CN101210248A - 一种ILTV gD糖蛋白核苷酸序列和氨基酸序列及其重组的病毒疫苗以及该疫苗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是为了克服弱毒疫苗的能够引起潜伏感染，提供与现有ILTV弱毒疫苗具有同等免疫效力，同时又能克服弱毒疫苗缺点的新型疫苗。一种ILTV gD糖蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列及制备方法，及其重组的疫苗，疫苗包含病毒载体和ILTV gD糖蛋白。疫苗的病毒载体是鸡痘病毒。ILTV gD糖蛋白通过同源臂重组到鸡痘病毒。该重组疫苗的制备方法。本发明克隆了ILTV河南分离株的糖蛋白gD基因，在此基础上对该重组鸡痘病毒的免疫保护性进行了动物试验研究。从而研制出与现有ILTV弱毒疫苗具有同等免疫效力，同时又能克服弱毒疫苗缺点的新型疫苗，便于规模化生产，为ILT的防制乃至最后根除ILT莫定基础。

Description

一种ILTV gD糖蛋白核苷酸序列和氨基酸序列及其重组的病毒疫苗以及该疫苗的应用

技术领域

本发明属于重组动物疫苗领域，具体就是一种ILTV gD糖蛋白核苷酸序列和氨基酸序列及其重组的病毒疫苗以及该疫苗的应用。

技术背景

鸡传染性喉气管炎流行及疫苗免疫情况

鸡传染性喉气管炎(ILT)是鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起的鸡的急性呼吸道传染病，该病传播迅速，发病率高，感染率为80-90％，死亡率为20-30％，有时高达70％，发病后可使鸡的产蛋率下降15-60％。本病在许多国家和地方流行，据报道，1925年首次在美国发现，目前欧、美、亚、澳等洲40多个国家证实有本病流行，1958年后在我国有大面积流行的报道。随着养鸡业的规模化发展，鸡传染性喉气管炎的发病率越来越高，给我国的养禽业造成较大的经济损失。

鸡传染性喉气管炎是一般通过弱毒疫苗免疫接种来防制的。起初，人们是将ILT发病鸡的喉气管分泌物，或由此分离的鸡胚强毒涂擦于鸡的泄殖腔粘膜上，可产生较坚实的免疫力，在最初控制ILT流行方面起了重要作用。但由于ILTV自身特点，易引起潜伏感染并且间歇性排毒，从而使本病在鸡群中长期存在。后来，经细胞培养传代、鸡胚传代致弱的喉气管炎病毒和经选择地方流行的温和型毒株等作为弱毒疫苗，通过眶卜窦、鼻内、滴眼、饮水途径都能使易感鸡产生预防的保护力。目前国内外预防本病所用的疫苗都是弱毒疫苗，但所有的弱毒疫苗都存在以下缺点：(1)由于该病毒的毒力与免疫原性呈正相关，因此，现用的疫苗毒力普遍偏强，接种后反应大；(2)与ILTV强毒一样，其弱毒疫苗株也能引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终生带毒；(3)疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡与鸡，鸡群与鸡群之间传播过程中毒力会返强，从而成为新的感染源；(4)到目前为止尚无有效方法可以鉴别强毒株和弱毒株。另外，鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗在制作过程中，病毒的增殖主要采用鸡胚***接种，该接种方法费时费力，且培养时间长，接种后需要继续培养6天左右收毒(采用尿囊腔接种的病毒，接种后仅需继续培养3d左右。)，并且收获的病毒量少，只有增厚的那一点***。因此，研究新型安全且有效的疫苗用于ILT的防制十分必要。

发明内容

发明专利的目的是为了克服弱毒疫苗的能够引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终生带毒成为新的传染源；其次弱毒疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡与鸡之间传播的过程中，可能会造成毒力返强现象；还有鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗在制作过程中，病毒的增殖主要采用鸡胚***接种，该接种方法费时费力，且培养时间长，接种后需要继续培养6天左右收毒，并且收获的病毒量少，只有增厚的那一点***；等等缺点，提供与现有ILTV弱毒疫苗具有同等免疫效力，同时又能克服弱毒疫苗缺点的新型疫苗，为ILT的防制乃至最后根除ILT莫定基础。本发明是这样实现的：

一种ILTV gD糖蛋白，其特征在于：具有核苷酸序列如下：ccaaagtaca gtgtggaagagcagcgcgag agcaggcgag gcgtggattt ctggccgggg 60aggcaatata tacgaatgca ccgtcctcatctcagacggc actcgcgtta ctacgcgaaa 120ggagaggtgc ttaacaaaca catggattgc ggtggaaaacggtgctgctc aggcgcagct 180gtattcactc ttttctggac ttgtgtcagg attatgcggg agcatatctgctttgtacgc 240aacgctatgg accgccattt atttttgagg aatgcttttt ggactatcgt actgctttct 300tccttcgcta gccagagcac cgccgccgtc acgtacgact acattttagg ccgtcgcgcg 360ctcgacgcgctaaccatacc ggcggttggc ccgtataaca gatacctcac tagggtatca 420agaggctgcg acgttgtcgagctcaacccg atttctaacg tggacgacat gatatcggcg 480gccaaagaaa aagagaaggg gggccctttcgaggcctccg tcgtctggtt ctacgtgatt 540aagggcgacg acggcgagga caagtactgt ccaatctatagaaaagagta cagggaatgt 600ggcgacgtac gactgctatc tgaatgcgcc gttcaatctg cacagatgtgggcagtggac 660tatgttccta gcacccttgt atcgcgaaat ggcgcgggac tgactatatt ctcccccact 720gctgcgctct ctggccaata cttgctgacc ctgaaaatcg ggagatttgc gcaaacagct 780ctcgtaactctagaagttaa cgatcgctgt ttaaagatcg ggtcgcagct taacttttta 840ccgtcgaaat gctggacaacagaacagtat cagactggat ttcaaggcga acacctttat 900ccgatcgcag acaccaatac acgacacgcggacgacgtat atcggggata cgaagatatt 960ctgcagcgct ggaataattt gctgaggaaa aagaatcctagcgcgccaga ccctcgtcca 1020gatagcgtcc cgcaagaaat tcccgctgta accaagaaag cggaagggcgcaccccggac 1080gcagaaagca gcgaaaagaa ggcccctcca gaagactcgg aggacgacat gcaggcagag1140gcttctggag aaaatcctgc cgccctcccc gaagacgacg aagtccccga ggacaccgag 1200cacgatgatc caaactcgga tcctgactat tacaatgaca tgcccgccgt gatcccggtg 1260gaggagactactaaaagttc taatgccgtc tccatgccca tattcgcggc gttcgtagcc 1320tgcgcggtcg cgctcgtggggctactggtt tggagcatcg taaaatgcgc gcgtagctaa 1380tcgagcctag aataggtg。(说明：带下划线的a和g是与标准不同的地方)

2、1所述的ILTV gD糖蛋白，其特征在于：具有如下氨基酸序列：

Met His Arg Pro His Leu Arg Arg His Ser Arg Try Try Ala Lys Gly Glu Val Leu Asn Lys His Met AspCys Gly Gly Lys Arg Cys Cys Ser Gly Ala Ala Val Phe Thr Leu Phe Trp Thr Cys Val Arg Ile Met ArgGlu His Ile Cys Phe Val Arg Asn Ala Met Asp Arg His Leu Phe Leu Arg Asn Ala Phe Trp Thr Ile ValLeu Leu Ser Ser Phe Ala Ser Glu Ser Thr Ala Ala Val Thr Try Asp Try Ile Leu Gly Arg Arg Ala LeuAsp Ala Leu Thr Ile Pro Ala Val Gly Pro Try Asn Arg Try Leu Thr Arg Val Ser Arg Gly Cys Asp ValVal Glu Leu Asn Pro Ile Ser Asn Val Asp Asp Met Ile Ser Ala Ala Lys Glu Lys Glu Lys Gly Gly ProPhe Glu ALA Ser Val Val Trp Phe Try Val Ile Lys Gly Asp Asp Gly Glu Asp Lys Try Cys Pro Ile TryArg Lys Glu Try Arg Glu Cys Gly Asp Val Arg Leu Leu Ser Glu Cys Ala Val Gln Ser Ala Gln Met TrpAla Val Asp Try Val Pro Ser Thr Leu Val Ser Arg Asn Gly Ala Gly Leu Thr Ile Phe Ser Pro Thr AlaAla Leu Ser Gly Gln Try Leu Leu Thr Leu Lys Ile Gly Arg Phe Ala Gln Thr Ala Leu Val Thr Leu GluVal Asn Asp Arg Cys Leu Lys Ile Gly Ser Gln Leu Asn Phe Leu Pro Ser Lys Cys Trp Thr Thr gLU GlnTry Gln Thr Gly Phe Gln Gly Glu His Leu Try Pro Ile Ala Asp Thr Asn Thr Arg His Ala Asp Asp ValTry Arg Gly Try Glu Asp Ile Leu Gln Arg Trp Asn Asn Leu Leu Arg Lys Lys Asn Pro Ser Ala Pro AspPro Arg Pro Asp Ser Val Pro Gln Glu Ile Pro Ala Ver Thr Lys Lys Ala Glu Gly Arg Thr Pro Asp AlaGlu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Pro Pro Glu Asp Ser Glu Asp Asp Met Gln Ala Glu Ala Ser Gly Glu AsnPro Ala Ala Leu Pro Glu Asp Asp Glu Val Pro Glu Asp Thr Glu His Asp Asp Pro Asn Ser Asp Pro AspTry Try Asn Asp Met Pro Ala Val Ile Pro Val Glu Glu Thr Thr Lys Ser Ser Asn Ala Ver Ser Met ProIle Phe Ala Ala Phe Val Ala Cys Ala Ver Ala Leu Val Gly Leu Leu Val Trp Ser Ile Val Lys Cys AlaArg Ser。(说明：带下划线的Ile和Arg是与标准不同的地方)

3、2所述的ILTV gD糖蛋白，其特征在于，通过以下步骤制得：

A、收集病料：采自病鸡的喉头和气管组织；

B、病毒的分离：采集的病料剪碎后按1∶10的比例加入PBS溶液，同时加入青、链霉素(2000U/ml)，反复冻融三次后，离心取上清，-20℃保存；所取上清就是分离的病毒。

C、鸡胚接种和传代：病毒增殖采用鸡胚***接种法，将分离病毒0.2ml经***接种于10日龄的SPF鸡胚中，每日照蛋观察，弃去48h内死亡的鸡胚，收集120h活胚的***，剪碎研磨，加入适量PBS稀释，按2000U(μg)/ml加入青、链霉素，置4℃冰箱作用3h，反复冻融三次，离心取上清，置-20℃保存。

D、琼扩试验：用标准的阳性血清作为琼扩抗体，分离毒株作为琼扩抗原，在1.5％的琼脂板上，进行打孔、加样，置37℃湿盒中24h；

E、病毒DNA的提取：取病毒液300μl，加入300μl裂解液(0.01mol/L Tris-HCl，PH7.9，0.01mol/L EDTA，0.25％Triton-100，5mol/L异硫氰酸胍(GSCN))，37℃水浴15min；加等体积饱合酚抽提，14000r/min离心5min，取上清；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，离心取上清；加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，取上清；加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30min；然后4℃14000rpm离心10min，用70％预冷的乙醇洗涤两次，以14000g离心5min，弃去乙醇，晾干后加入适量的TE悬浮，-20℃保存。

F、PCR扩增及产物的凝胶电泳：分别以病毒的DNA为模板，进行gD的PCR扩增。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳。

G、PCR产物的回收纯化：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下切下目的条带，用DNA快速纯化回收试剂盒回收纯化凝胶中的目的片段。

H、回收纯化的PCR产物与克隆载体的连接  回收纯化的PCR产物与pGEM-T载体在16℃进行连接过夜。

I、连接产物的转化：取10μl的连接产物加入60ul JM109中，冰浴30min；42℃90s热激；冰浴2min后；加入950μl无Amp的LB，37℃摇振1h；8000rpm离心5min弃上清，沉淀加入LB培养基悬浮后，加入到事先涂有x-gal和IPTG平板上，涂匀后，37℃培养12-16h。

