方案中，所述rMDVnp的第一非必需位点是UL 54.5位点且所述rMDVnp的第二非必需位点是UL7/8位点。在还有其他实施方案中，所述rMDVnp的第一非必需位点是UL 54.5位点且所述rMDVnp的第二非必需位点是US10位点。在相关实施方案中，所述rMDVnp的第二非必需位点是US2位点且所述rMDVnp的第一非必需位点是UL7/8位点。在还有其他实施方案中，所述rMDVnp的第二非必需位点是US2位点且所述rMDVnp的第一非必需位点是US10位点。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
在该类型的具体实施方案中，所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是相同的(即，存在唯一的非必需位点)。在该类型的具体实施方案中，所述唯一的非必需***位点是US2位点。在该类型的其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL54.5位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL7/8位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL40位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL45/46位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL55位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是US10位点。在该类型的还有其他实施方案中，唯一的非必需***位点是US10和SORF3之间的区域。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是US2和SORF3之间的区域。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是IG1位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是IG2位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是IG3位点。在该类型的还有其他实施方案中，所述唯一的非必需***位点是UL43位点。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白和IBDV VP2蛋白的核苷酸序列可以可操作地在外源启动子(即不是天然见于MDVnp中的启动子)的控制下。在某些实施方案中，这三个核苷酸序列可操作地在不同启动子的控制下，即编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列可操作地在第一启动子的控制下，编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列可操作地在第二启动子的控制下，且编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列可操作地在第三启动子的控制下，其中所述第一启动子、所述第二启动子和所述第三启动子都是不同的。在具体实施方案中，编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gD启动子(即，对于ILTV是内源性的)。在某些实施方案中，编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gI启动子。在该类型的具体实施方案中，编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gD启动子，且用于编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gI启动子。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
在某些实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白、ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白或IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子中的至少一种是鼠巨细胞病毒立即早期(mCMV IE)启动子。在相关实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白、ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白或IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子中的至少一种是人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)启动子或其衍生物(例如，来自毒株AD169)。在其他实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白、ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白或IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子中的至少一种是豚鼠巨细胞病毒立即早期启动子。在其他实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白、ILTVgD蛋白、ILTV gI蛋白或IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子中的至少一种是鸡β-肌动蛋白启动子。在还有其他实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白、ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白或IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子中的至少一种是伪狂犬病病毒(PRV) gpX启动子。
在具体实施方案中，编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子是mCMV IE启动子。在相关实施方案中，编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子是人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)启动子或其衍生物(例如，来自毒株AD169)。在其他实施方案中，编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子是豚鼠巨细胞病毒立即早期启动子。在还有其他实施方案中，编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子是鸡β-肌动蛋白基因启动子。
在某些实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)启动子。在其他实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是伪狂犬病病毒(PRV) gpX启动子。在相关实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是鸡β-肌动蛋白基因启动子。在还有其他实施方案中，可操作地连接至编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是猿猴病毒40 (SV40)启动子。
在更具体实施方案中，编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子是mCMV IE启动子，编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gD启动子，编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gI启动子，且编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是hCMV IE启动子。在其他具体实施方案中，编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子是hCMVIE启动子(或其衍生物)，编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gD启动子，编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gI启动子，且编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是hCMV IE启动子。在还有其他具体实施方案中，编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子是鸡β-肌动蛋白启动子，编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gD启动子，编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是内源性ILTV gI启动子，且编码NDV F蛋白的核苷酸序列的启动子是hCMV IE启动子。
在某些实施方案中，本发明的包括编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白和IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的***的rMDVnp还包括一个或多个外源性转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，转录终止子序列在编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的下游。在具体实施方案中，编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的核苷酸序列共享一个转录终止子序列，且编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列具有另一个转录终止子序列。在更具体实施方案中，所述转录终止子序列中的至少一个包含猫疱疹病毒US-9 (FHV US-9)多腺苷酸化序列。在甚至更具体实施方案中，所述转录终止子序列中的至少一个包含猿猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化序列。
在某些实施方案中，所述NDV F蛋白还包括一个或多个外源性转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，转录终止子序列在编码NDV F蛋白的核苷酸序列的下游。在相关实施方案中，所述转录终止子序列中的至少一个包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)多腺苷酸化序列。在替代实施方案中，所述转录终止子序列中的至少一个包含人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)多腺苷酸化序列。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
本发明还提供了rMDVnp，其在rMDVnp基因组的UL54.5位点中包含(i) mCMV IE启动子、鸡β-肌动蛋白基因启动子或hCMV启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列，(iv) ILTV gD启动子，(v) ILTV gD蛋白的编码序列，(vi) ILTV gI启动子，和(vii) ILTV gI蛋白的编码序列。在该类型的具体实施方案中，SEQ ID NO:21的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的UL54.5位点内。在具体实施方案中，所述rMDVnp在其基因组的US2位点中进一步包含(i) hCMV IE启动子，(ii) NDV F蛋白的编码序列和(iii) hCMV IE转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，SEQ ID NO:22的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的US2位点内。
本发明进一步提供了rMDVnp，其在rMDVnp基因组的US2位点中包含(i) mCMV IE启动子、鸡β-肌动蛋白基因启动子或hCMV启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列，(iv) ILTV gD启动子，(v) ILTV gD蛋白的编码序列，(vi) ILTV gI启动子，和(vii) ILTV gI蛋白的编码序列。在该类型的某些实施方案中，SEQ ID NO:24的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的US2位点内。在该类型的还有其他实施方案中，SEQ ID NO:25的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的US2位点内。在该类型的更具体实施方案中，SEQ ID NO:23的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的US2位点内。在具体实施方案中，所述rMDVnp在其基因组的UL54.5位点中进一步包含(i) hCMV IE启动子，(ii) NDV F蛋白的编码序列和(iii)hCMV IE转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，SEQ ID NO:26的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的UL54.5位点内。
此外，本发明还提供了rMDVnp，其在rMDVnp基因组的UL54.5位点中包含(i) ILTVgD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，(iv) ILTV gI蛋白的编码序列，(v) hCMV IE启动子，(vi) NDV F蛋白的编码序列和(vii) hCMV IE转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，SEQ ID NO:31的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的UL54.5位点内。在具体实施方案中，所述rMDVnp在rMDVnp基因组的US2位点内进一步包含(i) mCMVIE启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，和(iii)转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，SEQ ID NO:32的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的US2位点内。
本发明还提供了rMDVnp，其在rMDVnp基因组的US2位点中包含(i) ILTV gD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，(iv) ILTV gI蛋白的编码序列，(v)hCMV IE启动子，(vi) NDV F蛋白的编码序列和(vii) hCMV IE转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，SEQ ID NO:28的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的US2位点内。在具体实施方案中，所述rMDVnp在rMDVnp基因组的UL54.5位点内进一步包含(i) mCMV IE启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，和(iii)转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，SEQ ID NO:27的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的UL54.5位点内。
本发明进一步提供了rMDVnp，其在rMDVnp基因组的US2位点中包含(i) mCMV IE启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列，(iv) hCMV IE启动子，(v)NDV F蛋白的编码序列和(vi) hCMV IE转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，SEQID NO:30的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的US2位点内。在具体实施方案中，所述rMDVnp进一步包含(i) ILTV gD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，和(iv) ILTV gI蛋白的编码序列，其包含在其基因组的UL54.5位点内。在该类型的具体实施方案中，SEQ ID NO:29的核苷酸序列包含在rMDVnp基因组的UL54.5位点内。
本发明还提供了rMDVnp，其在rMDVnp基因组的UL54.5位点中包含(i) mCMV IE启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列，(iv) hCMV IE启动子，(v) NDVF蛋白的编码序列和(vi) hCMV IE转录终止子序列。在具体实施方案中，所述rMDVnp进一步包含(i) ILTV gD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，和(iv)ILTV gI蛋白的编码序列，其包含在其基因组的US2位点内。
