CN111534578A - 一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法 - Google Patents

一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法 Download PDF

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常珈菘
夏庆友
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Abstract

本发明涉及一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法，首先是构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库，然后将构建好的载体库稳定转染真核生物细胞，构建真核生物全基因组编辑突变体细胞文库。然后取该细胞文库，均匀的分成两部分培养，收集并且抽提基因组DNA，分别用高通量测序法检测两组细胞的sgRNA丰度，根据两组细胞sgRNA丰度变化来筛选真核生物与农药互作的靶点基因。本发明的最大优点是在全基因组范围内筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因，能够最大限度的筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因，成本低，效率高，范围广。对筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因具有极大地意义。

Description

一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法
技术领域
本发明属于基因编辑和高通量测序技术领域，涉及一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法。
背景技术
我国是一个农业大国，农业一直是国民经济的命脉。农药的使用，为现代农业生产带来了便利，极大的提升了农产品质量和产量。但也由于农药的广泛应用，导致农药残留污染土壤和水源，破坏农业生态***的多样性，并且严重威胁到人类健康。于是，人们把更多的目光投向了无毒无害的生物源农药，但是，越来越多的实践发现，大家一贯认为低毒的生物源农药对环境中的多种非靶标生物均具有毒性。另一方面，昆虫对农药的耐受力增强而产生抗药性的现象也日渐突出。这不仅成为害虫防治的一大障碍，同时，害虫抗药性增强致使人们加大农药的使用剂量，对昆虫抗药性的遏制已经成为近年来农林业发展的重大课题。
除此以外，农药也给诸如家蚕、蜜蜂等重要经济昆虫的生产带来了巨大威胁。具体到蚕桑产业，每年由于农药中毒造成大量减产，严重限制了蚕桑产业的发展，培育高抗农药的家蚕品种亟待解决。
基因编辑是研究功能基因组的重要遗传操作技术，目前已经发展了四代，包括大范围核酸内切酶、锌指核酸酶、类转录因子活化因子核酸酶、CRISPR等。目前应用最广泛的是CRISPR/Cas9***。CRISPR/Cas9***是来源于细菌获得性免疫***的一种基因编辑技术。目前已经在包括人、鼠、果蝇、拟南芥、水稻等物种中成功实现了基因编辑。CRISPR/Cas9***主要包括两部分，一部分是非特异性核酸内切酶Cas9，另一部分是guide RNA。因为设计构建简单，成本低廉，编辑效率高，目前CRISPR/Cas9***的应用范围已经不限于单基因编辑，其应用已经扩展到多基因编辑甚至是全基因组编辑。目前已经在人、小鼠、果蝇等物种中实现了CRISPR/Cas9***介导的全基因组编辑。CRISPR/Cas9***介导的全基因组编辑已经在药物靶点基因筛选、肿瘤发生、免疫反应等研究领域取得了重要成果。
综合运用CRISPR/Cas9介导的全基因组编辑手段，探究真核生物与农药互作的靶标基因具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法，具体步骤如下：
(1)构建转基因***递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；
(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；
(3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用含有农药的培养基培养作为实验组，另一份用不含农药的培养基培养作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；
(4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value<0.05。
作为优选的技术方案之一，所述真核生物为家蚕、果蝇、人等，所述农药为有机磷类农药、生物碱类农药、菊酯类农药、生物源农药等。
作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法是：
(1-1)设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；
(1-2)将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。
作为进一步优选的技术方案之一，按照Cas作用规律，在真核生物全基因组水平设计所有编码蛋白的基因的编辑位点，其打靶位点有如下规律：
5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，设计的sgRNA序列与其在基因组上的打靶位点序列一致，并有如下规律：5’-G-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；根据以上规律设计真核生物全部编码蛋白的基因的打靶位点。
作为进一步优选的技术方案之一，运用搭桥PCR技术和酶切连接技术将合成的单链寡核苷酸库克隆到载体pB-CRISPR上，构建得到基因编辑载体库pB-CRISPR-library。作为优选的技术方案之一，步骤(2)的具体方法是：将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，整合方式包括慢病毒***，转座子***，位点特异性核酸酶***等，得到一种CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。
作为优选的技术方案之一，步骤(3)的具体方法是：将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用用含有农药的培养基培养，直至细胞数量降低至5％，另一份用不含农药的培养基培养相同时间作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA。
作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或消耗的基因即为真核生物细胞与农药互作的候选靶点基因。
本发明的有益效果在于：