J、提取转化产物质粒：挑取单个白色菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养12-16h，提取质粒。

K、克隆阳性质粒鉴定：提取的质粒采用PCR扩增目的片断和用Not I酶切的方法进行筛选和鉴定阳性克隆质粒。

L、经质粒PCR和酶切鉴定为阳性质粒的菌液经(上海生物工程有限公司测序)测得gD基因的氨基酸序列为：Met His Arg Pro His Leu Arg Arg His Ser Arg Try Try Ala Lys Gly Glu Val LeuAsn Lys His Met Asp Cys Gly Gly Lys Arg Cys Cys Ser Gly Ala Ala Val Phe Thr Leu Phe Trp Thr CysVal Arg Ile Met Arg Glu His Ile Cys Phe Val Arg Asn Ala Met Asp Arg His Leu Phe Leu Arg Asn AlaPhe Trp Thr Ile Val Leu Leu Ser Ser Phe Ala Ser Glu Ser Thr Ala Ala Val Thr Try Asp Try Ile LeuGly Arg Arg Ala Leu Asp Ala Leu Thr Ile Pro Ala Val Gly Pro Try Asn Arg Try Leu Thr Arg Val SerArg Gly Cys Asp Val Val Glu Leu Asn Pro Ile Ser Asn Val Asp Asp Met Ile Ser Ala Ala Lys Glu LysGlu Lys Gly Gly Pro Phe Glu ALA Ser Val Val Trp Phe Try Val Ile Lys Gly Asp Asp Gly Glu Asp LysTry Cys Pro Ile Try Arg Lys Glu Try Arg Glu Cys Gly Asp Val Arg Leu Leu Ser Glu Cys Ala Val GlnSer Ala Gln Met Trp Ala Val Asp Try Val Pro Ser Thr Leu Val Ser Arg Ash Gly Ala Gly Leu Thr IlePhe Ser Pro Thr Ala Ala Leu Ser Gly Gln Try Leu Leu Thr Leu Lys Ile Gly Arg Phe Ala Gln Thr AlaLeu Val Thr Leu Glu Val Asn Asp Arg Cys Leu Lys Ile Gly Ser Gln Leu Asn Phe Leu Pro Ser Lys CysTrp Thr Thr gLU Gln Try Gln Thr Gly Phe Gln Gly Glu His Leu Try Pro Ile Ala Asp Thr Asn Thr ArgHis Ala Asp Asp Val Try Arg Gly Try Glu Asp Ile Leu Gln Arg Trp Asn Asn Leu Leu Arg Lys Lys AsnPro Ser Ala Pro Asp Pro Arg Pro Asp Ser Val Pro Gln Glu Ile Pro Ala Ver Thr Lys Lys Ala Glu GlyArg Thr Pro Asp Ala Glu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Pro Pro Glu Asp Ser Glu Asp Asp Met Gln Ala GluAla Ser Gly Glu Asn Pro Ala Ala Leu Pro Glu Asp Asp Glu Val Pro Glu Asp Thr Glu His Asp Asp ProAsn Ser Asp Pro Asp Try Try Asn Asp Met Pro Ala Val Ile Pro Val Glu Glu Thr Thr Lys Ser Ser AsnAla Ver Ser Met Pro Ile Phe Ala Ala Phe Val Ala Cys Ala Ver Ala Leu Val Gly Leu Leu Val Trp SerIle Val Lys Cys Ala Arg Ser。

M、DNASTAR软件软件推导ILTV gD的核苷酸序列：

ccaaagtaca gtgtggaaga gcagcgcgag agcaggcgag gcgtggattt ctggccgggg 60aggcaatatatacgaatgca ccgtcctcat ctcagacggc actcgcgtta ctacgcgaaa 120ggagaggtgc ttaacaaacacatggattgc ggtggaaaac ggtgctgctc aggcgcagct 180gtattcactc ttttctggac ttgtgtcaggattatgcggg agcatatctg ctttgtacgc 240aacgctatgg accgccattt atttttgagg aatgctttttggactatcgt actgctttct 300tccttcgcta gccagagcac cgccgccgtc acgtacgact acattttaggccgtcgcgcg 360ctcgacgcgc taaccatacc ggcggttggc ccgtataaca gatacctcac tagggtatca 420agaggctgcg acgttgtcga gctcaacccg atttctaacg tggacgacat gatatcggcg 480gccaaagaaaaagagaaggg gggccctttc gaggcctccg tcgtctggtt ctacgtgatt 540aagggcgacg acggcgaggacaagtactgt ccaatctata gaaaagagta cagggaatgt 600ggcgacgtacgactgctatc tgaatgcgccgttcaatctg cacagatgtg ggcagtggac 660tatgttccta gcacccttgt atcgcgaaat ggcgcgggactgactatatt ctcccccact 720gctgcgctct ctggccaata cttgctgacc ctgaaaatcg ggagatttgcgcaaacagct 780ctcgtaactc tagaagttaa cgatcgctgt ttaaagatcg ggtcgcagct taacttttta 840ccgtcgaaat gctggacaac agaacagtat cagactggat ttcaaggcga acacctttat 900ccgatcgcagacaccaatac acgacacgcg gacgacgtat atcggggata cgaagatatt 960ctgcagcgct ggaataatttgctgaggaaa aagaatccta gcgcgccaga ccctcgtcca 1020gatagcgtcc cgcaagaaat tcccgctgtaaccaagaaag cggaagggcg caccccggac 1080gcagaaagca gcgaaaagaa ggcccctcca gaagactcggaggacgacat gcaggcagag 1140gcttctggag aaaatcctgc cgccctcccc gaagacgacg aagtccccgaggacaccgag 1200cacgatgatc caaactcgga tcctgactat tacaatgaca tgcccgccgt gatcccggtg1260gaggagacta ctaaaagttc taatgccgtc tccatgccca tattcgcggc gttcgtagcc 1320tgcgcggtcg cgctcgtggg gctactggtt tggagcatcg taaaatgcgc gcgtagctaa 1380tcgagcctagaataggtg

4、3所述的ILTV gD糖蛋白基因制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、收集病料：采自病鸡的喉头和气管组织

B、病毒的分离：采集的病料剪碎后按1∶10的比例加入PBS溶液，同时加入青、链霉素(2000U/ml)，反复冻融三次后，离心取上清，-20℃保存；所取上清就是分离的病毒。

C、鸡胚接种和传代：病毒增殖采用鸡胚***接种法，将分离病毒0.2ml经***接种于10日龄的SPF鸡胚中，每日照蛋观察，弃去48h内死亡的鸡胚，收集120h活胚的***，剪碎研磨，加入适量PBS稀释，按2000U(μg)/ml加入青、链霉素，置4℃冰箱作用3h，反复冻融三次，离心取上清，置-20℃保存。

D、琼扩试验：用标准的阳性血清作为琼扩抗体，分离毒株作为琼扩抗原，在1.5％的琼脂板上，进行打孔、加样，置37℃湿盒中24h；

E、病毒DNA的提取：取病毒液300μl，加入300μl裂解液(0.01mol/L Tris-HCl，PH7.9，0.01mol/L EDTA，0.25％Triton-100，5mol/L异硫氰酸胍(GSCN))，37℃水浴15min；加等体积饱合酚抽提，14000r/min离心5min，取上清；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提-次，离心取上清；加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，取上清；加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30min；然后4℃14000rpm离心10min，用70％预冷的乙醇洗涤两次，以14000g离心5min，弃去乙醇，晾干后加入适量的TE悬浮，-20℃保存；

F、PCR扩增及产物的凝胶电泳：分别以病毒的DNA为模板，用引物进行gD的PCR扩增；PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳。

G、PCR产物的回收纯化：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下切下目的条带，用DNA快速纯化回收试剂盒回收纯化凝胶中的目的片段。

H、回收纯化的PCR产物与克隆载体的连接回收纯化的PCR产物与pGEM-T载体在16℃进行连接过夜。

I、连接产物的转化：取10μl的连接产物加入60μl JM109中，冰浴30min；42℃90s热激；冰浴2min后；加入950μl无Amp的LB，37℃摇振1h；8000rpm离心5min弃上清，沉淀加入LB培养基悬浮后，加入到事先涂有x-gal和IPTG平板上，涂匀后，37℃培养12-16h。

J、提取转化产物质粒：挑取单个白色菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养12-16h，提取质粒。

K、克隆阳性质粒鉴定：提取的质粒采用PCR扩增目的片断和用Not I酶切的方法进行筛选和鉴定阳性克隆质粒。

L、经质粒PCR和酶切鉴定为阳性质粒的菌液经(上海生物工程有限公司测序)测得gD基因的氨基酸序列。

M、DNASTAR软件推导ILTV gD的cDNA序列。

5、1、2、3、4任一所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗，其特征在于：疫苗包含病毒载体和ILTV gD糖蛋白。

6、5所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗，其特征在于：疫苗的病毒载体是鸡痘病毒。

7、6所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗，其特征在于：ILTV gD糖蛋白通过同源臂重组到鸡痘病毒。

8、6所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗，其特征在于：通过以下步骤制得：

(一)PCR扩增gD基因，并将其分别克隆到pGEM-T载体上。

(二)gD基因通过EcoRl位点亚克隆到pSY538载体鸡痘病毒早晚期启动子EP2LP2下游处，命名为pSY538-gD。

(三)将来自pSC11质粒的痘苗病毒启动子P11控制下的大肠杆菌LacZ基因通过平端连接克隆到pSY538-gD质粒的SmaI位点，命名为pSY538-gD-LacZ。

(四)再将含EP2LP2-gD基因和P11-LacZ基因的Not I酶切片段从pSY538-gD-LacZ质粒中切下，将其亚克隆到含有FPV EcoR1DNA非必需片段的pSY681质粒的NotI位点上，构建成含有gD目的基因和LacZ报告基因的FPV转移质粒，命名为pSY681-gD-LacZ。

(五)重组鸡痘病毒转移载体质粒pSY681-gD-LacZ转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，然后经蓝斑筛选、纯化，并进行PCR鉴定后，采用IFA检测糖蛋白gD的表达情况。

(六)重组鸡痘病毒弱毒疫苗对SPF鸡的免疫保护性试验研究。

9、6所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)PCR扩增gD基因，并将其分别克隆到pGEM-T载体上；

(二)gD基因通过EcoRl位点亚克隆到pSY538载体鸡痘病毒早晚期启动子EP2LP2下游处，命名为pSY538-gD；

(三)将来自pSC11质粒的痘苗病毒启动子P11控制下的大肠杆菌LacZ基因通过平端连接克隆到pSY538-gD质粒的SmaI位点，命名为pSY538-gD-LacZ；

(四)再将含EP2LP2-gD基因和P11-LacZ基因的Not I酶切片段从pSY538-gD-LacZ质粒中切下，将其亚克隆到含有FPV EcoR1DNA非必需片段的pSY681质粒的NotI位点上，构建成含有gD目的基因和LacZ报告基因的FPV转移质粒，命名为pSY681-gD-LacZ；

(五)重组鸡痘病毒转移载体质粒pSY681-gD-LacZ转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，然后经蓝斑筛选、纯化，并进行PCR鉴定后，采用IFA检测糖蛋白gD的表达情况。

10、4、5、6和7任一所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗的应用，其特征在于：ILTV gD糖蛋白重组的疫苗在免疫鸡传染性喉气管炎上的应用。