本发明还提供了rMDVnp，其包含rMDVnp基因组的US2位点中的(i) mCMV IE启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列，(iv) hCMV IE启动子，(v) NDV F蛋白的编码序列和(vi) hCMV IE转录终止子序列，以及其基因组的UL7/8位点内包含的(i)ILTV gD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，和(iv) ILTV gI蛋白的编码序列。
在更具体实施方案中，本发明提供了rHVT，其包含第一异源核酸和第二异源核酸。所述第一异源核酸包含(i)鼠巨细胞病毒立即早期(mCMV IE)启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列，(iv) ILTV gD启动子，(v) ILTV gD蛋白的编码序列，(vi) ILTV gI启动子，和(vii) ILTV gI蛋白的编码序列。在该类型的具体实施方案中，该重组核酸的核苷酸序列的特定5’至3’顺序是(i)–(vii)。在一个更具体实施方案中，所述转录终止子序列包含SV40多腺苷酸化序列。在该类型的一个甚至更具体实施方案中，所述第一异源核酸位于rHVT基因组的US2位点中。所述第二异源核酸包含重组核酸，其以5'至3'方向以以下顺序包含(i)人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)启动子，(ii) NDV F蛋白的编码序列，和(iii)转录终止子序列。在一个更具体实施方案中，所述转录终止子序列包含人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)多腺苷酸化序列。在该类型的更具体实施方案中，所述第二异源核酸位于rHVT基因组的UL54.5位点中。
因此，本发明包括重组HVT (rHVT)，其包含两个异源核酸，其各自***HVT基因组的分开的非必需位点中。在某些实施方案中，所述第一异源核酸包含(i)鼠巨细胞病毒立即早期(mCMV IE)启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列，(iv) ILTVgD启动子，(v) ILTV gD蛋白的编码序列，(vi) ILTV gI启动子，和(vii) ILTV gI蛋白的编码序列。在该类型的具体实施方案中，该重组核酸的核苷酸序列的特定5’至3’顺序是(i)–(vii)。所述第二异源核酸以以下5'至3'顺序包含(i)人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)启动子，(ii) NDV F蛋白的编码序列，和(iii)转录终止子序列。在具体实施方案中，将所述第一异源核酸***US2位点，并且将所述第二异源核酸***UL54.5位点。在该类型的具体实施方案中，所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQID NO:26的核苷酸序列。在替代实施方案中，将所述第二异源核酸***US2位点，并且将所述第一异源核酸***UL54.5位点。在该类型的某些实施方案中，所述第一异源核酸包含SEQID NO:21的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
在其他实施方案中，所述第一异源核酸包含(i)鼠巨细胞病毒立即早期(mCMV IE)启动子，(ii) IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列，(iv)人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)启动子，(v) NDV F蛋白的编码序列，和(vi)转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，该重组核酸的核苷酸序列的特定5’至3’顺序是(i)–(vi)。所述第二异源核酸以以下5'至3'顺序包含(i) ILTV gD启动子，(ii) ILTV gD蛋白的编码序列，(iii) ILTVgI启动子，和(iv) ILTV gI蛋白的编码序列。在具体实施方案中，将所述第一异源核酸***US2位点，并且将所述第二异源核酸***UL54.5位点。在具体实施方案中，所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列。在替代实施方案中，将所述第二异源核酸***US2位点，并且将所述第一异源核酸***UL54.5位点。
在还有其他实施方案中，所述第一异源核酸包含(i) ILTV gD启动子，(ii) ILTVgD蛋白的编码序列，(iii) ILTV gI启动子，(iv) ILTV gI蛋白的编码序列，(v)人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)启动子，(vi) NDV F蛋白的编码序列，和(vii)转录终止子序列。在该类型的具体实施方案中，该重组核酸的核苷酸序列的特定5’至3’顺序是(i)–(vii)。所述第二异源核酸以以下5'至3'顺序包含(i)鼠巨细胞病毒立即早期(mCMV IE)启动子，(ii)IBDV VP2蛋白的编码序列，(iii)转录终止子序列。在具体实施方案中，将所述第一异源核酸***US2位点，并且将所述第二异源核酸***UL54.5位点。在该类型的具体实施方案中，所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列。在替代实施方案中，将所述第二异源核酸***US2位点，并且将所述第一异源核酸***UL54.5位点。在该类型的具体实施方案中，所述第一异源核酸包含SEQ IDNO:31的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列。
本发明进一步提供了用于制备本发明的任何rMDVnp (例如，rHVT)的方法。在某些实施方案中，构建第一异源核酸以包含编码ILTV gD蛋白的核苷酸序列、编码ILTV gI蛋白的核苷酸序列和编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列。在该类型的具体实施方案中，分别编码ILTV gD蛋白和ILTV gI蛋白的核苷酸序列的启动子是它们相应的内源性启动子。在相关实施方案中，编码IBDV VP2蛋白的核苷酸序列的启动子是mCMV IE启动子、鸡β-肌动蛋白基因启动子或hCMV启动子。
然后将所述第一异源核酸***本发明的rMDVnp的非必需位点。在某些实施方案中，所述第一异源核酸是表达盒。在该类型的具体实施方案中，所述表达盒包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列。
所述方法可以进一步包括所构建的第二异源核酸，其也被***rMDVnp的非必需位点。在具体实施方案中，所述第二异源核酸包含人巨细胞病毒立即早期(hCMV IE)启动子、NDV F蛋白的编码序列和转录终止子序列。在某些实施方案中，所述第二异源核酸是表达盒。在该类型的具体实施方案中，所述表达盒包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列。在具体实施方案中，将所述第一异源核酸***rMDVnp的第一非必需位点，且将所述第二异源核酸***rMDVnp的第二非必需位点。在某些实施方案中，所述rMDVnp的第一非必需位点是UL 54.5位点。在相关实施方案中，所述rMDVnp的第二非必需位点是US2位点。在替代实施方案中，所述rMDVnp的第一非必需位点是US2位点且所述rMDVnp的第二非必需位点是UL 54.5位点。在该类型的具体实施方案中，所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。在该类型的其他实施方案中，所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:24的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。在该类型的还有其他实施方案中，所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。在某些实施方案中，制备rMDVnp的方法是制备rHVT的方法。在替代实施方案中，制备rMDVnp的方法是制备rMDV2的方法。
因此，在一个方面，本发明提供了包含本发明的rMDVnp (例如，rHVT)的免疫原性组合物和/或疫苗。在具体实施方案中，这些免疫原性组合物和/或疫苗是稳定的，安全的，并且具有相对强的抗原表达和/或效力。可替代地或另外，在将包含本发明的rMDVnp的免疫原性组合物和/或疫苗施用于鸡后，所述免疫原性组合物和/或疫苗帮助针对由ILTV和/或IBDV和/或NDV和/或MDV1引起的疾病保护鸡。
本发明进一步提供了免疫原性组合物和/或疫苗，其包含本发明的任何rMDVnp (例如，rHVT)，其与额外的IBDV、ILTV、NDV和/或MDV抗原进一步组合以改进和扩展提供的免疫原性。在该类型的一个具体实施方案中，所述抗原是减毒或轻度活变体IBDV(例如，IBDV89/03)。在该类型的另一个具体实施方案中，所述抗原是减毒(或轻度活)新城疫病毒(NDV)，例如NDV C2。在该类型的又另一个具体实施方案中，所述抗原是减毒的马立克氏病病毒，例如SB1。此外，本发明还提供了免疫原性组合物和/或疫苗，其包含本发明的任何rMDVnp，其进一步编码除了MDV、ILTV或NDV以外的病原体的抗原。
本发明还提供了用于通过将此类疫苗和/或免疫原性组合物施用于家禽受试者(例如，施用于鸡)来帮助针对由ILTV和/或IBDV和/或NDV和/或MDV1引起的疾病保护家禽的方法。在该类型的具体实施方案中，本发明的疫苗是皮下施用的。在其他实施方案中，本发明的疫苗是卵内施用的。
本发明的这些和其他方面将参考以下附图和详述而被更好理解。
附图简述
图1是用于产生如以下实施例2中所述的HVT/IBDV/ILTV/NDV构建体的***片段的示意图。简言之，这是HVT基因组的示意图，所述HVT基因组由两个独特区域(其各自侧接重复区域)以及重构HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14病毒所需的克隆片段组成。***的基因盒(mIE-IBDV-vp2和ILTV-gD/gI或hIE-NDV-F)相对于中断基因(UL54.5或US2)的方向以及侧接基因显示于放大区域中。图例：TRL：末端重复长区域，UL：独特长区域；IRL：内部重复长区域，IRS：内部重复短区域；US：独特短区域；TRS：末端重复短区域。
图2是用于产生HVT/IBDV/ILT/NDV构建体#2的***片段的示意图。两个HVT***位点是UL54.5和US2。[还参见上面图1的描述]。
图3是用于产生HVT/IBDV/ILT/NDV构建体#3的***片段的示意图。两个HVT***位点是UL54.5和US2。[还参见上面图1的描述]。
图4是用于产生HVT/IBDV/ILT/NDV构建体：#4的***片段的示意图。两个HVT***位点是UL54.5和US2。[还参见上面图1的描述]。
图5是用于产生HVT/IBDV/ILT/NDV构建体#5的***片段的示意图。两个HVT***位点是UL54.5和US2。[还参见上面图1的描述]。
发明详述
本发明克服了先前的失败以便能够构建编码和表达来自三种或更多种外来致病性鸡病毒的抗原的单一rMDVnp载体。在具体实施方案中，本发明的rMDVnp编码和表达来自禽病毒中的三种或更多种的外来抗原蛋白。在具体实施方案中，所述禽病毒是新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)和传染性法氏囊病(IBDV)。此类rMDVnp载体可用于疫苗和/或免疫原性组合物中，所述疫苗和/或免疫原性组合物帮助针对马立克氏病、传染性法氏囊病(甘布罗病)、传染性喉气管炎病毒和/或新城疫病毒进行保护。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。本发明进一步提供了免疫原性组合物和/或疫苗，其包含本发明的任何rMDVnp，其与额外的IBDV、ILTV、NDV和/或MDV抗原和/或来自除了MDV、ILTV、NDV或IBDV以外的鸡病原体的一种或多种抗原组合。在完全不同的方面，编码和表达来自NDV、ILTV、IBDV的外来抗原的重组载体不是rMDVnp，而是嵌合马立克氏病病毒，其含有替换其在HVT载体(例如，新型禽疱疹病毒(NAHV))中的对应物的来自MDV1的指定基因组序列[参见，例如，US 6,913,751]。
在本发明之前，已构建含有***US10区域中的NDV基因的HVT载体。这种HVT-NDV载体显示是稳定的并且表达足够水平的对应的NDV基因产物，NDV F蛋白，以针对毒性NDV攻击保护接种疫苗的鸡。此外，已构建含有***HVT UL54.5区域中的一对ILTV基因的HVT载体。这种HVT-ILTV载体显示是稳定的并且表达足够水平的对应的ILTV基因产物，ILTV gI和gG蛋白，以针对毒性ILTV攻击病毒保护接种疫苗的鸡。更近来，还已报道了其他多价构建体。
更具体地，基于成功的构建体设计针对NDV和ILTV两者进行保护的多价HVT构建体，所述成功的构建体包含在US10位点中的NDV-F基因的***以及在单独构建体中的UL54.5位点中的ILTV gD和gI基因的***[参见，US 8,932,604 B2]。然而，预想不到地，此多价构建体在组织培养物中传代后，所述重组病毒丧失其表达ILTVgD、ILTVgI和NDV F蛋白的能力。用多种重复的重组HVT构建体证明确实如此。实际上，这些重组病毒是不稳定的且不适合用于进一步开发作为疫苗。这些发现表明设计可以稳定表达NDV F蛋白以及ILTVgD和ILTVgI蛋白两者的单一多价rHVT载体不是可以从现有信息外推的简单过程。实际上，如果此类稳定且有效的多价rHVT载体是完全可能的，则它们的设计需要下述前提，最小限度地涉及所使用的***位点和待***的外源核苷酸基因之间的关系的预想不到的一组复杂相互作用。因此，rHVT构建体的设计从现有技术仍然是不可预测的。对于编码来自三种或更多种禽病毒病原体的异源抗原的rMDVnp，这似乎是甚至更大的问题。
尽管上面概述了明显的困难，并且在本领域中的普遍共识是，将来自三种或更多种不同病毒病原体的外源抗原***MDVnp构建体中使得该构建体负担过度，导致缺乏稳定性，但本发明令人惊讶地提供了稳定的重组MDVnp载体，其中来自ILTV的两个基因(来自IBDV的一个基因和来自NDV的一个基因)已***单一MDVnp中。因此，这种单一rMDVnp构建体可以用作疫苗中的唯一活性剂，其帮助针对四种主要致病性家禽病毒进行保护。
在本发明的具体实施方案中，将编码四种外来抗原的核苷酸序列***单一HVT的基因组的一个或多个非必需区域中。因此，这种重组HVT载体应当能够用于提供针对MDV、NDV、IBDV和ILTV感染的保护。先前，多种不同的rHVT载体对于针对这四种可以干扰彼此的抗原性的病毒进行保护是必要的。
因此，本发明优于现有方法，因为本发明应当能够通过仅用单一的重组MDVnp接种家禽和/或家禽卵而提供针对MDV、NDV、IBDV和ILTV感染的同时保护。具体而言，这允许经由卵内途径施用额外的疫苗，因为多少体积可注射至卵内存在限制，并且进一步节约了制造成本，因为仅需要一个而不是两个载体。
此外，本发明包括在相同疫苗和/或免疫原性组合物中包含不同rMDVnp构建体的实施方案。在该类型的某些实施方案中，所述疫苗和/或免疫原性组合物包含rMDV2和rHVT两者，其各自编码一种或多种外来抗原。实际上，不同于不可避免地导致一种构建体生长显著超出另一种构建体的两种rHVTs的组合，已报道将rHVT与rMDV2组合并不导致显著的生长过度。因此，在具体实施方案中，本发明的疫苗包含编码ILTV gD蛋白、ILTV gI蛋白、IBDV VP2蛋白和NDV F蛋白的rHVT，和编码又另一种家禽病毒抗原的rMDV2。迄今为止，尚未显示rMDVnp编码和表达来自三种不同的家禽病毒的外来抗原，并且仍保持稳定，以及能够表达足够水平的相应抗原，用于针对用相应三种病毒的毒性攻击以及针对毒性MDV保护接种疫苗的鸡。
因此，本发明提供了包含本发明的任何rMDVnp的免疫原性组合物和/或疫苗。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。此外，本发明提供了通过施用本发明的此类疫苗和/或免疫原性组合物而帮助针对由ILTV和/或IBDV和/或NDV和/或MDV1引起的疾病保护家禽(且在某些实施方案中进行保护)的方法。在具体实施方案中，所述家禽受试者是鸡。在该类型的具体实施方案中，本发明的疫苗是皮下施用的。在其他实施方案中，本发明的疫苗是卵内施用的。在优选实施方案中，本发明的rMDVnp疫苗是既安全、稳定又有效的。
为了更完全地理解本发明，提供以下定义。
为了便于描述而使用的单数术语决非意欲如此限定。因此，例如，提及包含“多肽”的组合物包括提及此类多肽中的一种或多种。
如本文所用，“非致病性马立克氏病病毒”或“MDVnp”或“npMDV”是显示在家禽中几乎没有或没有致病性的MDV家族中的病毒。术语“MDVnp”包括已经传代或以其他方式类似操作的天然存在的MDV，但不包括其中一种MDV血清型的基因组的特定区域被替换成不同MDV血清型的对应区域以形成嵌合病毒的病毒构建体，例如新型禽疱疹病毒(NAHV)。在某些实施方案中，所述MDVnp是HVT。在其他实施方案中，所述MDVnp是MDV2。在该类型的具体实施方案中，所述MDV2是SB1。
如本文所用，已经基因修饰以编码异源核苷酸序列(例如外来基因)的MDVnp被定义为“重组MDVnp”或“rMDVnp”。术语“rMDVnp”包括已经基因修饰以编码异源核苷酸序列的天然存在的MDVnp，但不包括其中一种MDV血清型的基因组的特定区域被替换成不同MDV血清型的对应区域以形成嵌合病毒的病毒构建体，例如新型禽疱疹病毒(NAHV)。
如本文所用，“新型禽疱疹病毒”(“NAHV”)是重组嵌合病毒，其包含在火鸡病毒的疱疹病毒(HVT)中天然存在的独特长病毒基因组区域和在马立克氏病1 (MDV1)中天然存在的独特短病毒基因组区域[参见，U.S.5,965,138，U.S. 6,183,753，U.S. 6,913,751 B2]。在一个优选实施方案中，所述NAHV包含在火鸡病毒的疱疹病毒(HVT)中天然存在的独特长病毒基因组区域，在马立克氏病1 (MDV1)中天然存在的独特短病毒基因组区域以及HVT的重复病毒区域[参见，U.S. 6,913,751 B2]。