本发明首先构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库，然后将该载体库稳定整合真核生物细胞系，构建真核生物全基因组编辑突变体细胞文库。然后取该细胞文库，均匀的分成两部分，其中一份用含有农药的培养基培养，直至细胞数量降低至5％，另一份用不含农药的培养基培养相同时间作为对照组。将两组实验的细胞同时收集并且抽提基因组DNA，分别用高通量测序法检测其sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因。本发明的最大优点是在不设前提条件的情况下，在全基因组范围内筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因。与传统的研究家真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法相比，本发明能够最大限度的筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因，成本低，效率高，范围广。对筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因和研究真核生物抗农药具有极大地意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为阿维菌素筛选的排名前二十的gRNA丰度显著富集的基因中，筛选到了已知的抗药性相关基因P450等，也筛选到了一些可能的抗性基因(深色字体)，具有转运载体活性的基因；
图2为印楝素筛选的排名前二十的gRNA丰度显著富集的基因中，筛选到了一些可能的抗性基因(深色字体)，具有转运载体活性的基因；
图3为鱼藤酮筛选的排名前二十的gRNA丰度显著富集的基因中，筛选到了已知的抗药性相关基因P450等，也筛选到了一些可能的抗性基因(深色字体)，具有转运载体活性的基因；
图4为我们筛选到的生物源的三种农药筛选的排名前二十的gRNA丰度显著消耗的基因，存在很大的重叠部分，这也许说明细胞对不同农药的相应有共同的机制。；
图5为生物源的三种农药筛选到的gRNA丰度显著差异的基因与已知的几大类抗药性相关基因家族重叠的基因数。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
农药是现代农业生产的重要植物保护手段，对于农作物生产具有重大意义，但是农药也带了了很多负面作用，农药污染对于生态平衡和人类健康是重大威胁。筛选真核生物细胞与农药互作的靶标基因具有重要的价值。
以下凡是未注明的具体实验方法，都按照公认的实验方法与条件实施，例如，按照试剂耗材厂商提供的说明书操作，或者按照经典实验书籍《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克等著)来完成实验。
实施例：
本实施例中所用到的家蚕胚胎细胞系(The Bombyx mori embryonic cell line,BmE)为生物实验中常用细胞系(PMID:17570024)。
1、构建家蚕胚胎细胞系BmE全基因组编辑细胞文库。
1)构建一个piggyBac转座子***介导的家蚕CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库，绝大多数基因都设计了6个打靶位点，构建了6个基因编辑载体；总计设计并构建94000个基因编辑载体。
2)将步骤1)构建的家蚕全基因组编辑突变体库与piggyBac transposase表达载体A3-helper(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1)按照摩尔比1:1转染家蚕胚胎细胞系BmE，转染方法包括但不限于脂质体转染法、电穿孔转染法等。然后用包含Zeocin的完全培养基筛选2个月，构建成家蚕BmE细胞全基因组编辑细胞文库。细胞完全培养基为包含体积浓度10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS，赛默飞世尔公司)和青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，20万单位/升，赛默飞世尔公司)的Grace昆虫培养基(Grace's InsectMedium，赛默飞世尔公司)。培养条件为27℃，Zeocin购买自赛默飞世尔公司，工作浓度为200μg/ml。
2、将步骤1构建的家蚕BmE细胞全基因组编辑细胞文库均匀的分成两份，其中一份用含有农药{本实验用到的农药分别有三种生物源：阿维菌素(Abamectin)，工作浓度20μM；鱼藤酮(rotenone)，工作浓度500nM；印楝素(azadirachtin)，工作浓度30μM。相应的，对照细胞也有三组}的培养基培养，直至细胞数量降低至5％，另一份用不含农药的培养基培养相同时间作为对照组，然后同时将两组细胞收集。
3、将步骤2收集的两组细胞分别抽提基因组DNA。
4、根据步骤1中构建的piggyBac转座子***介导的家蚕CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库，设计一对引物对用于扩增sgRNA片段。
正向引物>gD-F，5-NNNNNNNNNNNNTAAATCACGCTTTCAATA，N表示碱基A、T、G或C，如SEQ ID NO.2所示；
反向引物>gD-R，5-NNNNNNNNNNNNCGACTCGGTGCCACTTT，N表示碱基A、T、G或C，如SEQID NO.3所示。
5、以步骤3抽提的两组基因组作为模板，用步骤4描述的引物对gD-F/gD-R扩增sgRNA片段，然后执行高通量测序，步骤3所得的全部基因组都要用于PCR扩增。
6、通过分析步骤5的高通量测序数据，统计两组细胞sgRNA的丰度，分析筛选家蚕细胞与农药互作的靶点基因，其中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或消耗的基因为家蚕细胞与农药互作的候选靶点基因。
8、家蚕细胞与农药互作靶点基因的筛选结果
1)阿维菌素筛选的排名前二十的gRNA丰度显著富集的基因中，筛选到了已知的抗药性相关基因P450等，也筛选到了一些可能的抗性基因(深色色字体)，具有转运载体活性的基因，见图1。
2)印楝素筛选的排名前二十的gRNA丰度显著富集的基因中，筛选到了一些可能的抗性基因(深色色字体)，具有转运载体活性的基因，见图2。
3)鱼藤酮筛选的排名前二十的gRNA丰度显著富集的基因中，筛选到了已知的抗药性相关基因P450等，也筛选到了一些可能的抗性基因(深色色字体)，具有转运载体活性的基因，见图3。
4)我们筛选到的生物源的三种农药筛选的排名前二十的gRNA丰度显著消耗的基因，存在很大的重叠部分，这也许说明细胞对不同农药的相应有共同的机制，见图4。
5)生物源的三种农药筛选到的gRNA丰度显著差异的基因与已知的几大类抗药性相关基因家族重叠的基因数，见图5。
9、以上实验说明运用CRISPR介导的全基因组编辑细胞文库可以有效的筛选出真核生物细胞与农药互作的靶点基因。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作靶点基因的方法
<130> 2020
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6161
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
aaatcaactt gtgttatagt cacggatttg ccgtccaacg tgttcctcaa aaagttgaag 60
accaacaagt ttacggacac tattaattat ttgattttgc cccacttcat tttgtgggat 120
cacaattttg ttatattttt aaacaaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 180
actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 240
gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 300
atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 360
gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 420
acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 480
gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 540
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cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 2160
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ctgtcacaca gtaaacggca tactgctctc gttggttcga gagagcgcgc ctcgaatgtt 3000
cgcgaaaaga gcgccggagt ataaatagag gcgcttcgtc tacggagcga caattcaatt 3060
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aacaagctaa acaatctgca gtaaagtgca agttaaagtg aatcaattaa aagtaaccag 3180
caaccaagta aatcaactgc aactactgaa atctgccaag aagtaattat tgaatacaag 3240
aagagaactc tgggggatcc ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt 3300
ttgaactata acgaccgcgt gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta 3360
agatttaact catacgataa ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat 3420
tatatatata ttttcttgtt atagatatcg tgactaatat ataataaaat gggtagttct 3480
ttagacgatg agcatatcct ctctgctctt ctgcaaagcg atgacgagct tgttggtgag 3540
gattctgaca gtgaaatatc agatcacgta agtgaagatg acgtccagag cgatacagaa 3600
gaagcgttta tagatgaggt acatgaagtg cagccaacgt caagcggtag tgaaatatta 3660
gacgaacaaa atgttattga acaaccaggt tcttcattgg cttctaacag aatcttgacc 3720
ttgccacaga ggactattag aggtaagaat aaacattgtt ggtcaacttc aaagtccacg 3780
aggcgtagcc gagtctctgc actgaacatt gtcagatctc aaagaggtcc gacgcgtatg 3840
tgccgcaata tatatgaccc acttttatgc ttcaaactat tttttactga tgagataatt 3900
tcggaaattg taaaatggac aaatgctgag atatcattga aacgtcggga atctatgaca 3960
ggtgctacat ttcgtgacac gaatgaagat gaaatctatg ctttctttgg tattctggta 4020
atgacagcag tgagaaaaga taaccacatg tccacagatg acctctttga tcgatctttg 4080
tcaatggtgt acgtctctgt aatgagtcgt gatcgttttg attttttgat acgatgtctt 4140
agaatggatg acaaaagtat acggcccaca cttcgagaaa acgatgtatt tactcctgtt 4200
agaaaaatat gggatctctt tatccatcag tgcatacaaa attacactcc aggggctcat 4260
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ccaaacaagc caagtaagta tggaataaaa atcctcatga tgtgtgacag tggtacgaag 4380
tatatgataa atggaatgcc ttatttggga agaggaacac agaccaacgg agtaccactc 4440
ggtgaatact acgtgaagga gttatcaaag cctgtgcacg gtagttgtcg taatattacg 4500
tgtgacaatt ggttcacctc aatccctttg gcaaaaaact tactacaaga accgtataag 4560
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tcatataaac cgaagccagc taagatggta tacttattat catcttgtga tgaggatgct 4740
tctatcaacg aaagtaccgg taaaccgcaa atggttatgt attataatca aactaaaggc 4800
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Claims (6)

1.一种高通量筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)构建转基因***递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；
(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；
(3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用含有农药的培养基培养作为实验组，另一份用不含农药的培养基培养作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；
(4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与农药互作的靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value<0.05。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真核生物为家蚕、果蝇、人，所述农药为有机磷类农药、生物碱类农药、菊酯类农药、生物源农药等。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：
(1-1)设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；
(1-2)将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，整合方式包括慢病毒***，转座子***，位点特异性核酸酶***等，得到一种CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用用含有农药的培养基培养，直至细胞数量降低至5％，另一份用不含农药的培养基培养相同时间作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或消耗的基因即为真核生物细胞与农药互作的候选靶点基因。
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