本发明克隆了ILTV河南分离株的糖蛋白gD基因，选用当前国际上公认的优良活病毒载体-鸡痘病毒(FPV)作为载体，用脂质体转染法构建了含ILTV搪蛋白gD基因的重组FPV。通过免疫试验分析该重组鸡痘病毒能够稳定表达ILTV糖蛋白gD。在此基础上对该重组鸡痘病毒的免疫保护性进行了动物试验研究。从而研制出与现有ILTV弱毒疫苗具有同等免疫效力，同时又能克服弱毒疫苗缺点的新型疫苗，为ILT的防制乃至最后根除ILT莫定基础。因为在禽类疫病中，与NDV，IBDV，MDV，IBV等相比，ILTV具有自身的生物学及生态学特征，而这些特征恰恰为根除该病提供了可能。比如，ILTV在外界环境中易于灭活，它不经蛋垂直传播，因此处于感染状态的禽群不能传染给子代鸡；鸡是ILTV的唯一宿主；ILTV感染的水平经常是很低的，感染仅发生于前7天；能通过严格的检疫等生物综合防治措施很容易阻止ILTV的传播；有效免疫能完全抵抗ILTV强毒攻击，在免疫后4-5个月，ILTV强毒的复制能被阻止于气管表面；ILTV的抗原变异很少，因此一种有效的疫苗就能保护所有ILTV强毒株；ILTV保护性免疫是以细胞介导的免疫为主，母源抗体不会干扰免疫接种。如我们研制的鸡痘病毒和鸡传染性喉气管炎病毒二价基因工程疫苗如用于生产，那么我们就很容易结合血清学方法来区别疫苗免疫鸡和自然感染鸡，因此完全可能在一个国家或一个地区根除ILT相信在不久的将来，局部根除ILT一定会成为现实。

本发明的基因工程疫苗用于生产，可以在鸡胚成纤维细胞上大量增长繁殖，便于规模化生产，且省时省力，又能节约大量生产成本；如应用我们研制的鸡痘病毒和鸡传染性喉气管炎病毒二价基因工程疫苗，那么就很容易结合血清学方法来区别疫苗免疫鸡和自然感染鸡，使在一个国家或一个地区根除ILT成为现实，从而大大减少养鸡业的经济损失。

附图说明

图1ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中病毒在鸡胚***上增殖；

图2ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中分离病毒琼扩试验；

图3ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中PCR扩增gC基因电泳结果1.DNA Marker 2.喉头3.气管；

图4ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中PCR扩增gD基因电泳结果1.DNA Marker 2.喉头3.气管；

图5ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中gC基因阳性质粒酶切结果1.4.DNA Marker 2.3.阳性质粒酶切；

图6ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中gD基因阳性质粒酶切结果1.5.DNA Marker 2.3.4.阳性质粒酶切；

图7ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中长葛株gC基因序列和GenBank中gC序列比较；

图8ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中长葛株gD基因序列和GenBank中gD序列比较；

图9ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中长葛株gC氨基酸序列和GenBank中gC序列比较；

图10ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序试验报告中长葛株gD氨基酸序列和GenBank中gD序列比较；

图11ILTV河南长葛株gD基因在重组痘病毒中的表达及其免疫效力检测试验报告中重组质粒pSY538-gD EcoR I酶切1.5.DNA Marker；2.3.4.阳性质粒酶切；

图12ILTV河南长葛株gD基因在重组痘病毒中的表达及其免疫效力检测试验报告中重组质粒pSY538-gD Xba I酶切1.6.DNA Marker；2.3.4.5.阳性质粒酶切；

图13ILTV河南长葛株gD基因在重组痘病毒中的表达及其免疫效力检测试验报告中重组质粒pSY538-gD-LacZ NotI酶切1.4.DNA Marker 2.重组阳性质粒；

图14ILTV河南长葛株gD基因在重组痘病毒中的表达及其免疫效力检测试验报告中重组质粒pSY681-gD-LacZ Not I酶切1.DNA Marker 3.4.重组阳性质粒；

图15ILTV河南长葛株gD基因在重组痘病毒中的表达及其免疫效力检测试验报告中蓝斑筛选重组病毒；

图16ILTV河南长葛株gD基因在重组痘病毒中的表达及其免疫效力检测试验报告中IFA检测重组病毒gD糖蛋白的表达。

具体实施方式

本发明的设计思想

1、ILTV的基因组及其编码的主要蛋白

鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)属疱疹病毒科，A型疱疹病毒属，是一种20面体对称的双链DNA囊膜病毒，由162个长形空心颗粒组成，完整成熟病毒粒子直径约180-250nm，病毒DNA分子量约为100×10⁶道尔顿，DNA的G+C百分率45％，低于其它动物的疱疹病毒。在细胞核内呈散在或结晶状排列。目前认为该病毒只有一个血清型。

ILTV基因组为155kb的双链线性DNA分子，基因组由1个120kb的长独特区(UL)和1个17kb的短独特区(US)组成。US两端分别排列着一个9kb的反向重复序列IRS。York等用5组针对ILTV结构蛋白的单克隆抗体对ILTV糖蛋白进行测定，将它们分为5群，但主要有以下两群：一群为205KD复合系糖蛋白，包括205、160、115、90和85KD糖蛋白；另一群为单一的60KD糖蛋白。这些糖蛋白是引起宿主免疫反应的主要抗原物质，定位于US区的60KD糖蛋白与其它疱疹病毒没有同源性，是ILTV特有的。到目前为止，ILTV基因组中已有1/3片段进行了序列分析，其中已经鉴定的编码基因有UL区的gB、TK、gC、gK、ICP27、Helicase、gH、dUTpase、TIF和ILTV独有的ORFA、ORFB、ORFC、ORFD、ORFE、gL等，US区的UL47、PK、gX、gp60、gE、gI基因，反向重复区的ICP40、TK、gX、gC、gI、gE等基因都是非必需的，可用于构建活病毒载体及基因缺失减毒疫苗；gC、gB、gD等是主要保护性抗原的编码基因，可用于构建病毒活载体疫苗。

2、ILTV gD基因

对其它疱疹病毒的相关研究表明，gD对病毒的吸附及穿入也是必需的，也是病毒繁殖的必须基因。gB、gC、gD能诱导机体产生细胞和体液免疫应答，BHV-1gD能引起比gB、gC更强的细胞免疫应答，抗gD抗体有更高的中和效价(Hutchingsetal，1990)，HSV-1的gD产生的中和抗体水平最高，gB、gD均能抵抗HSV的攻击(Ghiasi et al，1994；Lanky et al，1984)，PRV的gD亚单位苗能够抵抗PRV的致死性攻击(Marchioli etal 1987)。在EHV-1杆状病毒表达的gB、gC、gD单独或联合使用均能产生保护性细胞和体液免疫应答(Packiarajah et al，1997)。

3、鸡痘病毒载体简介

用活病毒作为载体表达其它病原的保护性抗原基因为改进现有常规疫苗带来了契机，它具有活的弱毒疫苗的一切优点，而且也具有自己的独特优势，是动物基因工程疫苗研究中最有发展前途的领域。近十年来已经取得了许多可喜的进展，用鸡痘病毒作为研制禽病原基因工程的活病毒载体，具有巨大的开发潜力。其主要优点是：(I)基因组大约300kb左右，其中包含大量的病毒繁殖的非必需基因，因此可以包含大量的外源基因片段，可用于构建多价基因工程疫苗；(2)可引起体液免疫和细胞介导的免疫；(3)与其它痘病毒一样，鸡痘病毒的DNA是在细胞质中合成的，有自己特有的DNA聚合酶***，不会像其它在细胞核内复制的DNA病毒有将病毒基因组整合入宿主细胞染色体中而引起宿主细胞特性改变之忧；(4)鸡痘病毒疫苗用于商业疫苗已经有70多年的历史了，该疫苗仅引起中度限制性感染；(5)鸡痘病毒仅感染禽类和禽类衍生细胞；(6)鸡痘病毒能在鸡胚成纤维细胞，皮肤细胞和一些禽衍生细胞系上很容易地增殖，因此其生产工艺简单、生产成本低廉。许多学者已经用鸡痘病毒载体表达几种禽病病原的保护性抗原基因，如禽流感病毒的血凝素基因(HA)、新城疫病毒的融合蛋白(F)基因和神经氨酸酶(HIV)基因、马立克氏病病毒的糖蛋白(gB)基因、鸡传染性法氏囊病毒VP2基因、禽网状内皮增生症病毒的囊膜糖蛋白基因，并且大多数获得表达的外源基因也提供了特异性的保护作用。

5、本发明的技术路线

1、ILTV河南地方株的分离鉴定

2、PCR扩增gD基因，并将其克隆到pGEM-T载体上

3、将gD基因通过EcoR I位点亚克隆到pSY538质粒鸡痘病毒早晚期启动子EP2LP2下游处，命名为pSY538-gD

4、将来自pSC11质粒的痘苗病毒启动子P11控制下的大肠杆菌LacZ基因通过平端连接克隆到pSY538-gD质粒的SmaI位点，命名为pSY538-gD-LacZ

5、将含EP2LP2-gD基因和P11-LacZ基因的Not I片段分别从pSY538-gD-LacZ质粒中切下，将其亚克隆到含有FPV EcoR1DNA非必需片段的pSY681质粒的NotI位点上，构建成含有gD目的基因和LacZ报告基因的FPV转移质粒，命名为pSY681-gD-LacZ

6、重组鸡痘病毒转移载体质粒pSY681-gD-LacZ转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，然后经蓝斑筛选、纯化，并进行PCR鉴定后，用IFA检测糖蛋白gD的表达情况

7、重组鸡痘病毒二价疫苗对SPF鸡的免疫保护性试验研究

实施例1

ILTV河南长葛株分离鉴定及其gC、gD全基因克隆测序

摘要：通过对河南长葛某养鸡场发病鸡喉头和气管等病料进行病毒的分离鉴定，获得一株ILTV河南长葛株；扩增并克隆了ILTV河南长葛株的gC、gD全基因测序；经过分析，其核苷酸序列和氨基酸序列与GenBank读取的ILTV gC、gD核苷酸序列和氨基酸序列同源性很高，均在99.3％-99.9％之间，说明ILTV gC、gD基因相对比较保守，ILTV的抗原基因变异很少，因此采用一种有效的疫苗就能保护所有ILTV强毒株的攻击，使局部根除ILT成为现实。

关键词：鸡传染性喉气管炎病毒；gC基因；gD基因；克隆

鸡传染性喉气管炎(ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus，ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病，该病发病率高，传播迅速，发病后可使蛋鸡的产蛋率下降15-60％，雏鸡的生长发育受阻，影响后期的生产性能，给养鸡业造成很大的经济损失。2005年10月河南长葛某养鸡场约有20％的蛋鸡出现呼吸困难、打喷嚏、痉挛性咳嗽、且咳出血样渗出物为主要特征的病鸡，有的呼吸时头颈高抬，有的因呼吸器官堵塞而窒息死亡。本实验室采集多份发病鸡的喉头和气管等病料，进行病毒的分离鉴定。结果从多份样品中分离鉴定到传染性喉气管炎病毒。ILTV属于α-疱疹病毒，其主要的抗原蛋白包括gC、gD等糖蛋白，病毒的这些糖蛋白能够使疱疹病毒诱发产生体液免疫和细胞免疫，因此笔者克隆gC、gD基因并进行了测序比较，现报告如下。

1.材料与方法

1.1材料

病料：采自河南长葛某养鸡场病鸡的喉头和气管组织。

10日龄SPF鸡胚：种蛋购自北京梅里亚亚维通实验动物技术有限公司，由本实验室孵化机孵化。

标准阳性血清：购自中国兽药监察所。

PCR扩增gC、gD所用引物根据GenBank(NC-006623)报告序列设计gC、gD二对引物，由上海生工合成。

主要试剂：TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶EcoR I、Not I等购自宝生物工程(大连)有限公司，T4 DNA Ligase和琼脂糖为美国Promega产品。

1.2病毒的分离采集的病料剪碎后按1∶10的比例加入PBS溶液，同时加入青、链霉素(2000U/ml)，反复冻融三次后，离心取上清，-20℃保存备用。

1.3鸡胚接种和传代  病毒增殖采用鸡胚***接种法，将分离病毒经***接种于10目龄的SPF鸡胚中，每胚0.2ml，每日照蛋观察，弃去48h内死亡的鸡胚，收集120h活胚的***，剪碎研磨，加入适量PBS稀释，按2000U(μg)/ml加入青、链霉素，置4℃冰箱作用3h，反复冻融三次，离心取上清，置-20℃保存备用。