如本文所用，“非必需位点”是MDVnp基因组中(或者可替代地在NAVH基因组中)的位点，其中在该位点中***异源核苷酸序列不阻止MDVnp(或NAVH)在宿主细胞中复制。非必需位点通常通过其所在的开放阅读框鉴定，例如，US2位点，或两个开放阅读框之间的区域，例如UL7/8位点。术语“非必需位点”的使用绝不意欲甚至表明在给定的开放阅读框的核苷酸序列中(或在两个开放阅读框之间的区域中)仅存在单一的独特核苷酸位置，其中为了使MDVnp (或NAVH)维持其在宿主细胞中复制的能力，必须进行异源核酸的***。
如本文所用，当rMDVnp (或NAHV)被称为包含“***”rMDVnp基因组(或NAHV基因组)中的非必需位点中的给定核酸时，其意味着给定核酸是位于MDVnp (或NAHV)的非必需位点中的异源核酸。因此，包含***rMDVnp基因组中的第一非必需位点中的第一核酸和***rMDVnp基因组中的第二非必需位点中的第二核酸的rMDVnp等同于包含位于rMDVnp基因组中的第一非必需位点中的第一异源核酸和位于rMDVnp基因组中第二非必需位点中的第二异源核酸的rMDVnp，且反之亦然。
如本文所用，术语“家禽”可包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和野鸡。
如本文所用，“疫苗”是适合应用于动物(在某些实施方案中，包括人，而在其他实施方案中特异性地不用于人)的组合物，其包含通常与药学上可接受的载体、诸如含水液体组合的一种或多种抗原，其在施用于所述动物后诱导免疫应答，其强度足以最小程度地帮助保护免于由野生型微生物感染引起的疾病，即强度足以帮助预防疾病，和/或预防、改善或治愈所述疾病。
如本文所用，术语“帮助保护”不需要完全保护免于任何感染指征。例如，“帮助保护”可以意指保护是充足的，使得在攻击后，至少减少基本感染的症状，和/或减少和/或消除引起所述症状的基本的细胞、生理或生物化学原因或机理中的一种或多种。应理解，如本上下文中所用的“减少”意指相对于感染的状态，包括感染的分子状态，不仅是感染的生理状态。
本发明的疫苗包含至少一种本发明的稳定的rMDVnp。当在从原始储备物至少10次组织培养传代后，或在从接种疫苗的禽类重新分离病毒后，检查的病毒噬斑的至少90%对于***的外来抗原的表达阳性(如免疫荧光测定中对于表达的蛋白特异性的抗体的结合所表明)时，rMDVnp被认为表型稳定的。
本发明的疫苗也是有效的，并且优选地最小程度地提供针对NDV的至少70%保护，和/或针对IBDV的至少70%保护，和/或针对ILTV的至少70%保护，和/或针对MDV的至少60%保护，以免于与疾病相关的临床体征或病变。更优选地，所述疫苗最小程度地提供针对NDV的至少80%保护，针对IBDV的至少80%保护，针对ILTV的至少80%保护，和针对MDV的至少70%保护，以免于与疾病相关的临床体征或病变。甚至更优选地，所述疫苗遵循USDA确立且在联邦法规标题9法规，部分113(9CFR 113)«动物产品标准要求»中编纂的以下指南以获得许可：活病毒疫苗，在NDV、IBDV和ILTV的情况下，必须提供至少90%保护，且在MDV的情况下，提供至少80%保护，以免于与疾病相关的临床体征或病变。
如本文所用，“多价疫苗”是包含两种或更多种不同抗原的疫苗。在该类型的具体实施方案中，所述多价疫苗针对两种或更多种不同的病原体刺激受体的免疫***。
如本文所用，“佐剂”是这样的物质，其能够有利于或扩增免疫事件的级联，最终导致更好的免疫应答(即对抗原的完整身体应答)。佐剂通常不是免疫应答发生所需的，但有利于或扩增这种应答。
如本文所用，术语“药学上可接受的”作为形容词使用，意指所修饰的名词适合用于药物产品中。当使用该术语，例如描述药用疫苗中的赋形剂时，它表征了该赋形剂与组合物中的其他成分相容，并且没有不利地对预期的受体有害。
如本文所用，“全身性施用”是施用至身体的循环***(包括心血管和淋巴***)中，因此影响全身，而不是特定的部位，诸如胃肠道(经由，例如口服或直肠施用)和呼吸***(经由例如鼻内施用)。全身性施用可以例如通过，施用至肌肉组织(肌肉内)，真皮中(皮内或经皮)，皮肤下面(皮下)，粘膜下面(粘膜下)，静脉中(静脉内)等进行。
如本文所用，术语“胃肠外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌肉内注射、皮内注射和输注。
术语“近似”与术语“约”可互换使用，并且表示值在指示值的25%之内，即含有“近似”100个氨基酸残基的肽可含有75和125个之间的氨基酸残基。
如本文所用，术语“多肽”与术语“蛋白”和“肽”可互换使用，并且表示包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的聚合物。如本文所用的术语“多肽”包括重要的片段或区段，并且涵盖至少约8个氨基酸，通常至少约12个氨基酸，通常至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，并且，在特别优选的实施方案中，至少约30或更多个氨基酸，例如35、40、45、50个等的氨基酸残基的延伸段。此类片段可具有末端，其开始和/或终止于几乎所有的位置，例如开始于残基1、2、3等，并且终止于例如155、154、153等，其呈所有可行的组合。
任选地，多肽可缺乏由基因或由mRNA编码的某些氨基酸残基。例如，基因或mRNA分子可编码从最终蛋白切割且因此不是最终蛋白的一部分的多肽的N-末端上的氨基酸残基的序列(即，信号序列)。
如本文所用，关于具体蛋白(例如，蛋白抗原)的术语“抗原性片段”是该蛋白的片段(包括从全长蛋白缺失少至单个氨基酸的大片段)，其为抗原性的，即能够特异性地与免疫***的抗原识别分子(诸如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)相互作用。例如，IBDVVP2蛋白的抗原性片段是VP2蛋白的抗原性的片段。优选地，本发明的抗原性片段对于抗体和/或T细胞受体识别是免疫优势的。在具体实施方案中，关于给定蛋白抗原的抗原性片段是保留全长蛋白的抗原性的至少25%的该蛋白的片段。在优选实施方案中，抗原性片段保留全长蛋白的抗原性的至少50%。在更优选的实施方案中，其保留全长蛋白的抗原性的至少75%。抗原性片段可以小至5-10个氨基酸，或者在其他极端，是从全长蛋白缺失少至单个氨基酸的大片段。在具体实施方案中，所述抗原性片段包含25至100个氨基酸残基。
如本文所用，如果两个氨基酸序列是相同的，和/或区别仅在于如下文定义的中性或保守取代，则氨基酸序列与第二氨基酸序列是100%“同源的”。因此，如果两个氨基酸序列的约80%是相同的，和/或区别仅在于中性或保守取代，则氨基酸序列与第二氨基酸序列是80%“同源的”。
经常可以用功能上等效的氨基酸残基取代序列中的残基，产生保守的氨基酸取代。此类改变定义如本文所用的术语“保守取代”。例如，在序列内的一个或多个氨基酸残基可以由充当功能等效物的具有类似极性的另一种氨基酸取代，导致沉默的改变。序列内的氨基酸的取代物可以选自所述氨基酸所属类型的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期此类改变不影响通过聚丙酰胺凝胶电泳测定的表观分子量，或等电点。
特别优选的保守取代是：用Lys取代Arg且反之亦然，使得可维持正电荷；用Glu取代Asp且反之亦然，使得可维持负电荷；用Ser取代Thr，使得可维持游离-OH；和用Gln取代Asn，使得可维持游离NH2。氨基酸还可以置于以下相似性组中：(1) 脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸；(2) 谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸；(3)组氨酸、赖氨酸和精氨酸；(4) 半胱氨酸；(5) 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸；和(6) 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
在一个相关实施方案中，可通过其本身的同源性或它们编码的氨基酸的同源性鉴定两个高度同源的DNA序列。可使用在序列数据库中可得的标准软件进行此类序列比较。在一个具体实施方案中，两个高度同源的DNA序列编码具有约80%同一性，更优选约90%同一性，且甚至更优选约95%同一性的氨基酸序列。更具体地，两个高度同源的氨基酸序列具有约80%同一性，甚至更优选约90%同一性，且甚至更优选约95%同一性。
如本文所用，可使用软件，诸如由Accelrys (Burlington, Massachusetts)市售的MacVector v9，和具有比对默认参数以及用于同一性的默认参数的Clustal W算法，测定蛋白和DNA序列同一性百分比。参见例如，Thompson等人，1994. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680。可从，例如EMBLI，欧洲生物信息研究所，自由下载用于Dos、Macintosh和Unix平台的ClustalW。本下载链接可见于http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。这些和其他可得程序也可用于使用相同或类似的默认参数测定序列相似性。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”可互换使用，并且表示包含核苷酸的分子，包括但不限于，RNA、cDNA、基因组DNA和甚至合成DNA序列。还预期该术语涵盖包括任何本领域已知的DNA和RNA的碱基类似物的核酸分子。
核酸“编码序列”或特定蛋白或肽的“编码序列”是在置于适当的调节元件控制下时，在体外或体内转录并翻译成多肽的核苷酸序列。
通过在5'-末端的起始密码子和在3'-末端的翻译终止密码子确定编码序列的边界。编码序列可包括但不限于，原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如禽) DNA的基因组DNA序列，和甚至合成DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3'。
“可操作地连接”是指元件的排列，其中如此描述的组分经配置以便执行其通常功能。因此，可操作地连接至编码序列的控制元件能够影响所述编码序列的表达。所述控制元件不需要与编码序列连续，只要它们发挥功能以指导其表达。因此，例如，在启动子和编码序列之间可存在间插的非翻译但转录的序列，并且所述启动子仍可以被视为与所述编码序列“可操作地连接”。
如本文所用，术语“转录终止子序列”与术语“多腺苷酸化调节元件”可互换使用，并且是通常在DNA编码区域下游且可以是该DNA编码序列的转录的完全终止所需的序列。转录终止子是参与终止编码区域转录为RNA的调节性DNA元件。通常，这种元件编码区段，例如发夹结构，其具有可以引起RNA聚合酶复合物停止转录的二级结构。因此，转录终止子总是位于来自待翻译的区域的终止密码子的下游，3'非翻译区。
如本文所用，“表达盒”是最小程度地包含启动子和与该启动子可操作地连接的异源编码序列的重组核酸。在许多此类实施方案中，所述表达盒进一步包含转录终止子序列。因此，将表达盒***rMDVnp基因组的非必需位点将导致由所述rMDVnp表达所述异源编码序列。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
如本文所用的“异源核苷酸序列”是通过重组方法添加至本发明的核苷酸序列以形成在自然界中没有天然形成的核酸的核苷酸序列。在具体实施方案中，本发明的“异源核苷酸序列”可以编码蛋白抗原(例如，由相对于本发明的rMDVnp载体的“外源基因”编码)，诸如IBDV VP2蛋白、ILTV gI蛋白、ILTV gD蛋白和/或NDV F蛋白。在该情况下，此类蛋白抗原可以被称为“外来抗原”或更具体地“外来蛋白抗原”。
异源核苷酸序列还可以编码融合(例如，嵌合)蛋白。此外，异源核苷酸序列可编码含有调节和/或结构特性的肽和/或蛋白。在其他此类实施方案中，异源核苷酸序列可编码这样的蛋白或肽，其作为在表达所述重组核酸后检测由本发明的核苷酸序列编码的蛋白或多肽的工具而发挥功能。在又另一个实施方案中，所述异源核苷酸序列可作为检测本发明的核苷酸序列的工具发挥功能。异源核苷酸序列可包含非编码序列，包括限制性位点、调节位点、启动子等。“异源核酸”包含异源核苷酸序列。
当核酸和载体两者的末端包含相容的限制性位点时，容易完成编码本发明的抗原的核酸向rMDVnp载体中的***。如果这不能进行，则有必要通过如下修饰核苷酸序列和/或载体的末端：向后降解由限制性内切酶切割产生的单链核酸突出端(例如，DNA突出端)以产生平末端，或通过用适当的聚合酶填充单链末端来达到相同的结果。或者，可例如通过将核苷酸序列(接头)连接至末端上而产生期望的位点。此类接头可包含限定期望的限制性位点的特异性寡核苷酸序列。还可以通过使用聚合酶链式反应(PCR)产生限制性位点。[参见例如，Saiki等人，Science 239:487-491 (1988)]。如果需要，还可以通过同聚化加尾修饰切割的载体和DNA片段。或者，可以从头合成重组核苷酸序列。
蛋白抗原和编码蛋白抗原的核酸
ILTV gD基因看起来编码长度为434个氨基酸、具有48,477道尔顿的分子量的糖蛋白，尽管其他人已提出导致仅包含377个氨基酸残基的ILTV gD蛋白的下游起始密码子才是实际的起始密码子[Wild等人，Virus Genes 12:104-116 (1996)]。ILTV gI基因编码长度为362个氨基酸、具有39,753道尔顿的分子量的糖蛋白[U.S. 6,875,856，通过引用并入本文]。可以将由编码ILTV gD和ILTV gI的天然和/或实验室来源的变体的核酸取代为本发明例举的那些。
在本发明的具体实施方案中，rMDVnp包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQID NO:2的氨基酸序列的ILTV gD蛋白，或其抗原性片段。在相关实施方案中，所述rMDVnp包含编码ILTV gD蛋白的重组核酸，所述ILTV gD蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有大于90%、和/或大于95%、和/或大于98%、和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述ILTV gD蛋白由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
在本发明的某些实施方案中，rMDVnp包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQID NO:4的氨基酸序列的ILTV gI蛋白，或其抗原性片段。在相关实施方案中，所述rMDVnp包含编码ILTV gI蛋白的重组核酸，所述ILTV gI蛋白包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有大于90%、和/或大于95%、和/或大于98%、和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述ILTV gI蛋白由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
如更早所提及，IBDV是双RNA病毒科的成员，其具有由双链RNA的两个区段(A和B)组成的基因组。较大的区段A编码110 kDa的多蛋白，其随后通过自蛋白水解切割以形成成熟的病毒蛋白VP2、VP3和VP4。这些中，VP2和VP3是病毒粒子的结构衣壳蛋白，其中VP2蛋白是主要的宿主保护性免疫原。在IBDV的情况下，存在两种血清型，可以通过病毒中和(VN)测试区分的血清型1和2。血清型1病毒已显示对鸡是致病性的，而血清型2 IBDV仅在火鸡中引起亚急性疾病。在历史上，IBDV血清型1病毒仅由一种被称为“经典” IBD病毒的类型组成，但随后已出现所谓的“变体” IBDV毒株。在本发明的具体实施方案中，所述IBDV VP2基因编码来自经典型的IBDV的VP2蛋白。此类基因是众所周知的，并且其序列信息是容易获得的[参见例如，GenBank acc.nr: D00869 (F52/70)，D00499 (STC)，或AF499929 (D78)]。或者，可以使用用于操作双RNA病毒的常规技术，从分离自自然界的经典IBDV的基因组获得该基因。可以使用血清学或分子生物学容易地鉴定经典型IBDV。
在本发明的具体实施方案中，rMDVnp包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQID NO:6的氨基酸序列的IBDV VP2蛋白，或其抗原性片段。在相关实施方案中，所述rMDVnp包含编码IBDV VP2蛋白的重组核酸，所述IBDV VP2蛋白包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有大于90%、和/或大于95%、和/或大于98%、和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述IBDV VP2蛋白由SEQ ID NO:5的核苷酸序列编码。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
使用减毒的IBDV毒株在家禽的生命中尽可能早进行针对IBDV的常规接种疫苗，但仅当针对IBDV的MDA的水平已足够降低时(其通常在孵化后15和20天之间的某时)才可以应用这些。许多‘活’或灭活的IBDV疫苗是市售的，例如，‘活’疫苗，诸如Nobilis™ GumboroD78 (Merck Animal Health)。
NDV具有非分段的、负义、单链RNA基因组，其大小为约15 kb，且含有六个基因，其中所述NDV F蛋白基因编码所谓的“融合”糖蛋白(F蛋白)。所述F蛋白参与NDV与宿主细胞的附接并进入宿主细胞，并且作为免疫优势蛋白，其可以是针对NDV的有效免疫应答的基础。所述NDV F蛋白表达为天然F0蛋白，其在被细胞外肽酶切割后被活化。
例如，NDV F蛋白基因可以源自NDV克隆30，常见的弱毒型NDV疫苗毒株。在本发明的某些实施方案中，rMDVnp包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的NDV F蛋白，或其抗原性片段。在相关实施方案中，所述rMDVnp包含编码NDV F蛋白的重组核酸，所述NDV F蛋白包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有大于90%、和/或大于95%、和/或大于98%、和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述NDV F蛋白由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