1.4琼扩试验  用标准的阳性血清作为琼扩抗体，分离毒株作为琼扩抗原，在1.5％的琼脂板上，按照常规方法打孔、加样，置37℃湿盒中，24h后观察结果。

1.5病毒DNA的提取  取病毒液300μl，加入300μl裂解液(0.01mol/L Tris-HCl，PH7.9，0.01mol/L EDTA，0.25％Triton-100，5mol/L异硫氰酸胍(GSCN))，37℃水浴15min；加等体积饱合酚抽提，14000r/min离心5min，取上清；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，离心取上清；加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，取上清；加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30min；然后4℃14000rpm离心10min，用70％预冷的乙醇洗涤两次，以14000g离心5min，弃去乙醇，晾干后加入适量的TE悬浮，-20℃保存备用。

1.6PCR扩增及产物的凝胶电泳  分别以病毒的DNA为模板，进行gC、gD的PCR扩增。

PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳。

1.7PCR产物的回收纯化  PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下切下目的条带，用DNA快速纯化回收试剂盒回收纯化凝胶中的目的片段。具体操作步骤按照纯化回收试剂盒的说明书进行操作。

1.8回收纯化的PCR产物与克隆载体的连接  回收纯化的PCR产物与pGEM-T载体在16℃进行连接过夜。

1.9连接产物的转化  取10μl的连接产物加入60μl JM109中，冰浴30min；42℃90s热激；冰浴2min后；加入950μl LB(无Amp)，37℃摇振1h；8000rpm离心5min弃上清，沉淀加入LB培养基悬浮后，加入到事先涂有x-gal和IPTG平板上，涂匀后，37℃培养12-16h。

1.10转化产物质粒提取  挑取单个白色菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养12-16h，提取质粒(按照《基因工程原理》小量质粒提取方法)进行。

1.11克隆阳性质粒鉴定  提取的质粒采用PCR扩增目的片断和用Not I酶切的方法进行筛选和鉴定阳性克隆质粒。

1.12克隆阳性质粒序列测定  经质粒PCR和酶切鉴定为阳性质粒的菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测定。

2.结果

2.1病毒在鸡胚***上增殖情况  病毒接种在鸡胚***上继续孵育6d后，可见鸡胚***增厚并长有痘斑，如图1。

2.1琼扩试验  分离病毒琼扩试验结果见图2。

2.2PCR产物的凝胶电泳  以病毒的DNA为模板，进行gC、gD基因的PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，结果见图3和图4。

2.3阳性质粒酶切鉴定  克隆阳性质粒酶切鉴定结果见图5和图6。

2.4阳性质粒测序结果

含gC基因阳性质粒测序如下：

GACTAGGGCATTCACGACTCAACATGCAGCATCAGAGTACTGCGCTAGTTTCGAGTATACTTTTGCTCTTGAGCCTGCAAAGCCTTGCGTTTGAATTTTTCTGTGATCCGCCACACGTTTTTCGAGGGCAGCTCGGTGACCCCATTCTATTGCAATGCTTCAGCGACAGACCTCTAACCCACGAAGAATCTGTAAAGGTAGAAGTAATTCGACACCCAGCCAGCTTAGTTGAAACTGCGCTAAGCGCCTACGGGATCCCCCCTTCGCTAGATCCATGGAGAGCTACTCCAAGAACTCTCTACACATATGATGCCGCTACTGATTCAATCAAGGACCTAGGATACATTGGTGAAGATGGAATTAACCCACCATATTTGGACGACTGTCGTTCAGGTTTTTTCAATGTCTCTATCAAGTCTAGCATGAGATCTCACATGGCGCGTTATCAGTGGACCGCAAGTCGAGGGTCTACAAAACTAAATAGCTCTTTTATCGACGTCTTTTTGGCAAGACCACCTACAACTGTCCGCATCAAATCAGAAGAACTGTACGAAGACTCAGATAAGGCTTCGCACTTAAGTGTTGAAGCGCTTGGCGCTTATCCTCCATCTGCTGCGCTGGGTACATGGATGATACATAATGCATCTCTTGCTGAAAAATACAGTTTAGAAAGAAGAGTTCTTTATGCATCAGGAGAGAATGGATCGGTGGATCAGACATGGGAACTGGAAATACGTGGAGAAGCCAGCCAGCCCCTCCCTTCCAAAATTCAATTTGTATATCGATGGACCCCTCCTGAGGACTTTGAAATGCTACGACCTGAAACTCGCTTGTTAAGGTTGACTCCCAGCTGGATTAGCAAGCCCCGCATCACGGTACAATTCGTCCCTCCTGCCTATGCCCTGTGTAGAGCAGCTAATATTATAGACGGCCGAGGATTTATTGAATGGATCGTAGATAATAGAATTTCGACGAGCCCACACCAGACCTTTGTTTTGGATGAGCCCGAGGGGAAAAATATCGTTACACTAATGGACGTCATAAAACTACCACCGGAGGATACATTTCAATCTGCCTCTAATTACGTGTGCGTCATAAGAGGCTATGAACATGCATACAGATATCTCAACGCCTCCTTAATGATAGATAATCTGCCAATGCGGCAAGGATTCCCCGCAGTCGCTGCGATTTTTATTATAATTAGTATCGCTTTTGTGGGTGGGTTACTAGTTGCTTGCTTGGGCGCATGGTGCTGGAAGACAACATAAA

含gD基因阳性质粒测序结果如下：

CCAAAGTACAGTGTGGAAGAGCAGCGCGAGAGCAGGCGAGGCGTGGATTTCTGGCCGGGGAGGCAATATATACGAATGCACCGTCCTCATCTCAGACGGCACTCGCGTTACTACGCGAAAGGAGAGGTGCTTAACAAACACATGGATTGCGGTGGAAAACGGTGCTGCTCAGGCGCAGCTGTATTCACTCTTTTCTGGACTTGTGTCAGGATTATGCGGGAGCATATCTGCTTTGTACGCAACGCTATGGACCGCCATTTATTTTTGAGGAATGCTTTTTGGACTATCGTACTGCTTTCTTCCTTCGCTAGCCAGAGCACCGCCGCCGTCACGTACGACTACATTTTAGGCCGTCGCGCGCTCGACGCGCTAACCATACCGGCGGTTGGCCCGTATAACAGATACCTCACTAGGGTATCAAGAGGCTGCGACGTTGTCGAGCTCAACCCGATTTCTAACGTGGACGACATGATATCGGCGGCCAAAGAAAAAGAGAAGGGGGGCCCTTTCGAGGCCTCCGTCGTCTGGTTCTACGTGATTAAGGGCGACGACGGCGAGGACAAGTACTGTCCAATCTATAGAAAAGAGTACAGGGAATGTGGCGACGTACGACTGCTATCTGAATGCGCCGTTCAATCTGCACAGATGTGGGCAGTGGACTATGTTCCTAGCACCCTTGTATCGCGAAATGGCGCGGGACTGACTATATTCTCCCCCACTGCTGCGCTCTCTGGCCAATACTTGCTGACCCTGAAAATCGGGAGATTTGCGCAAACAGCTCTCGTAACTCTAGAAGTTAACGATCGCTGTTTAAAGATCGGGTCGCAGCTTAACTTTTTACCGTCGAAATGCTGGACAACAGAACAGTATCAGACTGGATTTCAAGGCGAACACCTTTATCCGATCGCAGACACCAATACACGACACGCGGACGACGTATATCGGGGATACGAAGATATTCTGCAGCGCTGGAATAATTTGCTGAGGAAAAAGAATCCTAGCGCGCCAGACCCTCGTCCAGATAGCGTCCCGCAAGAAATTCCCGCTGTAACCAAGAAAGCGGAAGGGCGCACCCCGGACGCAGAAAGCAGCGAAAAGAAGGCCCCTCCAGAAGACTCGGAGGACGACATGCAGGCAGAGGCTTCTGGAGAAAATCCTGCCGCCCTCCCCGAAGACGACGAAGTCCCCGAGGACACCGAGCACGATGATCCAAACTCGGATCCTGACTATTACAATGACATGCCCGCCGTGATCCCGGTGGAGGAGACTACTAAAAGTTCTAATGCCGTCTCCATGCCCATATTCGCGGCGTTCGTAGCCTGCGCGGTCGCGCTCGTGGGGCTACTGGTTTGGAGCATCGTAAAATGCGCGCGTAGCTAATCGAGCCTAGAATAGGTG

2.4序列比较结果  图7和图8为ILTV长葛分离株gC、gD测序序列与GenBank公布的ILTVgC、gD基因序列进行比较分析，由图中可以看出，ILTV长葛分离株gC、gD测序序列与GenBank读取的ILTVgC、gD序列相比，具有很高的同源性，分别为99.8％和99.9％；图9和图10为长葛分离株gC、gD基因的氨基酸序列与GenBank公布的ILTVgC、gD氨基酸序列比较分析，从图中可以看出长葛分离株gC、gD氨基酸序列和GenBank读取的ILTVgC、gD氨基酸序列同源性在99.3％以上，说明ILTV长葛分离株gC、gD基因相对比较保守，变异性较小。

3.讨论

从病毒分离、鸡胚***接种和琼扩试验证明分离的病毒为鸡传染性喉气管炎病毒。鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)属疱疹病毒科，A型疱疹病毒属，是一种20面体对称的囊膜病毒，病毒DNA分子量约为100×106道尔顿，DNA的G+C百分率45％，低于许多动物疱疹病毒。ILTV基因组为155kb的双链线性DNA分子，基因组由1个120kb的长独特区(UL)和1个17kb的短独特区(US)组成。目前，ILTV的编码基因是研究的热点。对其它疱疹病毒的相关研究表明，gD对病毒的吸附及穿入是必需的，也是病毒繁殖的必须基因。gB、gC、gD能诱导机体产生细胞和体液免疫应答，BHV-1gD能引起比gB、gC更强的细胞免疫应答，抗gD抗体有更高的中和效价(Hutchingsetal，1990)^[1]，HSV-1的gD产生的中和抗体水平最高，gB、gD均能抵抗HSV的攻击(Ghiasi et al，1994；Lasky et al，1984)^[2，3]，PRV的gD亚单位苗能抵抗PRV的致死性攻击(Marchioli etal 1987)^[4]。在EHV-1杆状病毒表达的gB、gC、gD单独或联合使用均能产生保护性细胞和体液免疫应答(Packiarajah et al，1990)^[5]。根据序列比较、糖蛋白产物鉴定以及基因组中的位置，已鉴定了ILTV的gC基因(Kingsely et al，1995)^[6]，该基因的长度为1245bp，编码414aa，其N末端具有疏水的信号序列，C端存在着跨膜和胞浆部分，有5个潜在的N-连接糖基化位点，这些是病毒糖蛋白的特征^[7]。gC是疱疹病毒一个重要的糖蛋白，它虽然对于病毒在体外的复制是非必需的，但却介导重要的生物学功能。通过对HSV-1、PRV、和BHV-1的研究表明，gC与细胞表面的糖蛋白相互作用，介导病毒吸附的启动，而且HSV和PRV的gC能够诱导细胞毒性T细胞介导的免疫应答^[8]。本试验克隆并测定了河南长葛株ILTV gC、gD全基因序列，与GenBank读取的ILTVgC、gD基因序列和氨基酸序列同源性很高，均在99.3％以上，说明ILTV gC、gD基因相对比较保守，ILTV的抗原变异很少，因此采用一种有效的疫苗就能保护所有ILTV强毒株的攻击，相信在不久的将来，局部根除ILT一定会成为现实。

参考文献：

[1]Hutchings D L，Van Drunen Little-Van den Hurk，Babiuk L A，Lymphocyte proliferativeresponses to separate bovine herpesvirus-1 protein in immune cattle[J].Journal ofVirology，1990，64：5114-5122.