在本发明的相关实施方案中，rMDVnp包含重组核酸(例如，表达盒)，其编码包含SEQID NO:10的氨基酸序列的NDV F蛋白，或其抗原性片段。在其他实施方案中，所述rMDVnp包含编码NDV F蛋白的重组核酸，所述NDV F蛋白包含与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有大于90%、和/或大于95%、和/或大于98%、和/或大于99%同一性的氨基酸序列。在具体实施方案中，所述NDV F蛋白由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码。在具体实施方案中，所述rMDVnp是rHVT。在替代实施方案中，所述rMDVnp是rMDV2。
可同等地应用编码F蛋白基因的天然和/或实验室来源的变体的核酸，其来自弱毒，中等毒力或强毒NDV，因为F蛋白基因序列本身在这些不同NDV致病型中是高度保守的。
由本发明的rMDVnp编码的鸡病原体蛋白抗原的核苷酸和/或蛋白序列也可以在公共可得的数据库诸如GenBank或Protein Information Resource中找到。
启动子和多腺苷酸化调节元件
启动子是生物体的基因组上的功能区域，其指导下游编码区域的转录。因此，启动子位于基因的编码区域的上游。由启动子指导的mRNA合成从“转录起始位点”(TSS)开始。产生的mRNA进而从基因的起始密码子开始翻译成蛋白，所述起始密码子是开放阅读框中的第一个ATG序列(mRNA中的第一个AUG)。通常，TSS位于起始密码子上游的30-40个核苷酸处。可以通过对基因的mRNA的5’末端进行测序(例如通过RACE技术)来确定TSS。通常，启动子包含在起始密码子的A(其通常表示为A+1)的位置上游约1000个核苷酸内，并且大多数启动子位于核苷酸-500和A+1之间。
启动子的命名通常基于其控制其表达的基因的名称。例如，鼠巨细胞病毒立即早期1基因(mCMV IE1)启动子“mCMV-IE1基因启动子”是指天然驱动mCMV的早期1基因(IE1基因)的表达且因此位于该基因的立即上游的启动子。因为IE1-基因是这种良好记录且清楚可识别的基因，且因为已对几种mCMV的基因组进行测序(全部或部分)，所以可以通过常规技术容易地鉴定这种启动子。例如，在基本方案中，可以通过大致亚克隆两个连续基因之间(例如，从上游基因的poly A信号至下游基因的TSS)的区域来获得启动子。然后可以通过标准测试(例如，通过可疑启动子的逐渐变小的区段表达标记基因)来鉴定启动子。
通常，启动子含有许多可识别的调节区域，诸如增强子区域，其参与结合影响转录的时间、持续时间、条件和水平的调节因子。尽管增强子区域通常位于上游，但启动子还含有更下游的区域，其参与结合转录因子并指导RNA聚合酶本身。该下游区域通常含有许多保守的启动子序列元件，诸如TATA盒、CAAT盒和GC盒。
包含增强子-和下游区域两者的启动子被称为“完全”启动子，而仅包含下游区域的启动子被称为“核心”启动子。
用于在(病毒)载体中表达(异源)基因的启动子需要能够有效地驱动该下游编码序列的转录。这通常被称为启动子与编码序列“可操作地连接”，使得该基因在启动子的‘控制下’，或由启动子‘驱动’。这通常意味着在表达盒中，该基因的启动子和编码序列有效接近地在同一核酸上发现，并且其中在它们之间没有信号或序列会干扰编码序列的有效转录。
mCMV-IE1基因启动子是本领域中众所周知的，并且可以容易地获得自各种商业来源，诸如用于克隆和表达的商业质粒的供应商。所述IE1基因也称为‘主要IE基因’。所述mCMV-IE1蛋白也已被称为pp89。Dörsch-Häsler等人[Proc. Nat. Acad. Sci., 82:8325-8329 (1985)]在1985年描述了mCMV IE1基因启动子，并且该启动子在异源表达中的用途也描述于WO 87/03.905和EP 728,842中。完整mCMV IE基因座的核苷酸序列可以acc.nr.L06816.1得自GenBank (从2004年3月起)。mCMV本身最初以acc. nr.VR-194得自ATCC，并且更近来，这已经以acc. nr.VR-1399继续。
在本发明的一个实施方案中，所述mCMV-IE1基因启动子是mCMV-IE1基因的完整启动子，其包含核心启动子区域以及增强子区域两者。完整的mCMV-IE1基因启动子大小为约1.4kb。然而，本发明还允许不仅mCMV IE1-基因启动子、而且构成本发明中采用的重组DNA表达盒的其他元件的长度的一些变异。这可以由用于克隆和构建的确切条件的差异导致。例如，这种变异可能由使用不同的限制性酶位点、PCR克隆引物或用于调整所用的克隆分子的末端的不同条件导致。因此，可发生组成元件的长度的一些变异(更小或更大)，而不影响整体表达盒的稳定性和相对强的抗原表达和/或效力。在该情况下，这些长度差异是不重要的，并且在本发明的范围内。因此，“约1.4kb”的mCMV-IE1基因启动子是：1.4 kb ± 约25%。在具体实施方案中，所述启动子为1.4 kb ± 约20%。在还有其他实施方案中，所述变异可以为1.4 kb ± 约15%，1.4 kb ± 约12%，1.4 kb ± 约10%，1.4 kb ± 约8%，1.4 kb ±约6%，1.4 kb ± 约5%，1.4 kb ± 约4%，1.4 kb ± 约3%，1.4 kb ± 约2%或者甚至1.4kb ± 约1%。
类似地，可以使用同样有效和稳定的启动子元件的同源物或变体。因此，在某些实施方案中，本发明的mCMV-IE1基因启动子可以是约1.4kb的DNA分子，其包含与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或甚至99%核苷酸序列同一性的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，所述mCMV-IE1基因启动子由SEQ ID NO:13的核苷酸序列组成。
许多替代的启动子可用于驱动本发明的rMDVnp中的编码蛋白抗原或其抗原性片段的异源基因的表达。实例包括伪狂犬病病毒(PRV) gpX启动子[参见，WO 87/04463]、劳氏肉瘤病毒LTR启动子、SV40早期基因启动子、包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列的鸡β-肌动蛋白基因启动子、Towne毒株hCMV IE启动子SEQ ID NO:16、包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列的hCMV IE启动子的衍生物(来自毒株AD169)、包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列的ILTV gD启动子和包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列的ILTV gI启动子[参见例如，U.S. 6,183,753B1]、人巨细胞病毒立即早期1 (hCMV IE1)基因启动子[U.S. 5,830,745；U.S. 5,980,906]和鸡β-肌动蛋白基因启动子[EP 1 298 139 B1]。IBDV VP2基因的特定异源启动子是鼠(mCMV IE1)巨细胞病毒启动子。在该类型的一个具体实施方案中，所述mCMV IE1包含SEQID NO:13的核苷酸序列[参见，例如，EP 728,842；PCT/EP2015/081121]。
时常需要在DNA编码区域下游包括多腺苷酸化调节元件，以终止编码DNA序列的转录。因此，许多基因在其编码序列的下游末端包含多腺苷酸化调节元件。已鉴定许多此类调节元件，并且可用于本发明的rMDVnp中。如本文中所例举的多腺苷酸化调节元件的具体实例包括：包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列的猫疱疹病毒(FHV) US-9多腺苷酸化信号，和包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列的人单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶多腺苷酸化信号。终止子和多腺苷酸化序列也可以来自猫疱疹病毒(FHV)的糖蛋白B (gB)基因，来自人巨细胞病毒(hCMV)、毒株AD 169的立即早期(IE)基因，或来自猿猴病毒40 (SV40) 。
疫苗和免疫原性组合物
本发明涉及重组MDVnp，用于构建MDVnp的核酸分子，或用于使它们生长的宿主细胞，或其任何组合的用途，根据本发明所有都用于制造用于家禽的疫苗。因此，本发明提供了包含本发明的多价重组MDVnp的疫苗和/或免疫原性组合物。此类疫苗可用于帮助预防和/或防止传染性法氏囊病(甘布罗病)，和/或马立克氏病，和/或与ILTV感染相关的疾病，和/或与NDV感染相关的疾病。根据本发明的疫苗可用于预防和/或治疗性处理，并且因此可干扰感染的建立和/或进展和/或其疾病临床体征。
本发明的重组MDVnp可通过本领域中目前实施的任何多种方式生长。例如，本发明的重组MDVnp可通过使用原代鸡细胞的体外培养物生长，参见，例如下文的实施例，其中使用鸡胚成纤维细胞(CEFs)。CEFs可通过鸡胚的胰蛋白酶处理而制备。CEFs还可以铺板在单层中，并且然后用MDVnp感染。这种具体方法可容易地按放大至工业级别生产。
因此，本发明的一个进一步方面涉及用于制备根据本发明的疫苗的方法，其包括以下步骤：用本发明的重组MDVnp感染宿主细胞，收获感染的宿主细胞，和然后将收获的感染宿主细胞与药学上可接受的载体混合。用于感染、培养和收获的合适的方法是本领域中众所周知的，并且在本文中描述并例举。
通常，感染的宿主细胞在仍完整的同时收获，以获得其细胞缔合形式的重组MDVnp。可将这些细胞放入适当的载体组合物中以提供用于储存和冷冻的稳定化。感染的细胞可填充至玻璃安瓿中，将其密封、冷冻并储存在液氮中。因此，在本发明的某些实施方案中，本发明的疫苗和/或免疫原性组合物是冷冻储存的，并且，因此包含冷冻保护剂，诸如二甲亚砜(DMSO)，以保存冷冻的感染细胞。
或者，当重组MDVnp是重组HVT时，可将其从其宿主细胞分离，例如通过在培养结束时的声处理，并且随后放入稳定剂中，并且冷冻干燥(冻干)用于稳定储存或以其他方式减少液体体积用于储存，且然后在施用前或施用时在液体稀释剂中重构。这种重构可以使用例如疫苗级水实现。在某些实施方案中，多价疫苗的冻干部分可包含一种或多种抗原，且稀释剂可包含一种或多种其他抗原。
在具体实施方案中，本发明的疫苗(或其部分)可以呈冷冻干燥的形式，例如，作为片剂和/或球体，其通过WO 2010/125084(其以其整体通过引用并入本文)中所述的方法产生。具体地，参考WO 2010/125084的第15页第28行至第27页第9行的实施例，其描述了生产此类快速崩解片剂/球体的方法。此类冷冻干燥形式可容易地溶解在稀释剂中，以使得能够全身性施用疫苗。
疫苗和免疫原性组合物可包括，但不必需包括生理相容的缓冲剂和盐水等，以及药学上可接受的佐剂。佐剂可用于改进免疫应答和/或提高疫苗制剂的稳定性。佐剂通常被描述为免疫***的非特异性刺激剂，但也可用于靶向免疫***的特异性部分(specificarm)。可向疫苗中添加具有这种活性的一种或多种化合物。因此，本发明的具体疫苗可进一步包含佐剂。可用作佐剂的化学化合物的实例包括，但不限于铝化合物(例如氢氧化铝)，可代谢和不可代谢的油，矿物油，包括矿物油溶液中的二缩甘露醇油酸酯衍生物(例如，来自Seppic SA, France的MONTANIDE ISA 70)，和轻质矿物油，诸如DRAKEOL 6VR，嵌段聚合物，ISCOM's (免疫刺激复合物)，维生素和矿物质(包括但不限于：维生素E，维生素A，硒和维生素B12)和CARBOPOL®。
时常被称为免疫刺激物的其他合适的佐剂，包括但不限于：细胞因子、生长因子、趋化因子、来自淋巴细胞、单核细胞、来自淋巴器官的细胞的细胞培养物的上清液、来自植物、细菌或寄生虫的细胞制剂和/或提取物(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或脂多糖制剂)或有丝***原。通常，佐剂与本发明的抗原同时施用。然而，也可以或替代地在接种疫苗前2周时段内和/或接种疫苗后持续一段时间施用佐剂，即，只要抗原，例如本发明的重组MDVnp保留在组织中。
本发明的疫苗和/或免疫原性组合物可通过任何途径，诸如卵内，通过胃肠外施用，包括肌肉内注射、皮下注射、静脉内注射、皮内注射，通过划痕法(scarification)，通过口服施用，或者通过其任何组合，进行施用。
此外，本发明的多价重组MDVnp可用于和/或与额外的IBDV、ILTV、NDV和/或MDV抗原组合用于改进和扩展所提供的免疫原性，和/或与其他病原体的抗原组合以提供针对此类其他病原体的免疫保护。这些额外的抗原可以是活的或杀死的完整微生物、其他重组载体、细胞匀浆、提取物、蛋白或任何其他这种衍生物，只要它们没有负面地干扰根据本发明的疫苗的安全性和稳定性以及相对强的抗原表达和/或效力。
在其中MDV、IBDV、NDV或ILTV的毒性非常高的野生毒株流行，例如在特定地理区域中流行的那些情况下，本发明的多价重组MDVnp与额外的MDV、IBDV、NDV和/或ILTV抗原的组合可以是有利的。在此方面，本发明的多价重组MDVnp与MDV1、MDV2或HVT的组合包括Rispens(MDV1)毒株、SB1 (MDV2)毒株、FC-126 (HVT)毒株和/或PB1 (HVT)毒株。为了改进针对IBDV的应答，可以将多价重组MDVnp与IBDV疫苗毒株，诸如温和的活IBDV疫苗毒株，例如D78(克隆的中间毒株)、PBG98、Cu-1、ST-12(中间毒株)或89/03(活Delaware变体毒株)在多价疫苗中组合。
可作为抗原与本发明的多价重组MDVnp一起使用的其他微生物的实例包括：(i) 病毒，诸如传染性支气管炎病毒、禽流感病毒、腺病毒、减蛋综合征病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡贫血病毒，禽脑-脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸭瘟病毒(鸭病毒性肠炎)、鸽痘病毒、禽白血病病毒、禽肺炎病毒，和呼肠孤病毒，(ii) 细菌，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属物种(Salmonella spec.)、鼻气管炎鸟疫杆菌(Ornitobacterium rhinotracheale)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilis paragallinarum)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、丹毒杆菌属物种(Erysipelas spec.)、支原体属物种(Mycoplasma spec.)和梭菌属物种(Clostridium spec.)，(iii) 寄生虫，诸如艾美虫属物种(Eimeriaspec.)，和(iv) 真菌，诸如曲霉属物种(Aspergillus spec.)。在本发明的具体实施方案中，本发明的重组MDVnp可以与温和的活NDV疫苗毒株、诸如疫苗毒株C2组合。许多此类毒株用于商业疫苗中。
组合疫苗可以通过各种途径制备，包括通过将本发明的重组MDVnp与病毒或细菌或真菌或寄生虫或宿主细胞或任何和/或所有这些的混合物的制剂组合。在具体实施方案中，用于这种组合疫苗的组分通常分开产生，且然后组合并填充到相同的疫苗容器中。
如上所述，根据本发明的疫苗可有利地通过在非常幼龄或卵内的单次接种，向鸡提供例如针对一种或多种家禽疾病的安全且有效的免疫保护。或者，如将对家禽疫苗领域任何技术人员显而易见地，上述组合也可包括接种疫苗时间表，其中本发明的多价重组MDVnp和额外抗原不同时应用；例如，重组MDVnp可在卵内应用，且NDV C2和/或IBDV毒株(例如，89/03)可在后续的时间/日期应用。
因此，本发明的疫苗可在单个剂量或多个剂量中施用于禽受试者。例如，本发明的疫苗可在孵化日应用和/或在第16-18 (胚胎日) ED在卵内应用。当施用多个剂量时，它们可以同时或顺次地，以与疫苗的制剂相容的方式和时间，且以将在免疫上有效的量给予。因此，本发明的疫苗可有效地充当引发接种疫苗，其之后可继之以相同疫苗或使用不同的疫苗制剂(例如，典型的灭活的、佐剂化的全病毒疫苗)的加强接种疫苗，并由其扩增。或者，本发明的疫苗可以仅作为加强接种疫苗施用于禽受试者。
本发明的疫苗的每剂体积可以根据预期的应用途径而优化：卵内接种通常用0.05和0.5 ml/卵之间的体积应用，且胃肠外注射通常用0.1和1 ml/禽之间的体积进行。在任何情况下，疫苗剂量体积的优化完全在技术人员的能力之内。
Figure 321087DEST_PATH_IMAGE002
Figure 972648DEST_PATH_IMAGE003
通过参考以下非限制性实施例，可更好地理解本发明，提供所述非限制性实施例作为本发明的示例。呈现以下实施例以更完全地举例说明本发明的实施方案，且决不应解释为限制本发明的广泛范围。
实施例
实施例1
重组HVT/ ILTV/IBDV/NDV病毒载体的构建
制备重组多价非致病性马立克氏病病毒构建体，其编码和表达(i)两种传染性喉气管炎病毒蛋白抗原，(ii)传染性法氏囊病病毒蛋白抗原，和(iii)新城疫病毒蛋白抗原。本发明克服了当将两种重组HVT疫苗、诸如Innovax®-ILT(由Merck Animal Health销售)和Vaxxitek®(由Merial销售)给予同一动物时遇到的疫苗干扰的问题。此外，本发明独特地提供了第一重组非致病性马立克氏病病毒(rMDVnp)，其编码来自除了MDV以外的三种不同的病毒病原体的抗原。
产生重组火鸡疱疹病毒(HVT)构建体，其中将来自三种家禽病原体(传染性喉气管炎病毒(ILTV)、新城疫病毒(NDV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV))的抗原性供体材料***HVT载体[还参见，在2016年6月17日提交的US 8,932,604 B2、WO 2013/057,235、WO 2016/102647和美国系列号62/351,471，其全部内容以其整体通过引用并入本文]。供体材料包括来自ILTV、NVSL攻击毒株、Lot # 83-2的3.563 kb SalI-HindIII片段[核苷酸位置10532-14094；Wild等人, Virus Genes 12:104-116 (1996): Acc.#U28832]，其编码糖蛋白D(gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，加上糖蛋白E(氨基酸1-101)的部分编码区域和ORF5(氨基酸734-985)；由NDV、克隆30毒株、融合蛋白(F)基因的编码区域组成的表达盒(核苷酸位置4544 – 6205；Romer-Oberdorfer等人, (1999); Acc.# Y18898)，其由病毒启动子驱动，且随后为终止子序列；和由IBDV、Faragher、F52/70型毒株、病毒蛋白2 (vp2)基因的编码区域组成的表达盒，其由病毒启动子驱动，且随后为终止子序列。在例举的实施方案中，驱动IBDV VP2表达的启动子来自小鼠巨细胞病毒(mCMV)毒株ATCC VR-194的立即早期(IE)基因，而用于NDV F表达的启动子来自人巨细胞病毒(hCMV)、毒株AD169的立即早期(IE)基因。IBDV VP2的终止子和多腺苷酸化序列来自猿猴病毒40(SV40)，而NDV F的终止子和多腺苷酸化序列来自人巨细胞病毒(hCMV)的立即早期(IE)基因。将第一异源核酸的供体材料***UL54.5位点(位置111240/111241，Afonso等人，J. Virology 75(2):971-978 (2001),;Acc. #AF291866，在氨基酸残基21和22之间)，而将第二异源核酸的供体材料***US2位点(位置140540/140541，Afonso等人，(2001)同上；Acc. #AF291866，在氨基酸残基124和125之间)[参见，图1]。
遗传和表型稳定性是任何新的重组病毒疫苗候选物的安全性和相对强的抗原表达和/或效力概况的主要组分。***HVT骨架的IBDV/ILTV和NDV表达盒不是病毒复制固有需要的，且因此可能由于在组织培养传代中扩增病毒储备物期间的突变而丢失。令人满意的疫苗候选物一定不能容易突变以丢失外来基因***物的表达。如果可以表明在组织培养物中传代大于或等于10次后病毒噬斑中的至少90%表达***的外来抗原蛋白，则疫苗候选物被认为是稳定的。
先前已经对伪狂犬病病毒证明通过粘粒构建方法产生疱疹病毒的能力[van Zijl等人，J.Virology 62:2191-2195 (1988)]。随后，采用这种程序来构建重组HVT载体[参见U.S. 5,853,733，对于关于重组HVT载体的构建所公开的方法通过引用并入本文]，并且用于构建本发明的重组HVT/IBDV/ILTV/NDV载体。在此方法中，将完整的HVT基因组，作为利用标准重组DNA技术构建的几个大的重叠亚基因组片段克隆至细菌载体中[Maniatis等人，Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York (1982)；和Sambrook等人，Molecular Cloning, Cold Spring HarborLaboratory press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]。HVT毒株FC126粘粒文库来源于克隆至粘粒载体pWE15 (Stratagene，现在Agilent Technologies of Santa Clara,Calif.)中的剪切的病毒DNA。此外，多个大的基因组DNA片段通过用酶BamHI进行限制性酶切来分离，并克隆至pWE15或质粒载体pSP64 (Promega, Madison Wis.)中。如U.S. 5,853,733中所述，将这些片段共转染至鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞导致通过跨越所述片段的重叠区域的同源重组介导的HVT基因组的再生。如果在共转染前将***物直接工程改造至一个或多个亚基因组片段中，此程序导致高频率的包含所述***物的病毒。需要5个重叠亚基因组克隆以产生FC126 HVT的完整基因组，并且充当产生所有HVT/IBDV/ILTV/NDV重组病毒的基础。
HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14.1-1A1或A2的构建
三重重组HVT载体病毒HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14.1-1含有***HVT UL54.5位点的IBDV/ILTV表达盒和***HVT US2位点的NDV表达盒。HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14.1-1的粘粒再生基本上如U.S. 5,853,733 [例如，U.S. 5,853,733的图8]中所述进行。为了允许整合至FC126 HVT基因组的UL54.5区域中，现在从三个较小的质粒：672-01.A40和672-07.C40以及与这两者重叠且在UL54.5基因座中含有IBDV/ILTV表达盒的一个转移质粒(484-1050-2641-10859)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.407-31.1C1覆盖的区域。为了允许整合至FC126 HVT基因组的US区域中，现在从三个较小的质粒：pSY640和556-60.6以及与这两者重叠且在US2基因座中含有NDV表达盒的一个转移质粒(1322-48.1)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.378-50覆盖的区域。
使用标准的CaCl2转染方案，将九种线性化构建体的集合(2种粘粒和7种质粒)全部一起转染至鸡胚成纤维细胞(CEFs)中，并将所得病毒储备物噬斑纯化两次。
用于产生FC126 HVT的亚基因片段的描述：
亚基因组克隆407-32.2C3
粘粒407-32.2C3含有基因组HVT DNA的近似40,170个碱基对的区域[左侧末端 – 位置39,754；Afonso等人，(2001)，同上；Acc. #AF291866]。该区域包括HVT BamHI片段F’、L、P、N1、E、D和片段B的2,092个碱基对。
亚基因组克隆172-07.BA2
质粒172-07.BA2含有基因组HVT DNA的25,931个碱基对的区域。其通过将HVT BamHI B片段[位置37,663至63,593；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]克隆至质粒pSP64(Promega, Madison Wis.)中而构建。
亚基因组克隆407-32.5G6
粘粒407-32.5G6含有基因组HVT DNA的39,404个碱基对的区域[位置61,852 – 101,255；Afonso等人，(2001)，同上；Acc. #AF291866]。该区域包括HVT BamHI片段H、C、Q、K1、M、K2，加上片段B的1,742个碱基对和片段J的3,880个碱基对。
亚基因组克隆407-31.1C1
粘粒407-31.1C1含有基因组HVT DNA的37,444个碱基对的区域[位置96,095 – 133,538；Afonso等人，(2001)，同上；Acc. #AF291866]。该区域包括HVT BamHI片段J、G、I、F、O，加上片段K2的1,281个碱基对和片段A的6,691个碱基对。
亚基因组克隆378-50
粘粒378-50含有基因组HVT DNA的28,897个碱基对的区域 [参见，U.S. 5,853,733的图8]。该区域包括HVT BamHI片段A。其通过将HVT BamHI A片段[位置126,848 – 155,744；Afonso等人，(2001)，同上；Acc. #AF291866]克隆至粘粒pWE15中而构建。
用于产生HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14.1-1A1或A2的额外***片段(参见，图1)
亚基因组克隆484-1050-2641-10859
***质粒484-1050-2641-10859含有克隆至质粒pNEB193的衍生物(缺失AatII-PvuII)中的基因组HVT独特长区域的 8636个碱基对的区域[位置109489-118124；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。其侧接AscI位点，并且包括HVT BamHI片段I、S，加上片段G的1337个碱基对和片段F的1177个碱基对。***HVT UL54.5开放阅读框内的XhoI位点[位置111240/111241；Afonso等人，2001，同上，Acc. #AF291866，在氨基酸残基21和22之间]的是2个元件：由MCMV IE启动子、IBDV经典型F52/70、Faragher毒株、病毒蛋白2基因(VP2)和SV40多腺苷酸化信号组成的表达盒，随后为来自ILTV、NVSL攻击毒株、Lot#83-2的3563个碱基对的SalI-HindIII片段[位置10532-14094；Wild等人，Virus Genes 12:104-116(1996); Acc.#U28832]，其编码糖蛋白D (gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，加上来自糖蛋白E的部分编码区域(氨基酸1-101)，和ORF5 (氨基酸734-985)。IBDV VP2、ILTV gD和ILTVgI基因以相对于HVT UL54.5基因相反的方向转录。
亚基因组克隆672-01.A40
质粒672-01.A40含有克隆至质粒pNEB193的衍生物中的源自长独特区域的基因组HVTDNA的14,731个碱基对的区域[位置96095-110825；Afonso等人，2001，同上，Acc. #AF291866]。该区域包括HVT BamHI片段G、J，和K2的1281个碱基对。
亚基因组克隆672-07.C40
质粒672-07.C40含有克隆至质粒pNEB193的衍生物中的源自长独特区域的基因组HVTDNA的12,520个碱基对的区域[位置116948-129467；Afonso等人，2001，同上，Acc. #AF291866]。该区域包括HVT BamHI片段F、O，和A的2620个碱基对。
亚基因组克隆1322-48.1
***质粒1322-48.1含有克隆至质粒pSP64 (Promega, Madison, WI.)中的HVT独特短区域的 7311个碱基对的EcoRI片段[位置126880-144190；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。***HVT US2基因内的独特StuI位点[位置140540/140541; Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866，在氨基酸残基124和125之间]的是由HCMV IE启动子、NDV、克隆30毒株、融合基因(F)和来自HCMV IE基因的转录终止子组成的表达盒。NDV F基因以相对于HVTUS2基因相反的方向转录。
亚基因组克隆pSY640
质粒pSY640含有源自BamHI片段A的基因组HVT DNA的近似13,600个碱基对的区域[位置126848-140540；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。为了产生该质粒，将位于US2基因上游的DNA的区域(其起始于位于US2基因中的StuI位点且继续至BamHI A片段的末端)克隆至质粒pSP64 (Promega, Madison WI.)中。
亚基因组克隆556-60.6
质粒556-60.6含有源自BamHI片段A的基因组HVT DNA的近似12,500个碱基对的区域[位置143300-155744；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。为了产生该质粒，将位于US2基因上游的DNA的区域(起始于位于US2基因中的StuI位点且继续至BamHI A片段的末端)克隆至pSP64 (Promega, Madison WI.)中，且然后用核酸外切酶处理以从StuI位点“向后降解”~150 bp，且重新克隆至pBR322质粒载体中。
标准CaCl 2 转染方案
将继代CEF接种在6孔培养板上，并在38℃与5% CO2下孵育24小时，并形成汇合的单层。对于每个孔，将总量为0.5 μg的粘粒和质粒的DNA在Hepes缓冲液中混合，并逐滴添加125mM CaCl2，直至即将沉淀。将该混合物添加至CEF细胞单层，并孵育2至3小时。除去上清液，并添加15%甘油的覆盖物，并在细胞上保持一分钟。然后将此移取，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，并添加新鲜培养基，并将细胞孵育两天。接下来，将感染通过如下扩增两次：通过胰蛋白酶消化收集细胞并接种至较大的板上，首先是6 cm板，然后3天后是10 cm板，直至获得50-90% CPE。接下来，通过胰蛋白酶消化收获扩增的转染细胞，并将10-3至10-4的稀释液铺板在具有CEF单层的6cm板上，并孵育。第二天，将所述板用琼脂覆盖，并分离许多HVT/IBDV/ILTV/NDV的单独噬斑并将其在CEF上扩增。通过用稀释至10-4至10-5的第一轮纯化的储备物感染6 cm板上的CEF的汇合单层并孵育细胞，将每种病毒储备物进行第二次噬斑纯化。第二天，将所述板用琼脂覆盖，并分离许多HVT/IBDV/ILTV/NDV的单独噬斑并在CEF上扩增。
实施例2
重组HVT/IBDV/ILTV/NDV病毒储备物对于组织培养中连续传代后表达IBDV、ILTV和NDV 蛋白是表型稳定的
将各自来自分开的共转染储备物的HVT/IBDV/ILTV/NDV的两种噬斑纯化的分离株在继代CEF细胞上连续传代15次，并在免疫荧光测定中评估***的ILTV、NDV和IBDV基因的表达。
组织培养传代储备物的产生
对于每次组织培养传代，将汇合的继代CEF单层用50-100 μL病毒储备物接种，并在38℃、5% CO2下孵育2-5天，直至CPE明显。接下来，通过胰蛋白酶消化收获细胞，第1代(P1)。重复该过程以制备另外的世代储备物(P2-P15)。
表型稳定性分析
将六孔板用继代CEF单层种植。将细胞用在各种世代水平：P0-P15收获的病毒储备物或单独的稀释液接种。将所述板以多种稀释度接种以获得每孔可计数的噬斑，并在38℃、5%CO2下孵育。在五天孵育后，倾析上清液，并将CEF单层在15-30℃下用70%丙酮固定近似20分钟。倾析丙酮溶液并允许细胞风干，然后用ILTV gD(多克隆兔抗ILTV gD)、ILTV gI(多克隆兔抗ILTV gI)、NDV F (Mab #57)和IBDV VP2 (MCA GDV-R63)一抗染色。在近似1.5小时封闭步骤后，将PBS + 0.5% Triton-X 100中的5%山羊血清(每孔2 mL)添加至皿，且然后在加湿培养箱中在36℃-39℃下进行孵育。将一抗适当稀释，以每孔2 mL添加，且然后在加湿培养箱中在36℃-39℃下孵育1.3小时。
抗体孵育后，将所述板用PBS + 0.5% Triton-X 100洗涤3次。以1:50制备FITC标记的二抗溶液(兔抗小鼠或山羊抗兔)，并将2 mL添加至每孔。孵育后，将板用PBS + 0.5%Triton-X 100洗涤3次，并在荧光镜下检查，并将噬斑评分为荧光染色阳性或阴性。然后在白光显微镜下检查板，并重新计数噬斑。下表1中描述在每个世代水平的发荧光噬斑的百分比。两种分离株均在世代水平15维持所有四种抗原的可接受的表达水平(大于90%)。
表 1
组织培养中传代后表达的稳定性
Figure 221227DEST_PATH_IMAGE004
。
实施例3
重组HVT/IBDV/ILTV/NDV病毒储备物对于接种疫苗和从禽回收后的ILTV、NDV和IBDV蛋 白的表达是表型稳定的
从HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14.1-1的两种分离株，A1分离株和A2分离株制备疫苗，并用于通过皮下途径接种两组二十一(21)日龄鸡。第三组禽用单独的稀释剂接种疫苗以充当阴性对照组。接种疫苗后收集来自三只禽的合并的脾脏样品，每周两次，持续四周，并处理用于在鸡胚成纤维细胞(CEF)上病毒分离。当细胞病变效应清晰可见时，将单层固定，并将噬斑通过免疫荧光测定(IFA)用对于每种蛋白特异性的抗体针对IBDV VP2、ILTV gD和ILTVgI以及NDV F蛋白的表达进行分析。
表型稳定性分析
将六孔板用继代CEF单层种植。将细胞用5 x 106个脾细胞接种，并在38℃、5% CO2下孵育。在五天孵育后，倾析上清液，并将CEF单层在15-30℃下用70%丙酮固定近似20分钟。倾析丙酮溶液并允许细胞风干，然后用ILTV gD(多克隆兔抗ILTV gD)、ILTV gI(多克隆兔抗ILTV gI)、NDV F (Mab #57)和IBDV VP2 (MCA GDV-R63)一抗染色。在近似0.5小时封闭步骤后，将PBS + 0.5% Triton-X 100中的5%山羊血清(每孔2 mL)添加至皿，且然后在加湿培养箱中在36℃-39℃下进行孵育。将一抗适当稀释，以每孔2 mL添加，且然后在加湿培养箱中在36℃-39℃下孵育1小时。抗体孵育后，将所述板用PBS + 0.5% Triton-X 100洗涤3次。以1:50制备FITC标记的二抗溶液(兔抗小鼠或山羊抗兔)，并将2 mL添加至每孔。将所述板在加湿培养箱中在36℃-39℃下孵育1小时。孵育后，将所述板用PBS + 0.5% Triton-X 100洗涤3次，并在荧光镜下检查，并将噬斑针对阳性(+)或阴性(-)荧光染色进行评分。然后在白光显微镜下检查所述板，并重新计数噬斑。下表2中提供了在每个世代水平的发荧光噬斑的百分比。
表 2
禽(D18)中传代后表达的稳定性
Figure 279751DEST_PATH_IMAGE005
。
实施例4
特定构建体的两种分离株的HVT/IBDV/ILTV/NDV效力数据
进行了以下四项研究，以表明单一构建体HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14作为用于针对用毒性传染性喉气管炎病毒(ILTV)或毒性传染性法氏囊病病毒(IBDV)或毒性马立克氏病病毒(MDV)的攻击进行保护的疫苗候选物的有效性。
在第一项研究中，将一日龄的无特定病原体(SPF)小鸡用HVT/IBDV/ILTV/NDV670-14.1-1A2疫苗候选物接种疫苗。对照包括仍然未接种疫苗的第二组。在接种疫苗后28天，经由气管内(IT)途径用毒性ILTV/USDA批次LT 96-3攻击接种疫苗的小鸡和未接种疫苗的对照小鸡。然后将禽针对疾病的临床体征观察10天。在表3中，结果显示670-14.1-1A2疫苗提供了免于攻击的部分保护。使用疫苗的第二个克隆670-14.1-1A1进行第二项研究。在表4中，结果显示保护的显著改进。因此，接下来的两项研究用670-14.1-1A1疫苗候选物进行。这些结果提供了证据证明HVT/IBDV/ILTV/NDV可以既稳定又有效。