[2]Ghiasi，H.Kaiwar，R.Nesbum，A.B.Expression of seven herpes simplex virus type 1glycoproteins(gB，gC，gD，gE，gG，gH and gI)：comparative protection against lethal challenge inmice[J].Journal of Virology，1994，68：2118-2126.

[3]Lasky L A，D Dawbenk，Simonsen C C et al，Protection of mice from lethal herpesvirusinfection by vaccination with a secreted form of cloned glycoprotein D[J].Biotechnology，1984，2：527-532.

[4]Marchioli C C，R J Yancey，Petroski E A et al，Evaluation of pseudorabies virus glycoproteingp50 as a vaccine for Aujeszky′s disease in mice and swine：expression by vaccines virus andChinese hamster ovary cells[J].Journal of Virology，1987，62：3977-3982.

[5]Packiarajah P，C Walker，Gickerson et al，Immune response and protective effcacyofrecombinant vaccine virus[J].Archives of Virology.1990，142：1003-1010.

[6]Kingsley D H，J W Hazel，Keeler C J et al，Identification and characterization of infectiouslaryngotrcheitis virus glycoprotein C gene[J].Virology，1995，203：316-343.

[7]Poa-Chun C，.Kwan-Ting Chen，.et al，Expressing of infectious laryngotracheitis virusglycoproteins in Escherichia coil and their application in Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay[J].Avian Diseases，2002，46：570-580.

[8]Myung G H，Sun J K.Analysis strains of infectious laryngotracheitis virus by nucleotidesequence and restriction fragment length polymorphism[J].VeterinaryMicrobiology，2001，83：321-331.

实施例2

ILTV河南长葛株gD基因在重组痘病毒中的表达及其免疫效力检测试验报告摘要：将克隆到pGEM-T easy中的传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白gD基因，通过EcoR I酶切位点亚克隆到pSY538载体LP2EP2启动子的下游，构建pSY538-gD载体；用Pst I和XbaI酶切pSC11载体中痘病毒启动子控制下的大肠杆菌LacZ基因，用DNA聚合酶补平后，连接在pSY538-gD载体Sma I酶切位点上，构建pSY538-gD-LacZ载体；用Not I酶切gD和LacZ大片段后连接在载体pSY681 Not I酶切位点处，构建pSY681-gD-LacZ载体。采用脂质体转染法将pSY538-gD-LacZ质粒转染到痘病毒(FPV)感染的CEF细胞中；用蓝斑筛选试验筛选纯化出重组病毒，用间接免疫荧光试验(IFA)检测含ILTV gD基因重组病毒在CEF细胞中的表达。将重组病毒稀释后，免疫试验鸡，21d测定血清中ILTV gD中和试验的半数保护量(PD₅₀)为1∶55；而血清中鸡痘抗体的PD₅₀为1∶49。试验鸡攻毒试验表明：重组病毒组对ILTV强毒攻击的保护率为97.5％，对FPV强毒攻击的保护率为96.3％。说明该重组病毒作为弱毒疫苗能够抵抗ILTV和FPV强毒的攻击，对免疫鸡群有较好的保护作用。

关键词：传染性喉气管炎病毒；gD基因；重组病毒；表达

中国分类号：

Expression of glycoprotein D(gD)of infectiouslaryngotracheitis virus in a recombinant fowl pox virus anddetection the immune effect

Abstract：A recombined fowl pox virus expressing glycoprotein D(gD)of ILTV was constructed.The commercialchickens were vaccinated using the recombined virus.The tested groups were challenged with virulent ILTV strains.The results showed that protective efficacy could be significantly enhanced after immunized with recombined virus.The anti-ILTV gD neutralization antibody level was significantly increased compared with the immunized by D-805strain group.

Key words：ILTV；glycoprotein gD；recombinant virus；expression

鸡传染性喉气管炎(ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious LaryngotracheitisVirus，ILTV)引起的鸡的一种急性呼吸道传染病，该病发病率高，传播迅速，发病率为80-90％，死亡率为10-60％，发病后可使蛋鸡的产蛋率下降15-60％。雏鸡的生长发育受阻，影响后期的生产性能，给养鸡业造成很大的经济损失。ILTV属于疱疹病毒科，A型疱疹病毒属，是一种20面体对称的双链DNA囊膜病毒，，病毒基因组大小约为155kb左右。gD基因是该病毒的糖蛋白基因，它对于病毒的吸附及穿入是必需的，也是病毒繁殖的必需基因。gB、gC、gD能诱导机体产生细胞和体液免疫应答，其它疱疹病毒如：BHV-1 gD能引起比gB、gC更强的细胞免疫应答，抗gD抗体有更高的中和效价(Hutchingsetal，1990)^[1]；还有HSV-1的gD产生的中和抗体水平最高；gB、gD均能抵抗HSV的攻击(Ghiasi et al，1994；Lanky et al，1984)^[2，3]，PRV的gD亚单位疫苗能够抵抗PRV的致死性攻击(Marchioli etal 1987)^[4]。在EHV-1杆状病毒表达的gB、gC、gD单独或联合使用均能产生保护性细胞和体液免疫应答(Packiarajah etal，1997)^[5]。鸡痘病毒(FPV)的基因组比较大，其大小约300kb左右，其中包含大量的病毒繁殖的非必需基因，因此能够容纳大量的外源基因片段，用于构建多价基因工程疫苗。用鸡痘病毒作为研制禽类病原基因工程的活病毒载体，具有巨大的开发潜力，也是目前分子生物学研究最多、应用最广泛的病毒载体。本研究将ILTV河南长葛株的糖蛋白gD基因亚克隆到痘病毒表达载体中，转染后获得一株FPV-gD重组病毒，从而为局部根除ILT变为现实打下基础。

1材料和方法

1.1毒株  ILTV河南长葛株由本试验室分离鉴定，保存备用。

1.2菌株及质粒  大肠杆菌JM109感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司。含gD基因的质粒pGEM-T easy由本实验室构建。质粒pSC11，pSY538，pSY681由华南农业大学黄青云教授惠赠。

1.3主要试剂  限制性内切酶EcoR I、Xba I、Pst I、Not I、Sma I等均购自宝生物工程(大连)有限公司。X-gal、IPTG、T4 DNA Ligase、琼脂糖等均购自Promega公司。

1.4引物设计与合成  参照含gD基因克隆质粒测序结果，设计一对上下游5’端含EcoR I酶切位点的引物，上游引物位于起始密码子之前，其序列为：

5’-CTGAATTCCAATATATACGAATGCA-3’，下游引物位于终止子之后，其序列为：

5’-ACGAATTCTAGGCTCGATTAGCTAC-3’。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.5gD基因的PCR扩增及产物的酶切鉴定  以含gD基因的克隆质粒为模板进行PCR扩增。

PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min；51℃退火50s；72℃延伸90s；共进行30个循环；最后72℃再延伸10min。取适量PCR产物，用EcoR I在37℃水浴条件下消化2h，消化产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳。

1.6重组质粒pSY538-gD的构建  回收的gD酶切产物和酶切回收pSY538载体用T4 DNA连接酶连接，转化至JM109感受态细胞中，筛选并酶切鉴定阳性重组质粒pSY538-gD。这样gD基因通过EcoR I位点克隆到pSY538质粒中含FPV早晚期启动子LP2-EP2的下游处，该质粒被命名为pSY538-gD。重组的阳性质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.7重组质粒pSY538-gD-LacZ的构建  将pSC11质粒用Pst I和Xba I酶切回收后用T4DNA聚合酶补平，再与pSY538-gD质粒用Sma I酶切回收产物连接，转化至JM109感受态细胞中，筛选并酶切鉴定阳性重组质粒，该阳性重组质粒命名为pSY538-gD-LacZ。这样就将痘病毒启动子P11控制的大肠杆菌LacZ基因通过平端连接克隆到pSY538-gD质粒的SmaI位点，从而作为重组病毒的筛选基因。

1.8重组质粒psY681-gD-LacZ的构建  将pSY538-gD-LacZ质粒用Not I酶切回收后与pSY681质粒Not I酶切回收产物连接，转化至JM109感受态细胞中，筛选并酶切鉴定阳性重组质粒pSY681-gD-LacZ。这样就将目的基因和报告基因连接到含FPV同源臂的转移载体上，并命名为pSY681-gD-LacZ。

1.9重组鸡痘病毒的构建和筛选  将FPV疫苗株接种到长有单层CEF细胞上，在37℃作用2h，倒掉病毒液后用PBS冲洗两次；采用脂质体转染法将重组转移质粒pSY681-gD-LacZ转染至上述细胞中，37℃作用1h后倒掉转染液，加入含5％胎牛血清的DMEM营养液，37℃培养至出现细胞病变，收获细胞培养物，反复冻融3次后保存备用，作为转染种毒。将上述种毒按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160稀释后接种到CEF单层细胞，待出现典型细胞病变时，加入含X-gal营养琼脂进行染色，37℃培养至出现蓝色蚀斑，挑取蓝色蚀斑，放入1mLDMEM营养液中，冻融3次后，进行下一轮蚀斑筛选纯化，直至全部出现蓝色蚀斑为止。

1.10阳性重组病毒的PCR鉴定  提取上述筛选纯化病毒的DNA，设计一对引物，该引物能够扩增出gD全基因，进行PCR扩增，扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳，鉴定该重组病毒。

1.11IFA检测重组病毒gD糖蛋白的表达^[6]将重组病毒接种于长有单层CEF上，37℃培养至出现明显细胞病变，移去培养液，PBS冲洗后用冷甲醇固定，加入1∶200稀释的ILTV阳性血清，37℃作用1h，用含0.5％吐温-20的PBS洗涤5次，再加入1∶400稀释的兔抗鸡IgG-FITC荧光抗体，37℃下作用30min，最后用含0.5％吐温-20的PBS洗涤5次，置于倒置荧光显微镜下观察，同时设正常CEF和FPV感染的CEF作阴性对照。

1.12重组病毒免疫效力检测^[7，8]  将重组病毒在CEF上增殖培养后，用PBS做适当稀释，翅内侧皮肤无血管处以刺种方式接种于35日龄的三黄鸡，接种剂量为150μL/羽，免疫21天后，测定血清中gD抗体和鸡痘抗体的中和效价，并同时用ILT和鸡痘强毒攻击，观测试验鸡有无临床反应。

2.结果

2.1重组质粒pSY538-gD酶切鉴定  重组阳性质粒EcoR I酶切鉴定，酶切出1398bp的目的条带，结果见图1，重组阳性质粒方向鉴定用Xba I酶切，若正向连接，酶切出一条900bp左右的条带，结果见图2。

2.2重组质粒pSY538-gD-LacZ酶切鉴定  重组质粒pSY538-gD-LacZ用Hind III酶切鉴定，酶切出4700bp和3100bp的条带，结果见图3。

2.3重组质粒pSY681-gD-LacZ酶切鉴定  质粒pSY681-gD-LacZ用Not I酶切鉴定，酶切出5878bp和4700bp的条带，结果见图4。

2.4重组鸡痘病毒筛选  重组鸡痘病毒筛选采用蓝色蚀斑筛选，结果见图5。

2.5IFA检测重组病毒gD糖蛋白的表达  采用间接免疫荧光试验检测重组病毒ILTV gD糖蛋白的表达，结果见图6，细胞发出绿色荧光即为检测到的表达产物。

2.6重组病毒免疫效力检测  重组病毒接种试验鸡后个别鸡仅见轻微的呼吸症状，表现为张嘴呼吸，其他试验鸡均无其他反应症状，精神食欲不受影响，发育正常。血清中和抗体检测表明，重组病毒免疫试验鸡后血清中ILTV gD中和试验的半数保护量(PD50)为1∶55；而血清中鸡痘抗体的PD50为1∶49。试验鸡攻毒试验表明：重组病毒组对ILTV强毒攻击的保护率为97.5％，对FPV强毒攻击的保护率为96.3％。说明该重组病毒作为弱毒疫苗能够抵抗ILTV和FPV强毒的攻击，对免疫鸡群有较好的保护作用。