表 3
用分离株670-14.1-1A2接种疫苗后的ILTV攻击
Figure 828544DEST_PATH_IMAGE006
。
表 4
用分离株670-14.1-1A1接种疫苗后的ILTV攻击
Figure 119848DEST_PATH_IMAGE007
。
在第三项研究中，将一日龄的无特定病原体(SPF)小鸡用HVT/IBDV/ILTV/NDV670-14.1-1A1疫苗接种疫苗。对照包括第二未接种疫苗组。在接种疫苗后28天，经由眼内(IO)途径用毒性IBDV/CS89毒株攻击接种疫苗的小鸡和未接种疫苗的对照小鸡。然后将禽针对疾病的临床体征观察10天，并收集法氏囊并针对与IBDV一致的总体病变进行组织学检查，并根据欧洲药典9.0 (04/2013:0587)进行评分。表5中的结果显示，670-14.1-1A1疫苗提供了免于攻击的100%保护。
表 5
用分离株670-14.1-1A1#接种疫苗后的IBDV攻击
Figure 58985DEST_PATH_IMAGE008
在第四项研究中，将一日龄的无特定病原体(SPF)小鸡用HVT/IBD/ILTV/NDV 670-14.1-1A1疫苗接种疫苗。对照包括未接种疫苗的小鸡的第二组。在接种疫苗后5天，经由腹内(IA)途径用毒性MDV/GA毒株攻击接种疫苗的小鸡和未接种疫苗的对照小鸡。然后将禽针对疾病的临床体征观察50天，并在死亡或安乐死后针对与MDV一致的总体病变进行检查。表6中的结果显示，670-14.1-1A1疫苗提供了免于攻击的95%保护。总之，这些结果表明，HVT/IBD/ILTV/NDV疫苗可以既稳定又有效。其还导致对于稳定和有效的多价HVT疫苗还没有达到的多价HVT构建体中编码的外来抗原的上限的可信度。
表 6
用分离株670-14.1-1A1接种疫苗后的MDV攻击
Figure 257885DEST_PATH_IMAGE009
。
实施例5
额外的HVT/IBDV/ILTV/NDV构建体
HVT/IBDV/ILTV/NDV #2的构建
三重重组HVT载体病毒HVT/IBDV/ILTV/NDV #2含有***HVT UL54.5位点的NDV表达盒和***HVT US2位点的IBDV/ILTV表达盒。HVT/IBDV/ILTV/NDV #2的粘粒再生基本上如U.S.5,853,733 [例如，U.S. 5,853,733的图8]中所述进行。为了允许整合至FC126 HVT基因组的UL54.5区域中，现在从三个较小的质粒：672-01.A40和672-07.C40以及与这两者重叠且在UL54.5基因座中含有NDV表达盒的一个转移质粒(654-45:325341_IE-F/1C1)提供由U.S.5,853,733中的粘粒nr.407-32.1C1覆盖的区域。为了允许整合至FC126 HVT基因组的US区域中，现在从三个较小的质粒：pSY640和556-60.6以及与这两者重叠且在US2基因座中含有IBDV/ILTV表达盒的一个转移质粒(228509-ILT-435Vec6)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.378-50覆盖的区域。
使用标准的CaCl2转染方案，将九种线性化构建体的集合(2种粘粒和7种质粒)全部一起转染至鸡胚成纤维细胞(CEFs)中，并将所得病毒储备物噬斑纯化两次。
HVT/IBDV/ILTV/NDV #3的构建
三重重组HVT载体病毒HVT/IBDV/ILTV/NDV #3含有***HVT UL54.5位点的IBDV表达盒和***HVT US2位点的ILTV/NDV表达盒。HVT/IBDV/ILTV/NDV #3的粘粒再生基本上如U.S.5,853,733 [例如，U.S. 5,853,733的图8]中所述进行。为了允许整合至FC126 HVT基因组的UL54.5区域中，现在从三个较小的质粒：672-01.A40和672-07.C40以及与这两者重叠且在UL54.5基因座中含有IBDV表达盒的一个转移质粒(VP2/1C1#8)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.407-32.1C1覆盖的区域。为了允许整合至FC126 HVT基因组的US区域中，现在从三个较小的质粒：pSY640和556-60.6以及与这两者重叠且在US2基因座中含有ILTV/NDV表达盒的一个转移质粒(1332-47.A2)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.378-50覆盖的区域。
使用标准的CaCl2转染方案，将九种线性化构建体的集合(2种粘粒和7种质粒)全部一起转染至鸡胚成纤维细胞(CEFs)中，并将所得病毒储备物噬斑纯化两次。
HVT/IBDV/ILTV/NDV #4的构建
三重重组HVT载体病毒HVT/IBDV/ILTV/NDV #4含有***HVT UL54.5位点的ILTV表达盒和***HVT US2位点的IBDV/NDV表达盒。HVT/IBDV/ILTV/NDV #4的粘粒再生基本上如U.S.5,853,733 [例如，U.S. 5,853,733的图8]中所述进行。为了允许整合至FC126 HVT基因组的UL54.5区域中，现在从三个较小的质粒：672-01.A40和672-07.C40以及与这两者重叠且在UL54.5基因座中含有ILTV表达盒的一个转移质粒(1332-23.7)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.407-32.1C1覆盖的区域。为了允许整合至FC126 HVT基因组的US区域中，现在从三个较小的质粒：pSY640和556-60.6以及与这两者重叠且在US2基因座中含有IBDV/NDV表达盒的一个转移质粒(435Vec60)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.378-50覆盖的区域。
使用标准的CaCl2转染方案，将九种线性化构建体的集合(2种粘粒和7种质粒)全部一起转染至鸡胚成纤维细胞(CEFs)中，并将所得病毒储备物噬斑纯化两次。
HVT/IBDV/ILTV/NDV #5的构建
三重重组HVT载体病毒HVT/IBDV/ILTV/NDV #5含有***HVT UL54.5位点的ILTV/NDV表达盒和***HVT US2位点的IBDV表达盒。HVT/IBDV/ILTV/NDV #5的粘粒再生基本上如U.S.5,853,733 [例如，U.S. 5,853,733的图8]中所述进行。为了允许整合至FC126 HVT基因组的UL54.5区域中，现在从三个较小的质粒：672-01.A40和672-07.C40以及与这两者重叠且在UL54.5基因座中含有ILTV/NDV表达盒的一个转移质粒(1332-29.4)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.407-32.1C1覆盖的区域。为了允许整合至FC126 HVT基因组的US区域中，现在从三个较小的质粒：pSY640和556-60.6以及与这两者重叠且在US2基因座中含有IBDV表达盒的一个转移质粒(435Vec6)提供由U.S. 5,853,733中的粘粒nr.378-50覆盖的区域。
使用标准的CaCl2转染方案，将九种线性化构建体的集合(2种粘粒和7种质粒)全部一起转染至鸡胚成纤维细胞(CEFs)中，并将所得病毒储备物噬斑纯化两次。
用于产生HVT/IBDV/ILTV/NDV # 2的额外***片段(参见，图2)
亚基因组克隆654-45:325341_IE-F/1C1
***质粒654-45:325341_IE-F/1C1含有克隆至质粒pNEB193的衍生物(缺失AatII-PvuII)中的基因组HVT独特长区域的 8636个碱基对的区域[位置109489-118124；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。其侧接AscI位点，并且包括HVT BamHI片段I、S，加上片段G的1337个碱基对和片段F的1177个碱基对。***HVT UL54.5开放阅读框内的XhoI位点[位置111240/111241; Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866，在氨基酸残基21和22之间]的是由HCMV IE启动子、NDV、克隆30毒株、融合基因(F)和来自HCMV IE基因的转录终止子组成的表达盒。NDV F基因以相对于HVT UL54.5基因相反的方向转录。
亚基因组克隆228509-ILT-435Vec6 [参见，国际申请PCT/EP2017/064662]
***质粒228509-ILT-435Vec6含有克隆至质粒pSP64 (Promega, Madison, WI.)中的HVT独特短区域的 7311个碱基对的EcoRI片段[位置126880-144190；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。***HVT US2基因内的独特StuI位点[位置140540/140541；Afonso等人，2001，同上，Acc. #AF291866，在氨基酸残基124和125之间]的是2个元件：由HCMV IE启动子、IBDV经典型F52/70、Faragher毒株、病毒蛋白2基因(VP2)和SV40多腺苷酸化信号组成的表达盒；随后为来自ILTV、NVSL攻击毒株、Lot#83-2的3563个碱基对的SalI-HindIII片段[位置10532-14094；Wild等人，Virus Genes 12:104-116 (1996); Acc.#U28832]，其编码糖蛋白D (gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，加上来自糖蛋白E的部分编码区域(氨基酸1-101)，和ORF5 (氨基酸734-985)。IBDV VP2、ILTV gD和ILTV gI基因以相对于HVT US2基因相反的方向转录。
用于产生HVT/IBDV/ILTV/NDV # 3的额外***片段(参见，图3)
亚基因组克隆VP2/1C1#8
***质粒VP2/1C1#8含有克隆至质粒pNEB193的衍生物(缺失AatII-PvuII)中的基因组HVT独特长区域的 8636个碱基对的区域[位置109489-118124；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。其侧接AscI位点，并且包括HVT BamHI片段I、S，加上片段G的1337个碱基对和片段F的1177个碱基对。***HVT UL54.5开放阅读框内的XhoI位点[位置111240/111241; Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866，在氨基酸残基21和22之间]的是由MCMVIE启动子、IBDV经典型F52/70、Faragher毒株、毒性蛋白2基因(VP2)和SV40多腺苷酸化信号组成的表达盒。IBDV VP2基因以相对于HVT UL54.5基因相反的方向转录。
亚基因组克隆1332-47.A2
***质粒1332-47.A2含有克隆至质粒pSP64 (Promega, Madison, WI.)中的HVT独特短区域的 7311个碱基对的EcoRI片段[位置126880-144190；Afonso等人，2001，同上；Acc.#AF291866]。***HVT US2基因内的独特StuI位点[位置140540/140541；Afonso等人，2001，同上，Acc. #AF291866，在氨基酸残基124和125之间]的是2个元件：来自ILTV、NVSL攻击毒株、Lot#83-2的3563个碱基对的SalI-HindIII片段[位置10532-14094；Wild等人，Virus Genes 12:104-116 (1996); Acc.#U28832]，其编码糖蛋白D (gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，加上来自糖蛋白E的部分编码区域(氨基酸1-101)，和ORF5 (氨基酸734-985)；随后为由HCMV IE启动子、NDV、克隆30毒株、融合基因(F)和来自HCMV IE基因的转录终止子组成的表达盒。ILTV gD、ILTV gI和NDV F基因以相对于HVT US2基因相反的方向转录。
用于产生HVT/IBDV/ILTV/NDV # 4的额外***片段(参见，图4)
亚基因组克隆1332-23.7
***质粒1332-23.7含有克隆至质粒pNEB193的衍生物(缺失AatII-PvuII)中的基因组HVT独特长区域的 8636个碱基对的区域[位置109489-118124；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。其侧接AscI位点，并且包括HVT BamHI片段I、S，加上片段G的1337个碱基对和片段F的1177个碱基对。***HVT UL54.5开放阅读框内的XhoI位点[位置111240/111241; Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866，在氨基酸残基21和22之间]的是来自ILTV、NVSL攻击毒株、Lot#83-2的3563个碱基对的SalI-HindIII片段[位置10532-14094；Wild等人，Virus Genes 12:104-116 (1996); Acc.#U28832]，其编码糖蛋白D (gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，加上来自糖蛋白E的部分编码区域(氨基酸1-101)，和ORF5 (氨基酸734-985)。ILTV gD和ILTV gI基因以相对于HVT UL54.5基因相反的方向转录。
亚基因组克隆435Vec60
***质粒435Vec60含有克隆至质粒pSP64 (Promega, Madison, WI.)中的HVT独特短区域的 7311个碱基对的EcoRI片段[位置126880-144190；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。***HVT US2基因内的独特StuI位点[位置140540/140541；Afonso等人，2001，同上，Acc. #AF291866，在氨基酸残基124和125之间]的是2个元件：由MCMV IE启动子、IBDV经典型F52/70、Faragher毒株、病毒蛋白2基因(VP2)和SV40多腺苷酸化信号组成的表达盒；随后为由HCMV IE启动子、NDV、克隆30毒株、融合基因(F)和来自HCMV IE基因的转录终止子组成的表达盒。IBDV VP2和NDV F基因两者以相对于HVT US2基因相反的方向转录。
用于产生HVT/IBDV/ILTV/NDV # 5的额外***片段(参见，图5)
亚基因组克隆1332-29.4 [参见，U.S. 9,409,954 B2]
***质粒1332-29.4含有克隆至质粒pNEB193的衍生物(缺失AatII-PvuII)中的基因组HVT独特长区域的 8636个碱基对的区域[位置109489-118124；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。其侧接AscI位点，并且包括HVT BamHI片段I、S，加上片段G的1337个碱基对和片段F的1177个碱基对。***HVT UL54.5开放阅读框内的XhoI位点[位置111240/111241；Afonso等人，2001，同上，Acc. #AF291866，在氨基酸残基21和22之间]的是两个元件：来自ILTV、NVSL攻击毒株、Lot#83-2的3563个碱基对的SalI-HindIII片段[位置10532-14094；Wild等人，Virus Genes 12:104-116 (1996); Acc.#U28832]，其编码糖蛋白D (gD)和糖蛋白I (gI)的全长基因，加上来自糖蛋白E的部分编码区域(氨基酸1-101)，和ORF5(氨基酸734-985)；随后为由HCMV IE启动子、NDV、克隆30毒株、融合基因(F)和来自HCMV IE基因的转录终止子组成的表达盒。ILTV gD、ILTV gI和NDV F基因以相对于HVT UL54.5基因相反的方向转录。
亚基因组克隆435Vec6
***质粒435Vec6含有克隆至质粒pSP64 (Promega, Madison, WI.)中的HVT独特短区域的 7311个碱基对的EcoRI片段[位置126880-144190；Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866]。***HVT US2基因内的独特StuI位点[位置140540/140541; Afonso等人，2001，同上；Acc. #AF291866，在氨基酸残基124和125之间]的是由MCMV IE启动子、IBDV经典型F52/70、Faragher毒株、毒性蛋白2基因(VP2)和SV40多腺苷酸化信号组成的表达盒。IBDVVP2基因以相对于HVT US2基因相反的方向转录。
该实施例中公开的HVT/ ILTV/IBDV/NDV病毒载体中使用的序列在以下实施例7中作为SEQ ID NO:23和26-32提供。
实施例6
不成功的构建体
根据定义，重组载体疫苗病毒被工程改造以携带和表达外来基因。如果这些外来基因的转录和表达相对于亲本病毒为重组病毒提供生长缺点，则这些基因在疫苗的产生期间可能丢失。由于该理由，必须针对遗传和表型稳定性两者测试疫苗候选物。
此外，所使用的保护标准是已由USDA确立且在联邦法规标题9法规，部分113(9CFR113)«动物产品标准要求»中编纂的保护标准。活病毒疫苗，在NDV、IBDV和ILTV的情况下，必须提供至少90%保护，且在MDV的情况下，必须提供至少80%保护，以免于与疾病相关的临床体征或病变，以获得许可。
通过在组织培养中定义数目的传代后的Southern印迹分析、最高预期疫苗生产水平确定病毒构建体的遗传稳定性，并与来自原始分离株的DNA进行比较。从病毒储备物提取的DNA将用限制性酶消化，转移至膜并与经设计以检测***的外来基因的存在的探针杂交。遗传稳定性也可以通过PCR分析来确定。经设计以与外来DNA内或侧接外来DNA的DNA退火的PCR引物可用于在组织培养中传代之前和之后从病毒DNA模板扩增已知大小的片段。