3.讨论

本试验成功地构建了能够高水平表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gD基因的重组鸡痘病毒。从间接免疫荧光试验可以看出，重组病毒表达的糖蛋白能够被它所感染的细胞传输到细胞表面，发出绿色荧光。

目前，国内外预防本病所用的疫苗都是弱毒疫苗，但所有的鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗都存在一些缺点，比如弱毒疫苗能够引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终生带毒成为新的传染源；其次弱毒疫苗病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡与鸡之间传播的过程中，可能会造成毒力返强现象^[9，10]；还有鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗在制作过程中，病毒的增殖主要采用鸡胚***接种，该接种方法费时费力，且培养时间长，接种后需要继续培养6天左右收毒，并且收获的病毒量少，只有增厚的那一点***。而重组病毒可以在鸡胚成纤维细胞上大量增殖；另外，鸡痘病毒疫苗性能稳定，能够克服上述弱毒疫苗存在的不足，又具有现用弱毒疫苗同等免疫效力，故有望成为一种新型安全有效的疫苗，用于根除ILT，从而减少养鸡业因ILT造成的经济损失。

参考文献：

[1]Hutchings D L，Van Drunen Little-Van den Hurk，Babiuk L A，Lymphocyteproliferative responses to separate bovine herpesvirus-1 protein in immunecattle[J].Journal of Virology，1990，64：5114-5122

[2]Ghiasi，H.Kaiwar，R.Nesbum，A.B.Expression of seven herpes simplex virus type1 glycoproteins(gB，gC，gD，gE，gG，gH and gI)：comparative protection againstlethal challenge in mice[J].Journal of Virology，1994，68：2118-2126

[3]Lasky L A，D Dawbenk，Simonsen C C et al，Protection of mice from lethalherpesvirus infection by vaccination with a secreted form of cloned glycoproteinD[J].Biotechnology，1984，2：527-532

[4]Marchioli C C，R J Yancey，Petroski E A et al，Evaluat ion of pseudorabi es virusglycoprotein gp50 as a vaccine for Aujeszky’s disease in mice and swine：expression by vaccines virus and Chinese hamster ovary cells[J].Journal ofVirology，1987，62：3977-3982

[5]Packiarajah P，C Walker，Gickerson et al，Immune response and protective effcacyofrecombinant vaccine virus[J].Archives of Virology.1990，142：1003-1010.

[6]刘彦仿.免疫细胞化学技术[M].北京：人民卫生出版社出版，1990：127-130

[7]殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：336-342

[8]乔贵林，夏碱柱，王度林，等.犬瘟热弱毒疫苗免疫犬抗体消长规律及影响因素[J].中国兽医学报，1997，17(5)：440-443

[9]郑海洲，杨虹，柏桂宁，等.鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达[J].微生物学报，2004，44(6)830-833

[10]张绍杰，倪健强，孟松树，等.传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达[J].中国预防兽医学报，2001，23(5)：321-324

实施例3

动物试验报告

ILTV河南长葛株gD基因重组鸡痘病毒疫苗免疫效力研究

摘要：试验用ILTV河南长葛株gD基因重组鸡痘病毒疫苗翅内侧无血管处皮下接种，免疫35日龄鸡，血清中和抗体检测表明，重组病毒免疫试验鸡后血清中ILTV gD中和试验的半数保护量(PD50)为1∶55；而血清中鸡痘抗体的PD50为1∶49。试验鸡攻毒试验表明：用ILTV河南长葛株强毒攻击，免疫组保护率为96％(24/25)，对照组发病率为92％(23/25)，死亡率为40％(10/25)。试验结果表明ILTV河南长葛株gD基因重组鸡痘病毒疫苗是一株副作用小而免疫效力好的疫苗用毒株。

关键词：传染性喉气管炎；重组鸡痘病毒；免疫效力

鸡传染性喉气管炎(ILT)是由鸡ILTV引起的一种以呼吸困难为主症的鸡重要传染病之一。该病自1925年Mav等首先在美国报道以来，相继在世界各地均有发生。30-40年代，对木病的预防主要是用强毒经泄殖腔涂擦获得保护力，但由于野毒毒力较强，使该病延续不断，故只能在疫区使用。为了克服弱毒疫苗的能够引起潜伏感染，潜伏感染的鸡将终生带毒成为新的传染源，病毒可以由接种鸡传染给非接种鸡，在鸡与鸡之间传播的过程中，可能会造成毒力返强现象。该试验用本实验室构建的ILTV河南长葛株gD基因重组鸡痘病毒疫苗免疫试验鸡，观察其毒副作用及其免疫效力，现将试验结果报告如下：

1.材料和方法

1.1种毒ILTV河南长葛株gD基因重组鸡痘病毒疫苗由本实验室构建，使用前在鸡胚成纤维细胞上连传3代，反复冻融3次，-20℃保存备用。

1.2试验鸡购自郑州瑞翔孵化场非免疫鸡，饲养至35日龄开始免疫。

1.3试验用鸡胚购自郑州瑞翔孵化场10日龄鸡胚。

1.4强毒株复壮经过绒毛***接种10日龄鸡胚复壮和传代，收集具有明显痘斑的鸡胚绒毛***，研磨后分装，低温保存，用做攻毒试验种毒。

1.5重组疫苗安全性试验重组弱毒疫苗用生理盐水稀释后，对35日龄的试验鸡进行翅内侧皮下注射，每只鸡接种0.2ml。接种后观察鸡群的精神状态以及局部的反应情况。

1.6重组疫苗免疫效力测定  重组疫苗免疫试验鸡后，于接种后35天采血分离血清，采用血清微量中和试验测定其中和效价；同时用强毒攻击，观察鸡群的发病和死亡情况。

2.结果

2.1重组疫苗的安全性试验  重组弱毒疫苗接种试验鸡后3天，所有试验鸡的注射局部均出现轻微肿胀，5天肿胀的厚度达到最大，此后肿胀开始消退；未见注射局部的结痴现象。所有试验鸡均无其他全身反应，精神食欲不受影响，发育正常。结果表明，即使超剂量使用重组疫苗，也不会引起试验鸡严重的临床反应，重组疫苗是安全的。

2.2重组疫苗最小免疫剂量测定由表1可以看出，用10^-1、10^-2、10^-3稀释后，翅内侧皮下注射0.2ml免疫鸡，攻毒后保护率在96％以上；10^-4稀释后保护率为76％，故重组疫苗的最小免疫剂量为10^-30.2ml。

表1重组疫苗最小免疫剂量测定

2.3重组疫苗血清中和抗体测定  由表2可以看出，用10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释后，翅内侧皮下注射0.2ml免疫鸡，血清中ILTV gD中和试验的半数保护量(PD50)平均为1∶55；而血清中鸡痘抗体的PD50为平均为1∶49。

表2重组疫苗血清中和抗体测定

3.讨论

重组病毒不仅能在鸡胚成纤维细胞中稳定地传代，也能在鸡体内稳定地遗传是一个良好的重组疫苗候选毒株。木试验通过强毒的攻毒试验再次证明了重组病毒的遗传稳定性及其外源基因表达的忠实性。接种鸡后能产生可靠的保护，可抵抗鸡痘强毒和传染性喉气管炎强毒的攻击，显著降低免疫鸡群的发病率，缓解发病鸡的疾病严重程度。通过对4个稀释度的弱毒疫苗的安全性试验证明：重组病毒对35日龄的试验鸡是安全的，接种后的局部反应较小，并且很快消失，说明重组疫苗是安全的。

试验结果表明，重组病毒对试验鸡翅内侧皮下接种能产生良好的免疫力，在接种剂量为10^-30.2ml/鸡的范围内可以使试验鸡产生保护力，当接种剂量10^-40.2ml/鸡时可以使部分试验鸡具有免疫力。抵抗对传染性喉气管炎病毒强毒株的攻击，降低鸡群的发病率和病死率。这些结果说明，疫苗接种后可以从一个侧反应重组疫苗的免疫效力，这就为我们进一步考察疫苗的稳定性和免疫效力试验奠定了基础。

应用ILTV gD糖蛋白基因二价重组痘病毒疫苗免疫35日龄的SPF鸡，免疫后的7、14、21、28、35、60d分别采血，分离血清，采用微量中和试验测得血清中和抗体效价。结果表明免疫后14d产生1∶16以上的血清中和抗体，随后抗体水平迅速升高，免疫后35d时抗体效价超过1∶100，免疫后60d血清中和抗体效价仍维持在1∶100以上。免疫后60d分别用ILTV长葛株和FPV强毒攻击，结果表明：用重组病毒免疫组对ILTV强毒攻击的保护率为97.5％，对FPV强毒攻击的保护率为96.3％。说明该重组病毒作为弱毒疫苗能够抵抗ILTV和FPV强毒的攻击，对免疫鸡群有较好的保护作用

参考文献：

[1]Hutchings D L，Van Drunen Little-Van den Hurk，Babiuk L A，Lymphocyte proliferative responsesto separate bovine herpesvirus-1 protein in immune cattle[J].Journal ofVirology，1990，64：5114-5122

[2]Ghiasi，H.Kaiwar，R.Nesbum，A.B.Expression of seven herpes simplex virus type 1glycoproteins(gB，gC，gD，gE，gG，gH and gI)：comparative protection against lethal challengein mice[J].Journal of Virology，1994，68：2118-2126

[3]Lasky L A，D Dawbenk，Simonsen C C et al，Protection of mice from lethal herpesvirus infectionby vaccination with a secreted form of cloned glycoprotein D[J].Biotechnology，1984，2：527-532

[4]Marchioli C C，R J Yancey，Petroski E A et al，Evaluation of pseudorabies virus glycoproteingp50 as a vaccine for Aujeszky’s disease in mice and swine：expression by vaccines virusand Chinese hamster ovary cells[J].Journal of Virology，1987，62：3977-3982

[5]Packiarajah P，C Walker，Gickerson et al，Immune response and protective effcacyofrecombinant vaccine virus[J].Archives of Virology.1990，142：1003-1010.

[6]刘彦仿.免疫细胞化学技术[M].北京：人民卫生出版社出版，1990：127-130

[7]殷震，刘景华.动物病毒学[M].北京：科学出版社，1997：336-342

[8]乔贵林，夏碱柱，王度林，等.犬瘟热弱毒疫苗免疫犬抗体消长规律及影响因素[J].中国兽医学报，1997，17(5)：440-443

[9]郑海洲，杨虹，柏桂宁，等.鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的克隆及其在耻垢分枝杆菌中的表达[J].微生物学报，2004，44(6)830-833

[10]张绍杰，倪健强，孟松树，等.传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达[J].中国预防兽医学报，2001，23(5)：321-324