通过用针对这些***的外来基因的蛋白产物的抗体对单独的病毒噬斑进行免疫染色来确定病毒构建体的表型稳定性。由这些重组疫苗提供的保护依赖于这些蛋白产物的表达以刺激动物免疫***。在大多数情况下，如果对外来蛋白表达染色阳性的病毒的百分比降至低于90%，其可能对于病毒在组织培养中生长的能力是有害的，且因此不适合作为疫苗候选物。
从下面的表7A和7B显而易见，大多数rMDVnp构建体不满足这两个标准，即稳定性与相对强的抗原表达和/或效力。表7A提供了一系列具有多个异源***物的重组HVT构建体，其中所述异源***物之一编码IBDV抗原。如结果显示，表7A中的所有构建体都不能满足稳定性与相对强的抗原表达和/或效力的标准。
表7A
双重重组HVT和IBDV病毒构建体：
Figure 395606DEST_PATH_IMAGE010
。
下表7B提供了一系列的十一种重组HVT构建体和一种唯一的NAHV构建体，其各自包含多个异源***物，其中所述异源***物中的至少一个编码NDV或ILTV抗原。1如结果显示，表7B中的所有构建体都不能满足稳定性与相对强的抗原表达和/或效力的标准。
Figure 123390DEST_PATH_IMAGE011
Figure 346561DEST_PATH_IMAGE012
实施例7
序列
以下序列已用于示例性rHVT构建体中。以下提供的编码序列包括单独的终止密码子，其可以容易地替换为替代的终止密码子，而不改变编码序列所编码的蛋白抗原的特性。
SEQ ID NO 1: ILTV gD糖蛋白(1134 bp)
Figure 83573DEST_PATH_IMAGE013
SEQ ID NO 2: ILTV gD糖蛋白(377个氨基酸)
Figure 279062DEST_PATH_IMAGE014
SEQ ID NO 3: ILTV gI糖蛋白(1089 bp)
Figure 443327DEST_PATH_IMAGE015
SEQ ID NO 4: ILTV gI糖蛋白(362个氨基酸)
Figure 153794DEST_PATH_IMAGE016
SEQ ID NO 5: IBDV VP2 (1362 bp)
Figure 101022DEST_PATH_IMAGE017
SEQ ID NO 6: IBDV VP2 (453个氨基酸)
Figure 213334DEST_PATH_IMAGE018
SEQ ID NO:7: NDV F蛋白，编码序列(克隆30；1662 bp)
Figure 279992DEST_PATH_IMAGE019
Figure 8913DEST_PATH_IMAGE020
SEQ ID NO:8: NDV F蛋白(克隆30; 553个氨基酸)
Figure 556569DEST_PATH_IMAGE021
SEQ ID NO:9: NDV F蛋白，编码序列：(B1 Hitchner; 1698bp)
Figure 726651DEST_PATH_IMAGE022
SEQ ID NO:10: NDV F蛋白(B1 Hitchner; 565个氨基酸)
Figure 498298DEST_PATH_IMAGE023
SEQ ID NO 11: ILTV gD启动子(527 bp)
Figure 917778DEST_PATH_IMAGE024
SEQ ID NO 12: ILTV gI启动子(264 bp)
Figure 534704DEST_PATH_IMAGE025
SEQ ID NO 13: mCMV IE启动子(1391 bp)
Figure 887188DEST_PATH_IMAGE026
SEQ ID NO 14: hCMV IE启动子，来自毒株AD169 (301 bp)
Figure 501840DEST_PATH_IMAGE027
SEQ ID NO:15: hCMV IE启动子(截短的；360 bp)
Figure 408616DEST_PATH_IMAGE028
SEQ ID NO:16: hCMV IE启动子(Towne毒株；1191 bp)
Figure 563654DEST_PATH_IMAGE029
SEQ ID NO 17：鸡β-肌动蛋白启动子(692 bp)
(注：“nnn”表示在GC高度富集区域中的模棱不清的序列。可以是3-5个“g’s”)
Figure 505065DEST_PATH_IMAGE030
SEQ ID NO 18: FHV US-9多腺苷酸化信号(55 bp)
Figure 618514DEST_PATH_IMAGE031
SEQ ID NO 19: HSV TK多腺苷酸化信号(370 bp)
Figure 215849DEST_PATH_IMAGE032
SEQ ID NO 20: SV40多腺苷酸化信号(199 bp)
Figure 440157DEST_PATH_IMAGE033
SEQ ID NO 21: 484-1050-2641-10859(mCMV IEpro-VP2-SV40pA/ILTV/HVT UL54.5区域(15,252 bp) (HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14病毒)
Figure 970495DEST_PATH_IMAGE034
Figure 989267DEST_PATH_IMAGE035
Figure 401794DEST_PATH_IMAGE036
Figure 898634DEST_PATH_IMAGE037
Figure 755250DEST_PATH_IMAGE038
SEQ ID NO 22: 1322-48.1 hCMV IEpro-F-IE(term)/HVT US2区域(12,692 bp)
(HVT/IBDV/ILTV/NDV 670-14病毒)
Figure 679344DEST_PATH_IMAGE039
Figure 579167DEST_PATH_IMAGE040
Figure 614119DEST_PATH_IMAGE041
Figure 587891DEST_PATH_IMAGE042
SEQ ID NO 23: 228509-ILT-435Vec6 (mCMV IEpro-VP2-SV40pA/ILTV/HVT US2区域)(14113 bp)(HVT/IBDV/ILTV/NDV #2病毒)
Figure 417307DEST_PATH_IMAGE043
Figure 538847DEST_PATH_IMAGE044
Figure 377490DEST_PATH_IMAGE045
Figure 268085DEST_PATH_IMAGE046
Figure 737244DEST_PATH_IMAGE047
SEQ ID NO 24: 1333-85.B6 (ILTV/鸡β-肌动蛋白pro-VP2-FHV US9pA /HVT US2区域) (13064 bp)
Figure 80501DEST_PATH_IMAGE048
Figure 253993DEST_PATH_IMAGE049
Figure 733516DEST_PATH_IMAGE050
Figure 373576DEST_PATH_IMAGE051
Figure 469708DEST_PATH_IMAGE052
SEQ ID NO 25: 1386-04.4#1 (ILTV/hCMV IEpro-VP2-HSV TKpA/HVT US2区域)(13017 bp)
Figure 650153DEST_PATH_IMAGE053
Figure 246832DEST_PATH_IMAGE054
Figure 385690DEST_PATH_IMAGE055
Figure 437959DEST_PATH_IMAGE056
SEQ ID NO 26: 654-45:325341_IE-F/1C1 (HVT/IBDV/ILT/NDV #2病毒)
HCMV IEpro-F-IEpA/HVT UL54.5区域(11,017 bp)
Figure 359779DEST_PATH_IMAGE057
Figure 345052DEST_PATH_IMAGE058
Figure 123653DEST_PATH_IMAGE059
Figure 928798DEST_PATH_IMAGE060
SEQ ID NO 27: VP2/1C1#8 (HVT/IBDV/ILT/NDV # 3病毒)
MCMV IEpro-VP2-SV40pA/HVT UL54.5区域(11,665 bp)
Figure 654308DEST_PATH_IMAGE061
Figure 494088DEST_PATH_IMAGE062
Figure 443590DEST_PATH_IMAGE063
Figure 470451DEST_PATH_IMAGE064
Figure 796391DEST_PATH_IMAGE065
SEQ ID NO 28: 1332-47.A2 (HVT/IBDV/ILT/NDV # 3病毒)
ILT/hCMV IEpro-F-IE(term)/HVT US2区域(13,253 bp)
Figure 490677DEST_PATH_IMAGE066
Figure 814342DEST_PATH_IMAGE067
Figure 328500DEST_PATH_IMAGE068
Figure 723709DEST_PATH_IMAGE069
SEQ ID NO 29: 1332-23.7(HVT/IBDV/ILT/NDV # 4病毒)
ILT/HVT UL54.5区域(12,248 bp)
Figure 6923DEST_PATH_IMAGE070
Figure 563806DEST_PATH_IMAGE071
Figure 830840DEST_PATH_IMAGE072
Figure 716492DEST_PATH_IMAGE073
SEQ ID NO 30: 435Vec60 (HVT/IBDV/ILT/NDV # 4病毒)
mCMV IEpro-VP2-SV40pA/hCMV IEpro-F-IE(term)/HVT US2区域(13,068 bp)
Figure 854212DEST_PATH_IMAGE074
Figure 581997DEST_PATH_IMAGE075
Figure 8430DEST_PATH_IMAGE076
Figure 745442DEST_PATH_IMAGE077
SEQ ID NO 31: 1332-29.4 (HVT/IBDV/ILT/NDV #5病毒)
ILT/hCMV IEpro-F-IEpA(term)/HVT UL54.5区域(14,598 bp)
Figure 737669DEST_PATH_IMAGE078
Figure 901934DEST_PATH_IMAGE079
Figure 346822DEST_PATH_IMAGE080
Figure 559628DEST_PATH_IMAGE081
Figure 203099DEST_PATH_IMAGE082
SEQ ID NO 32: 435Vec6 (HVT/IBDV/ILT/NDV #5)
mCMV IEpro-VP2-SV40pA/HVT US2区域(10,681 bp)
Figure 272687DEST_PATH_IMAGE083
Figure 470450DEST_PATH_IMAGE084
Figure 221368DEST_PATH_IMAGE085
Figure 188187DEST_PATH_IMAGE086
本发明的范围不应受本文所述的具体实施方案限制。实际上，除了本文所述那些以外的本发明的各种修改对于本领域技术人员从上述描述将是显而易见的。此类修改意欲落入所附权利要求的范围之内。
还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有的分子量或分子质量值都是近似值，并且提供以用于描述。
Figure IDA0002444051440000011
Figure IDA0002444051440000021
Figure IDA0002444051440000031
Figure IDA0002444051440000041
Figure IDA0002444051440000051
Figure IDA0002444051440000061
Figure IDA0002444051440000071
Figure IDA0002444051440000081
Figure IDA0002444051440000091
Figure IDA0002444051440000101
Figure IDA0002444051440000111
Figure IDA0002444051440000121
Figure IDA0002444051440000131
Figure IDA0002444051440000141
Figure IDA0002444051440000151
Figure IDA0002444051440000161
Figure IDA0002444051440000171
Figure IDA0002444051440000181
Figure IDA0002444051440000191
Figure IDA0002444051440000201
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Claims (32)

1.重组的非致病性马立克氏病病毒(rMDVnp)，其包含至少三个异源核苷酸序列；
其中第一异源核苷酸序列编码来自第一鸡病原体的一种或多种抗原，第二异源核苷酸序列编码来自第二鸡病原体的一种或多种抗原，且第三异源核苷酸序列编码来自第三鸡病原体的一种或多种抗原；
其中所述第一异源核苷酸序列、所述第二异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列各自位于rMDVnp基因组的非必需位点中；且
其中所述第一鸡病原体、所述第二鸡病原体和所述第三鸡病原体都是彼此不同的病毒物种，并且是与马立克氏病病毒(MDV)不同的病毒物种。
2.权利要求1的rMDVnp，其中所述第一鸡病原体是传染性法氏囊病病毒(IBDV)，所述第二鸡病原体是传染性喉气管炎病毒(ILTV)，且所述第三鸡病原体是新城疫病毒(NDV)。
3.权利要求2的rMDVnp，其中所述第一异源核苷酸序列包含传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2 (IBDV VP2)的编码序列，所述第二异源核苷酸序列包含传染性喉气管炎病毒糖蛋白D(ILTV gD)的编码序列和传染性喉气管炎病毒糖蛋白I (ILTV gI)的编码序列，且所述第三异源核苷酸序列包含新城疫病毒融合蛋白(NDV F)的编码序列。
4.权利要求1、2或3的rMDVnp，其中所述第一异源核苷酸序列由第一异源核酸或第二异源核酸包含，所述第二异源核苷酸序列由所述第一异源核酸或所述第二异源核酸包含，且所述第三异源核苷酸序列由所述第一异源核酸或所述第二异源核酸包含；
其中所述第一异源核酸位于所述rMDVnp基因组中的第一非必需位点中，且所述第二异源核酸位于所述rMDVnp基因组中的第二非必需位点中；且
其中所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是相同或不同的。
5.权利要求4的rMDVnp，其中当所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是相同位点，并且选自US2位点、UL54.5位点、UL7/8位点、UL40位点、UL43位点、UL45/46位点、UL55位点、US10位点、US10和SORF3之间的区域、US2和SORF3之间的区域、基因间区域1 (IG1)位点、基因间区域2 (IG2)位点和基因间区域3 (IG3)位点。
6.权利要求4的rMDVnp，其中当所述第一非必需位点和所述第二非必需位点是两个不同的位点时；其中所述两个不同的位点单独地选自US2位点、UL54.5位点、UL7/8位点、UL40位点、UL43位点、UL45/46位点、UL55位点、US10位点、US10和SORF3之间的区域、US2和SORF3之间的区域、基因间区域1 (IG1)位点、基因间区域2 (IG2)位点和基因间区域3 (IG3)位点。
7.权利要求4、5或6的rMDVnp，其中所述第一异源核酸包含所述第一异源核苷酸序列和所述第二异源核苷酸序列；其中所述第二异源核酸包含所述第三异源核苷酸序列；且
其中所述第一异源核苷酸序列包含IBDV VP2的编码序列，所述第二异源核苷酸序列包含ILTV gD的编码序列和ILTV gI的编码序列，且所述第三异源核苷酸序列包含NDV F的编码序列。
8.权利要求7的rMDVnp，其中所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列，且其中所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
9.权利要求7的rMDVnp，其中所述第一异源核酸包含选自SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核苷酸序列，且其中所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列。
10.权利要求4、5或6的rMDVnp，其中所述第一异源核酸包含所述第二异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列；其中所述第二异源核酸包含所述第一异源核苷酸序列；且
其中所述第一异源核苷酸序列包含IBDV VP2的编码序列，所述第二异源核苷酸序列包含ILTV gD的编码序列和ILTV gI的编码序列，且所述第三异源核苷酸序列包含NDV F的编码序列。
11.权利要求10的rMDVnp，其中所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列，或所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:31的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列。
12.权利要求4、5或6的rMDVnp，其中所述第一异源核酸包含所述第一异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列；
其中所述第二异源核酸包含所述第二异源核苷酸序列；且
且其中所述第一异源核苷酸序列包含IBDV VP2的编码序列，所述第二异源核苷酸序列包含ILTV gD的编码序列和ILTV gI的编码序列，且所述第三异源核苷酸序列包含NDV F的编码序列。