按中华人民共和国知识产权行业标准的核苷酸和/或氨基酸序列表和序列表电子文件标准提供ILTV gD糖蛋白核苷酸和/或氨基酸序列表

gD测序结果：

ccaaagtaca gtgtggaaga gcagcgcgag agcaggcgag gcgtggattt ctggccgggg 60aggcaatatatacgaatgca ccgtcctcat ctcagacggc actcgcgtta ctacgcgaaa 120ggagaggtgc ttaacaaacacatggattgc ggtggaaaac ggtgctgctc aggcgcagct 180gtattcactc ttttctggac ttgtgtcaggattatgcggg agcatatctg ctttgtacgc 240aacgctatgg accgccattt atttttgagg aatgctttttggactatcgt actgctttct 300tccttcgcta gccagagcac cgccgccgtc acgtacgact acattttaggccgtcgcgcg 360ctcgacgcgc taaccatacc ggcggttggc ccgtataaca gatacctcac tagggtatca 420agaggctgcg acgttgtcga gctcaacccg atttctaacg tggacgacat gatatcggcg 480gccaaagaaaaagagaaggg gggccctttc gaggcctccg tcgtctggtt ctacgtgatt 540aagggcgacg acggcgaggacaagtactgt ccaatctata gaaaagagta cagggaatgt 600ggcgacgtac gactgctatc tgaatgcgccgttcaatctg cacagatgtg ggcagtggac 660tatgttccta gcacccttgt atcgcgaaat ggcgcgggactgactatatt ctcccccact 720gctgcgctct ctggccaata cttgctgacc ctgaaaatcg ggagatttgcgcaaacagct 780ctcgtaactc tagaagttaa cgatcgctgt ttaaagatcg ggtcgcagct taacttttta 840ccgtcgaaat gctggacaac agaacagtat cagactggat ttcaaggcga acacctttat 900ccgatcgcagacaccaatac acgacacgcg gacgacgtat atcggggata cgaagatatt 960ctgcagcgct ggaataatttgctgaggaaa aagaatccta gcgcgccaga ccctcgtcca 1020gatagcgtcc cgcaagaaat tcccgctgtaaccaagaaag cggaagggcg caccccggac 1080gcagaaagca gcgaaaagaa ggcccctcca gaagactcggaggacgacat gcaggcagag 1140gcttctggag aaaatcctgc cgccctcccc gaagacgacg aagtccccgaggacaccgag 1200cacgatgatc caaactcgga tcctgactat tacaatgaca tgcccgccgt gatcccggtg1260gaggagacta ctaaaagttc taatgccgtc tccatgccca tattcgcggc gttcgtagcc 1320tgcgcggtcg cgctcgtggg gctactggtt tggagcatcg taaaatgcgc gcgtagctaa 1380tcgagcctagaataggtg

推导出河南长葛gD氨基酸序列：

Met His Arg Pro His Leu Arg Arg His Ser Arg Try Try Ala Lys Gly Glu Val Leu Asn Lys His Met AspCys Gly Gly Lys Arg Cys Cys Ser Gly Ala Ala Val Phe Thr Leu Phe Trp Thr Cys Val Arg Ile Met ArgGlu His Ile Cys Phe Val Arg Asn Ala Met Asp Arg His Leu Phe Leu Arg Asn Ala Phe Trp Thr Ile ValLeu Leu Ser Ser Phe Ala Ser Glu Ser Thr Ala Ala Val Thr Try Asp Try Ile Leu Gly Arg Arg Ala LeuAsp Ala Leu Thr Ile Pro Ala Val Gly Pro Try Asn Arg Try Leu Thr Arg Val Ser Arg Gly Cys Asp ValVal Glu Leu Asn Pro Ile Ser Asn Val Asp Asp Met Ile Ser Ala Ala Lys Glu Lys Glu Lys Gly Gly ProPhe Glu ALA Ser Val Val Trp Phe Try Val Ile Lys Gly Asp Asp Gly Glu Asp Lys Try Cys Pro Ile TryArg Lys Glu Try Arg Glu Cys Gly Asp Val Arg Leu Leu Ser Glu Cys Ala Val Gln Ser Ala Gln Met TrpAla Val Asp Try Val Pro Ser Thr Leu Val Ser Arg Asn Gly Ala Gly Leu Thr Ile Phe Ser Pro Thr AlaAla Leu Ser Gly Gln Try Leu Leu Thr Leu Lys Ile Gly Arg Phe Ala Gln Thr Ala Leu Val Thr Leu GluVal Asn Asp Arg Cys Leu Lys Ile Gly Ser Gln Leu Asn Phe Leu Pro Ser Lys Cys Trp Thr Thr gLU GlnTry Gln Thr Gly Phe Gln Gly Glu His Leu Try Pro Ile Ala Asp Thr Asn Thr Arg His Ala Asp Asp ValTry Arg Gly Try Glu Asp Ile Leu Gln Arg Trp Asn Asn Leu Leu Arg Lys Lys Asn Pro Ser Ala Pro AspPro Arg Pro Asp Ser Val Pro Gln Glu Ile Pro Ala Ver Thr Lys Lys Ala Glu Gly Arg Thr Pro Asp AlaGlu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Pro Pro Glu Asp Ser Glu Asp Asp Met Gln Ala Glu Ala Ser Gly Glu AsnPro Ala Ala Leu Pro Glu Asp Asp Glu Val Pro Glu Asp Thr Glu His Asp Asp Pro Asn Ser Asp Pro AspTry Try Asn Asp Met Pro Ala Val Ile Pro Val Glu Glu Thr Thr Lys Ser Ser Asn Ala Ver Ser Met ProIle Phe Ala Ala Phe Val Ala Cys Ala Ver Ala Leu Val Gly Leu Leu Val Trp Ser Ile Val Lys Cys AlaArg Ser

Claims (10)

1.一种ILTV gD糖蛋白，其特征在于：具有核苷酸序列如下：ccaaagtaca gtgtggaagagcagcgcgag agcaggcgag gcgtggattt ctggccgggg 60 aggcaatata tacgaatgca ccgtcctcatctcagacggc actcgcgtta ctacgcgaaa 120 ggagaggtgc ttaacaaaca catggattgc ggtggaaaacggtgctgctc aggcgcagct 180 gtattcactc ttttctggac ttgtgtcagg attatgcggg agcatatctgctttgtacgc 240 aacgctatgg accgccattt atttttgagg aatgcttttt ggactatcgt actgctttct 300tccttcgcta gccagagcac cgccgccgtc acgtacgact acattttagg ccgtcgcgcg 360 ctcgacgcgctaaccatacc ggcggttggc ccgtataaca gatacctcac tagggtatca 420 agaggctgcg acgttgtcgagctcaacccg atttctaacg tggacgacat gatatcggcg 480 gccaaagaaa aagagaaggg gggccctttcgaggcctccg tcgtctggtt ctacgtgatt 540 aagggcgacg acggcgagga caagtactgt ccaatctatagaaaagagta cagggaatgt 600 ggcgacgtac gactgctatc tgaatgcgcc gttcaatctg cacagatgtgggcagtggac 660 tatgttccta gcacccttgt atcgcgaaat ggcgcgggac tgactatatt ctcccccact 720gctgcgctct ctggccaata cttgctgacc ctgaaaatcg ggagatttgc gcaaacagct 780 ctcgtaactctagaagttaa cgatcgctgt ttaaagatcg ggtcgcagct taacttttta 840 ccgtcgaaat gctggacaacagaacagtat cagactggat ttcaaggcga acacctttat 900 ccgatcgcag acaccaatac acgacacgcggacgacgtat atcggggata cgaagatatt 960 ctgcagcgct ggaataattt gctgaggaaa aagaatcctagcgcgccaga ccctcgtcca 1020 gatagcgtcc cgcaagaaat tcccgctgta accaagaaag cggaagggcgcaccccggac 1080 gcagaaagca gcgaaaagaa ggcccctcca gaagactcgg aggacgacat gcaggcagag1140 gcttctggag aaaatcctgc cgccctcccc gaagacgacg aagtccccga ggacaccgag 1200cacgatgatc caaactcgga tcctgactat tacaatgaca tgcccgccgt gatcccggtg 1260 gaggagactactaaaagttc taatgccgtc tccatgccca tattcgcggc gttcgtagcc 1320 tgcgcggtcg cgctcgtggggctactggtt tggagcatcg taaaatgcgc gcgtagctaa 1380 tcgagcctag aataggtg。

2.如权利要求1所述的ILTV gD糖蛋白，其特征在于：具有如下氨基酸序列：Met His Arg Pro His Leu Arg Arg His Ser Arg Try Try Ala Lys Gly Glu Val Leu Asn Lys His Met AspCys Gly Gly Lys Arg Cys Cys Ser Gly Ala Ala Val Phe Thr Leu Phe Trp Thr Cys Val Arg Ile Met ArgGlu His Ile Cys Phe Val Arg Asn Ala Met Asp Arg His Leu Phe Leu Arg Asn Ala Phe Trp Thr Ile ValLeu Leu Ser Ser Phe Ala Ser Glu Ser Thr Ala Ala Val Thr Try Asp Try Ile Leu Gly Arg Arg Ala LeuAsp Ala Leu Thr Ile Pro Ala Val Gly Pro Try Asn Arg Try Leu Thr Arg Val Ser Arg Gly Cys Asp ValVal Glu Leu Asn Pro Ile Ser Asn Val Asp Asp Met Ile Ser Ala Ala Lys Glu Lys Glu Lys Gly Gly ProPhe Glu ALA Ser Val Val Trp Phe Try Val Ile Lys Gly Asp Asp Gly Glu Asp Lys Try Cys Pro Ile TryArg Lys Glu Try Arg Glu Cys Gly Asp Val Arg Leu Leu Ser Glu Cys Ala Val Gln Ser Ala Gln Met TrpAla Val Asp Try Val Pro Ser Thr Leu Val Ser Arg Asn Gly Ala Gly Leu Thr Ile Phe Ser Pro Thr AlaAla Leu Ser Gly Gln Try Leu Leu Thr Leu Lys Ile Gly Arg Phe Ala Gln Thr Ala Leu Val Thr Leu GluVal Asn Asp Arg Cys Leu Lys Ile Gly Ser Gln Leu Asn Phe Leu Pro Ser Lys Cys Trp Thr Thr gLU GlnTry Gln Thr Gly Phe Gln Gly Glu His Leu Try Pro Ile Ala Asp Thr Asn Thr Arg His Ala Asp Asp ValTry Arg Gly Try Glu Asp Ile Leu Gln Arg Trp Asn Asn Leu Leu Arg Lys Lys Asn Pro Ser Ala Pro AspPro Arg Pro Asp Ser Val Pro Gln Glu Ile Pro Ala Ver Thr Lys Lys Ala Glu Gly Arg Thr Pro Asp AlaGlu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Pro Pro Glu Asp Ser Glu Asp Asp Met Gln Ala Glu Ala Ser Gly Glu AsnPro Ala Ala Leu Pro Glu Asp Asp Glu Val Pro Glu Asp Thr Glu His Asp Asp Pro Asn Ser Asp Pro AspTry Try Asn Asp Met Pro Ala Val Ile Pro Val Glu Glu Thr Thr Lys Ser Ser Asn Ala Ver Ser Met ProIle Phe Ala Ala Phe Val Ala Cys Ala Ver Ala Leu Val Gly Leu Leu Val Trp Ser Ile Val Lys Cys AlaArg Ser。

3.如权利要求2所述的ILTV gD糖蛋白，其特征在于，通过以下步骤制得：

A、收集病料：采自病鸡的喉头和气管组织；

B、病毒的分离：采集的病料剪碎后按1∶10的比例加入PBS溶液，同时加入青、链霉素(2000U/ml)，反复冻融三次后，离心取上清，-20℃保存；所取上清就是分离的病毒。

C、鸡胚接种和传代：病毒增殖采用鸡胚***接种法，将分离病毒0.2ml经***接种于10日龄的SPF鸡胚中，每日照蛋观察，弃去48h内死亡的鸡胚，收集120h活胚的***，剪碎研磨，加入适量PBS稀释，按2000U(μg)/ml加入青、链霉素，置4℃冰箱作用3h，反复冻融三次，离心取上清，置-20℃保存。

D、琼扩试验：用标准的阳性血清作为琼扩抗体，分离毒株作为琼扩抗原，在1.5％的琼脂板上，进行打孔、加样，置37℃湿盒中24h；

E、病毒DNA的提取：取病毒液300μl，加入300μl裂解液(0.01mol/L Tris-HCl，PH7.9，0.01mol/L EDTA，0.25％Triton-100，5mol/L异硫氰酸胍(GSCN))，37℃水浴15min；加等体积饱合酚抽提，14000r/min离心5min，取上清；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，离心取上清；加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，取上清；加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30min；然后4℃14000rpm离心10min，用70％预冷的乙醇洗涤两次，以14000g离心5min，弃去乙醇，晾干后加入适量的TE悬浮，-20℃保存。

F、PCR扩增及产物的凝胶电泳：分别以病毒的DNA为模板，进行gD的PCR扩增。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳。

G、PCR产物的回收纯化：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下切下目的条带，用DNA快速纯化回收试剂盒回收纯化凝胶中的目的片段。