13.权利要求12的rMDVnp，其中所述第一异源核酸包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列，且所述第二异源核酸包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列。
14.权利要求1、2或3的rMDVnp，其中第一异源核苷酸序列和所述第二异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列都位于相同的非必需位点中。
15.权利要求14的rMDVnp，其中当所述非必需位点选自US2位点、UL54.5位点、UL7/8位点、UL40位点、UL43位点、UL45/46位点、UL55位点、US10位点、US10和SORF3之间的区域、US2和SORF3之间的区域、基因间区域1 (IG1)位点、基因间区域2 (IG2)位点和基因间区域3(IG3)位点。
16.权利要求1、2或3的rMDVnp，其中第一异源核苷酸序列、所述第二异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列都位于不同的非必需位点中。
17.权利要求16的rMDVnp，其中当所述三个不同的非必需位点单独地选自US2位点、UL54.5位点、UL7/8位点、UL40位点、UL43位点、UL45/46位点、UL55位点、US10位点、US10和SORF3之间的区域、US2和SORF3之间的区域、IG1位点和IG2位点。
18.权利要求1、2或3的rMDVnp，其中所述第一异源核苷酸序列和所述第二异源核苷酸序列位于第一非必需位点中，且所述第三异源核苷酸序列位于第二非必需位点中。
19.权利要求1、2或3的rMDVnp，其中所述第一异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列位于第一非必需位点中，且所述第二异源核苷酸序列位于第二非必需位点中。
20.权利要求1、2或3的rMDVnp，其中所述第二异源核苷酸序列和所述第三异源核苷酸序列位于第一非必需位点中，且所述第一异源核苷酸序列位于第二非必需位点中。
21.权利要求18、19或20的rMDVnp，其中所述第一非必需位点和所述第二非必需位点单独地选自US2位点、UL54.5位点、UL7/8位点、UL40位点、UL43位点、UL45/46位点、UL55位点、US10位点、US10和SORF3之间的区域、US2和SORF3之间的区域、基因间区域1 (IG1)位点、基因间区域2 (IG2)位点和基因间区域3 (IG3)位点。
22.权利要求3、4、5、6、7、10、12、14、15、16、17、18、19、20或21的rMDVnp，其中所述第一异源核苷酸序列的IBDV VP2蛋白的编码序列可操作地在第一启动子的控制下；所述第二异源核苷酸序列的ILTV gD蛋白的编码序列可操作地在第二启动子的控制下；所述第二异源核苷酸序列的ILTV gI蛋白的编码序列可操作地在第三启动子的控制下；且编码所述NDV F的第三异源核苷酸序列可操作地在第四启动子的控制下。
23.权利要求22的rMDVnp，其中所述第一启动子、所述第二启动子、所述第三启动子和所述第四启动子都是不同的。
24.权利要求22或23的rMDVnp，其中所述第二启动子是内源性ILTV gD启动子，所述第三启动子是内源性ILTV gI启动子，且其中所述第一启动子和所述第四启动子单独地选自鼠巨细胞病毒立即早期1基因(mCMV IE1)启动子、人巨细胞病毒立即早期1基因(hCMV IE1)启动子和鸡β-肌动蛋白启动子。
25.权利要求24的rMDVnp，其中所述第一启动子是mCMV IE1；且所述第四启动子是hCMVIE1。
26.权利要求6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、21、22、23、24或25的rMDVnp，其中所述第一非必需位点是US2位点，且所述第二非必需位点是UL54.5位点。
27.权利要求6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、21、22、23、24或25的rMDVnp，其中所述第一非必需位点是UL54.5位点，且所述第二非必需位点是US2位点。
28.任一前述权利要求的rMDVnp，其中所述rMDVnp是重组火鸡疱疹病毒(rHVT)。
29.权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27的rMDVnp，其中所述rMDVnp是重组马立克氏病病毒血清型2 (rMDV2)。
30.免疫原性组合物，其包含任一前述权利要求的rMDVnp。
31.疫苗，其包含权利要求30的免疫原性组合物。
32.用于帮助针对选自NDV、ILTV、IBDV、MDV及其任何组合的病毒保护鸡的方法，其包括施用权利要求31的疫苗。
CN201880065921.2A 2017-10-12 2018-10-11 编码多种异源抗原的重组非致病性马尔克氏病病毒构建体 Pending CN111542599A (zh)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112206317A (zh) * 2020-10-12 2021-01-12 浙江省淡水水产研究所 一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2018015756A (es) * 2016-06-17 2019-05-30 Intervet Int Bv Construcciones de virus de la enfermedad de marek recombinantes no patogenicas codificadoras de antigenos del virus de la laringotraqueitis infecciosa y del virus de la enfermedad bursal infecciosa.
CN114828882A (zh) 2019-12-20 2022-07-29 英特维特国际股份有限公司 多价hvt载体疫苗
US20240058436A1 (en) 2020-12-24 2024-02-22 Intervet Inc. Multivalent hvt vector vaccine
WO2023213946A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Intervet International B.V. New multivalent hvt vector vaccine

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101210248A (zh) * 2006-12-30 2008-07-02 河南农业大学 一种ILTV gD糖蛋白核苷酸序列和氨基酸序列及其重组的病毒疫苗以及该疫苗的应用
WO2013082317A2 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Merial Limited Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
US20140147465A1 (en) * 2011-11-30 2014-05-29 Merial Limited Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
CN103874508A (zh) * 2011-10-21 2014-06-18 英特维特国际股份有限公司 提供多价免疫的重组非致病性mdv载体
CN103890183A (zh) * 2011-10-21 2014-06-25 英特维特国际股份有限公司 编码传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体
CN104364381A (zh) * 2012-03-30 2015-02-18 法国诗华动物保健公司 多价重组禽疱疹病毒和用于免疫禽类的疫苗
WO2016102647A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Intervet International B.V. Improved hvt-vectored nd-ibd vaccine

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5928648A (en) 1985-09-06 1999-07-27 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
US5834305A (en) 1985-09-06 1998-11-10 Syntro Corporation Attenuated herpesvirus, herpesvirus which include foreign DNA encoding an amino acid sequence and vaccines containing same
US6121043A (en) 1985-09-06 2000-09-19 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys comprising a foreign DNA inserted into a non-essential region of the herpesvirus of turkeys genome
US5965138A (en) 1985-09-06 1999-10-12 Syntro Corporation Recombinant chimeric virus and uses thereof
US5961982A (en) 1985-09-06 1999-10-05 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
US4963481A (en) 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
WO1987004463A1 (en) 1986-01-27 1987-07-30 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same
US5273876A (en) 1987-06-26 1993-12-28 Syntro Corporation Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene
ES2070997T3 (es) 1989-12-04 1995-06-16 Akzo Nobel Nv Virus de herpes recombinante de pavos y vacunas vector vivas derivadas de los mismos.
WO1992003554A1 (en) 1990-08-24 1992-03-05 Arthur Webster Pty. Ltd. Infectious laryngotracheitis virus vaccine
US6183753B1 (en) 1994-08-09 2001-02-06 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant chimeric virus and uses thereof
US5853733A (en) 1993-02-26 1998-12-29 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
US6913751B2 (en) 1992-06-12 2005-07-05 Schering-Plough Veterinary Corporation Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production
US6984728B2 (en) 1993-09-24 2006-01-10 Schering Corporation Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof
FR2728795B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
FR2728794B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro
US6299882B1 (en) 1999-04-09 2001-10-09 Schering Corporation UL54.5 of Marek's disease virus (MDV)
US6764684B2 (en) 2001-09-28 2004-07-20 Zeon Corporation Avian herpesvirus-based recombinant infectious bursal disease vaccine
JP2008228658A (ja) 2007-03-20 2008-10-02 Nippon Zeon Co Ltd 新規なプロモーター、これを有する組み換え七面鳥ヘルペスウイルス、及びこれを利用した家禽用ワクチン
TWI468157B (zh) 2009-04-29 2015-01-11 Intervet Int Bv 形成錠劑的方法，進行該方法的系統及包含該錠劑的包裝物
US9114108B2 (en) 2011-11-30 2015-08-25 Merial, Inc. Recombinant HVT vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
US9555016B2 (en) 2013-06-10 2017-01-31 Covidien Lp Lytic agents for use in treating intravascular clots
EP2845904A1 (en) 2013-09-06 2015-03-11 Ceva Sante Animale Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof
MX2018015756A (es) 2016-06-17 2019-05-30 Intervet Int Bv Construcciones de virus de la enfermedad de marek recombinantes no patogenicas codificadoras de antigenos del virus de la laringotraqueitis infecciosa y del virus de la enfermedad bursal infecciosa.
ES2936117T3 (es) 2016-12-14 2023-03-14 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Vectores recombinantes de VHT que expresan múltiples antígenos de patógenos aviares y vacunas que los comprenden

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101210248A (zh) * 2006-12-30 2008-07-02 河南农业大学 一种ILTV gD糖蛋白核苷酸序列和氨基酸序列及其重组的病毒疫苗以及该疫苗的应用
CN103874508A (zh) * 2011-10-21 2014-06-18 英特维特国际股份有限公司 提供多价免疫的重组非致病性mdv载体
CN103890183A (zh) * 2011-10-21 2014-06-25 英特维特国际股份有限公司 编码传染性喉气管炎病毒和新城疫病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体
WO2013082317A2 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Merial Limited Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
US20140147465A1 (en) * 2011-11-30 2014-05-29 Merial Limited Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
CN104364381A (zh) * 2012-03-30 2015-02-18 法国诗华动物保健公司 多价重组禽疱疹病毒和用于免疫禽类的疫苗
WO2016102647A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Intervet International B.V. Improved hvt-vectored nd-ibd vaccine
CN107002097A (zh) * 2014-12-24 2017-08-01 英特维特国际股份有限公司 改进的hvt作为载体的nd‑ibd疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUDMILA STAROSTINA: "IBD vaccination:HVT vector vaccine or live" *
RUDOLF G. HEIN, CONSULTANT MICROBIOLOGIST: "Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccineswhich May Cause an Effect on the Economic Benefits ofthose Vaccines" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112206317A (zh) * 2020-10-12 2021-01-12 浙江省淡水水产研究所 一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法
CN112206317B (zh) * 2020-10-12 2023-09-22 浙江省淡水水产研究所 一种草鱼出血病二价核酸菌蜕疫苗的制备方法

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