H、回收纯化的PCR产物与克隆载体的连接    回收纯化的PCR产物与pGEM-T载体在16℃进行连接过夜。

I、连接产物的转化：取10μl的连接产物加入60μl JM109中，冰浴30min；42℃90s热激；冰浴2min后；加入950μl无Amp的LB，37℃摇振1h；8000rpm离心5min弃上清，沉淀加入LB培养基悬浮后，加入到事先涂有x-gal和IPTG平板上，涂匀后，37℃培养12-16h。

J、提取转化产物质粒：挑取单个白色菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养12-16h，提取质粒。

K、克隆阳性质粒鉴定：提取的质粒采用PCR扩增目的片断和用Not I酶切的方法进行筛选和鉴定阳性克隆质粒。

L、经质粒PCR和酶切鉴定为阳性质粒的菌液经(上海生物工程有限公司测序)测得gD基因的氨基酸序列为：Met His Arg Pro His Leu Arg Arg His Ser Arg Try Try Ala Lys Gly Glu Val LeuAsn Lys His Met Asp Cys Gly Gly Lys Arg Cys Cys Ser Gly Ala Ala Val Phe Thr Leu Phe Trp Thr CysVal Arg Ile Met Arg Glu His Ile Cys Phe Val Arg Asn Ala Met Asp Arg His Leu Phe Leu Arg Asn AlaPhe Trp Thr Ile Val Leu Leu Ser Ser Phe Ala Ser Glu Ser Thr Ala Ala Val Thr Try Asp Try Ile LeuGly Arg Arg Ala Leu Asp Ala Leu Thr Ile Pro Ala Val Gly Pro Try Asn Arg Try Leu Thr Arg Val SerArg Gly Cys Asp Val Val Glu Leu Asn Pro Ile Ser Asn Val Asp Asp Met Ile Ser Ala Ala Lys Glu LysGlu Lys Gly Gly Pro Phe Glu ALA Ser Val Val Trp Phe Try Val Ile Lys Gly Asp Asp Gly Glu Asp LysTry Cys Pro Ile Try Arg Lys Glu Try Arg Glu Cys Gly Asp Val Arg Leu Leu Ser Glu Cys Ala Val GlnSer Ala Gln Met Trp Ala Val Asp Try Val Pro Ser Thr Leu Val Ser Arg Asn Gly Ala Gly Leu Thr IlePhe Ser Pro Thr Ala Ala Leu Ser Gly Gln Try Leu Leu Thr Leu Lys Ile Gly Arg Phe Ala Gln Thr AlaLeu Val Thr Leu Glu Val Asn Asp Arg Cys Leu Lys Ile Gly Ser Gln Leu Asn Phe Leu Pro Ser Lys CysTrp Thr Thr gLU Gln Try Gln Thr Gly Phe Gln Gly Glu His Leu Try Pro Ile Ala Asp Thr Asn Thr ArgHis Ala Asp Asp Val Try Arg Gly Try Glu Asp Ile Leu Gln Arg Trp Asn Asn Leu Leu Arg Lys Lys AsnPro Ser Ala Pro Asp Pro Arg Pro Asp Ser Val Pro Gln Glu Ile Pro Ala Ver Thr Lys Lys Ala Glu GlyArg Thr Pro Asp Ala Glu Ser Ser Glu Lys Lys Ala Pro Pro Glu Asp Ser Glu Asp Asp Met Gln Ala GluAla Ser Gly Glu Asn Pro Ala Ala Leu Pro Glu Asp Asp Glu Val Pro Glu Asp Thr Glu His Asp Asp ProAsn Ser Asp Pro Asp Try Try Asn Asp Met Pro Ala Val Ile Pro Val Glu Glu Thr Thr Lys Ser Ser AsnAla Ver Ser Met Pro Ile Phe Ala Ala Phe Val Ala Cys Ala Ver Ala Leu Val Gly Leu Leu Val Trp SerIle Val Lys Cys Ala Arg Ser。

M、DNASTAR软件软件推导ILTV gD的核苷酸序列：

ccaaagtaca gtgtggaaga gcagcgcgag agcaggcgag gcgtggattt ctggccgggg 60 aggcaatatatacgaatgca ccgtcctcat ctcagacggc actcgcgtta ctacgcgaaa 120 ggagaggtgc ttaacaaacacatggattgc ggtggaaaac ggtgctgctc aggcgcagct 180 gtattcactc ttttctggac ttgtgtcaggattatgcggg agcatatctg ctttgtacgc 240 aacgctatgg accgccattt atttttgagg aatgctttttggactatcgt actgctttct 300 tccttcgcta gccagagcac cgccgccgtc acgtacgact acattttaggccgtcgcgcg 360 ctcgacgcgc taaccatacc ggcggttggc ccgtataaca gatacctcac tagggtatca 420agaggctgcg acgttgtcga gctcaacccg atttctaacg tggacgacat gatatcggcg 480 gccaaagaaaaagagaaggg gggccctttc gaggcctccg tcgtctggtt ctacgtgatt 540 aagggcgacg acggcgaggacaagtactgt ccaatctata gaaaagagta cagggaatgt 600 ggcgacgtac gactgctatc tgaatgcgccgttcaatctg cacagatgtg ggcagtggac 660 tatgttccta gcacccttgt atcgcgaaat ggcgcgggactgactatatt ctcccccact 720 gctgcgctct ctggccaata cttgctgacc ctgaaaatcg ggagatttgcgcaaacagct 780 ctcgtaactc tagaagttaa cgatcgctgt ttaaagatcg ggtcgcagct taacttttta 840ccgtcgaaat gctggacaac agaacagtat cagactggat ttcaaggcga acacctttat 900 ccgatcgcagacaccaatac acgacacgcg gacgacgtat atcggggata cgaagatatt 960 ctgcagcgct ggaataatttgctgaggaaa aagaatccta gcgcgccaga ccctcgtcca 1020 gatagcgtcc cgcaagaaat tcccgctgtaaccaagaaag cggaagggcg caccccggac 1080 gcagaaagca gcgaaaagaa ggcccctcca gaagactcggaggacgacat gcaggcagag 1140 gcttctggag aaaatcctgc cgccctcccc gaagacgacg aagtccccgaggacaccgag 1200 cacgatgatc caaactcgga tcctgactat tacaatgaca tgcccgccgt gatcccggtg1260 gaggagacta ctaaaagttc taatgccgtc tccatgccca tattcgcggc gttcgtagcc 1320tgcgcggtcg cgctcgtggg gctactggtt tggagcatcg taaaatgcgc gcgtagctaa 1380 tcgagcctagaataggtg

4.如权利要求3所述的ILTV gD糖蛋白基因制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、收集病料：采自病鸡的喉头和气管组织

B、病毒的分离：采集的病料剪碎后按1∶10的比例加入PBS溶液，同时加入青、链霉素(2000U/ml)，反复冻融三次后，离心取上清，-20℃保存；所取上清就是分离的病毒。

C、鸡胚接种和传代：病毒增殖采用鸡胚***接种法，将分离病毒0.2ml经***接种于10日龄的SPF鸡胚中，每日照蛋观察，弃去48h内死亡的鸡胚，收集120h活胚的***，剪碎研磨，加入适量PBS稀释，按2000U(μg)/ml加入青、链霉素，置4℃冰箱作用3h，反复冻融三次，离心取上清，置-20℃保存。

D、琼扩试验：用标准的阳性血清作为琼扩抗体，分离毒株作为琼扩抗原，在1.5％的琼脂板上，进行打孔、加样，置37℃湿盒中24h；

E、病毒DNA的提取：取病毒液300μl，加入300μl裂解液(0.01mol/L Tris-HCl，PH7.9，0.01mol/L EDTA，0.25％Triton-100，5mol/L异硫氰酸胍(GSCN))，37℃水浴15min；加等体积饱合酚抽提，14000r/min离心5min，取上清；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，离心取上清；加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，取上清；加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀30min；然后4℃14000rpm离心10min，用70％预冷的乙醇洗涤两次，以14000g离心5min，弃去乙醇，晾干后加入适量的TE悬浮，-20℃保存；

F、PCR扩增及产物的凝胶电泳：分别以病毒的DNA为模板，用引物进行gD的PCR扩增；PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳。

G、PCR产物的回收纯化：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下切下目的条带，用DNA快速纯化回收试剂盒回收纯化凝胶中的目的片段。

H、回收纯化的PCR产物与克隆载体的连接    回收纯化的PCR产物与pGEM-T载体在16℃进行连接过夜。

I、连接产物的转化：取10μl的连接产物加入60μl JM109中，冰浴30min；42℃90s热激；冰浴2min后；加入950μl无Amp的LB，37℃摇振1h；8000rpm离心5min弃上清，沉淀加入LB培养基悬浮后，加入到事先涂有x-gal和IPTG平板上，涂匀后，37℃培养12-16h。

J、提取转化产物质粒：挑取单个白色菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养12-16h，提取质粒。

K、克隆阳性质粒鉴定：提取的质粒采用PCR扩增目的片断和用Not I酶切的方法进行筛选和鉴定阳性克隆质粒。

L、经质粒PCR和酶切鉴定为阳性质粒的菌液经(上海生物工程有限公司测序)测得gD基因的氨基酸序列。

M、DNASTAR软件推导ILTV gD的cDNA序列。

5.如权利要求1、2、3、4任一所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗，其特征在于：疫苗包含病毒载体和ILTV gD糖蛋白。

6.如权利要求5所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗，其特征在于：疫苗的病毒载体是鸡痘病毒。

7.如权利要求6所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗，其特征在于：ILTV gD糖蛋白通过同源臂重组到鸡痘病毒。

8.如权利要求6所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗，其特征在于：通过以下步骤制得：

(一)PCR扩增gD基因，并将其分别克隆到pGEM-T载体上。

(二)gD基因通过EcoR1位点亚克隆到pSY538载体鸡痘病毒早晚期启动子EP2LP2下游处，命名为pSY538-gD。

(三)将来自pSC11质粒的痘苗病毒启动子P11控制下的大肠杆菌LacZ基因通过平端连接克隆到pSY538-gD质粒的SmaI位点，命名为pSY538-gD-LacZ。

(四)再将含EP2LP2-gD基因和P11-LacZ基因的Not I酶切片段从pSY538-gD-LacZ质粒中切下，将其亚克隆到含有FPV EcoR1DNA非必需片段的pSY681质粒的NotI位点上，构建成含有gD目的基因和LacZ报告基因的FPV转移质粒，命名为pSY681-gD-LacZ。

(五)重组鸡痘病毒转移载体质粒pSY681-gD-LacZ转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，然后经蓝斑筛选、纯化，并进行PCR鉴定后，采用IFA检测糖蛋白gD的表达情况。

(六)重组鸡痘病毒弱毒疫苗对SPF鸡的免疫保护性试验研究。

9.如权利要求6所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(一)PCR扩增gD基因，并将其分别克隆到pGEM-T载体上；

(二)gD基因通过EcoR1位点亚克隆到pSY538载体鸡痘病毒早晚期启动子EP2LP2下游处，命名为pSY538-gD；

(三)将来自pSC11质粒的痘苗病毒启动子P11控制下的大肠杆菌LacZ基因通过平端连接克隆到pSY538-gD质粒的SmaI位点，命名为pSY538-gD-LacZ；

(四)再将含EP2LP2-gD基因和P11-LacZ基因的Not I酶切片段从pSY538-gD-LacZ质粒中切下，将其亚克隆到含有FPV EcoR1DNA非必需片段的pSY681质粒的NotI位点上，构建成含有gD目的基因和LacZ报告基因的FPV转移质粒，命名为pSY681-gD-LacZ；

(五)重组鸡痘病毒转移载体质粒pSY681-gD-LacZ转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，然后经蓝斑筛选、纯化，并进行PCR鉴定后，采用IFA检测糖蛋白gD的表达情况。

10.如权利要求4、5、6和7任一所述的ILTV gD糖蛋白重组的疫苗的应用，其特征在于：ILTV gD糖蛋白重组的疫苗在免疫鸡传染性喉气管炎上的应用。

Images