CN111534544A - 一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法，首先构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库，然后将该载体库稳定转染真核生物细胞系，构建真核生物全基因组编辑突变体细胞文库。然后取该细胞文库，均匀的分成两部分，培养，收集并且抽提基因组DNA，分别用高通量测序法检测其sgRNA丰度，筛选真核生物与病毒互作靶点基因。本发明的最大优点是在不设前提条件的情况下，在全基因组范围内筛选真核生物与病毒互作靶点基因。与传统的研究真核生物与病毒互作靶点基因的方法相比，本发明能够最大限度的筛选真核生物与病毒互作靶点基因，成本低，效率高，范围广。

Description

一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法

技术领域

本发明属于基因编辑和高通量测序技术领域，涉及一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法。

背景技术

病毒是一种重要的微生物，个体微小，结构简单，通常只含有一种核酸(DNA或RNA)，并且病毒必须存活在活细胞内。病毒本身核酸非常少，只包含少数必须基因，既没有完整的代谢相关基因，也没有各种复制的酶***，因此，离开宿主细胞后，病毒虽然还能存活，但是已经没有生命活动了，属于休眠状态。由于病毒自身不具有完成全部生命活动的基因，所以病毒只能借助活细胞的细胞器和胞内环境来完成增殖。

病毒是重要的病原微生物，和一系列动物、植物病害密切相关，如感染哺乳动物的流感病毒、免疫缺陷病毒，感染昆虫的杆状病毒，感染植物的烟草花叶病毒、水稻矮缩病毒等。病毒广泛存在，严重威胁着包括人类在内的广大动植物的生命安全。为了防治病毒病，无数科研人员进行了艰苦的探索，解析了大量病毒的基因组、晶体结构，发现了许多病毒侵染真核生物的途径，阐明了很多与病毒侵染密切相关的真核生物信号通路，在一定程度上为真核生物与病毒互作研究奠定了基础。但是，目前还有很多病毒危害动植物，对于很多病毒人类现在都束手无策。

基因编辑是研究功能基因组的重要遗传操作技术，目前已经发展了四代，包括大范围核酸内切酶、锌指核酸酶、类转录因子活化因子核酸酶、CRISPR等。目前应用最广泛的是CRISPR/Cas9***。CRISPR/Cas9***是来源于细菌获得性免疫***的一种基因编辑技术。目前已经在包括人、鼠、果蝇、拟南芥、水稻等物种中成功实现了基因编辑。因为设计构建简单，成本低廉，编辑效率高，目前CRISPR/Cas9***的应用范围已经不限于单基因编辑，其应用已经扩展到多基因编辑甚至是全基因组编辑。目前已经在人、小鼠、果蝇、水稻等物种中实现了CRISPR/Cas9***介导的全基因组编辑。CRISPR/Cas9***介导的全基因组编辑已经在药物靶点基因筛选、肿瘤发生、免疫反应等研究领域取得了重要成果。

综合运用CRISPR/Cas9介导的全基因组编辑手段，对解决真核生物与病毒互作研究具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法，具体步骤如下：

(1)构建转基因***递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；

(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；

(3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用病毒感染作为实验组，另一份作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；

(4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value<0.05。

作为优选的技术方案之一，所述真核生物为家蚕、果蝇、人等，所述病毒为能够感染真核生物的病毒。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)的具体方法是：

(1-1)设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；

(1-2)将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。

作为进一步优选的技术方案之一，按照Cas作用规律，在真核生物全基因组水平设计所有编码蛋白的基因的编辑位点，其打靶位点有如下规律：

5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-NGG-3’，设计的sgRNA序列与其在基因组上的打靶位点序列一致，并有如下规律：5’-G-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；根据以上规律设计真核生物全部编码蛋白的基因的打靶位点。

作为进一步优选的技术方案之一，将合成的单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)的具体方法是：将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。

作为优选的技术方案之一，步骤(3)的具体方法是：将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用病毒感染，直至细胞数量降低至5％，另一份用完全培养基在正常条件下培养相同时间，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA。

作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或者消耗的基因即为真核生物细胞与病毒互作候选靶点基因。

本发明的有益效果在于：

本发明首先构建真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库，然后将该载体库稳定转染真核生物细胞系，构建真核生物全基因组编辑突变体细胞文库。然后取该细胞文库，均匀的分成两部分，其中一份用病毒感染，另一份用不含病毒的培养基培养相同的时间。将两组实验的细胞同时收集并且抽提基因组DNA，分别用高通量测序法检测其sgRNA丰度，筛选真核生物与病毒互作靶点基因。本发明的最大优点是在不设前提条件的情况下，在全基因组范围内筛选真核生物与病毒互作靶点基因。与传统的研究家真核生物与病毒互作靶点基因的方法相比，本发明能够最大限度的筛选真核生物与病毒互作靶点基因，成本低，效率高，范围广。对筛选真核生物抗病毒靶点基因和研究病毒宿主互作具有极大地意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明的工作流程图；

图2为已有文献报道的大量家蚕抗BmNPV基因都在我们筛选到的抗BmNPV靶点基因库中，其中，深色散点为已有文献报道的家蚕抗BmNPV基因；

图3为KEGG pathway富集分析图。

图4为吞噬体途径基因的sgRNA得分图；

图5为BmNPV侵染关键通路和抑制通路示意图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

在众多蚕病中家蚕病毒病对养蚕业的危害最大，尤其是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus NPV)经常给养蚕业带来毁灭性的打击。以下以家蚕及家蚕核型多角体病毒为例说明本发明，但本发明并不局限于家蚕及家蚕核型多角体病毒。

以下凡是未注明的具体实验方法，都按照公认的实验方法与条件实施，例如，按照试剂耗材厂商提供的说明书操作，或者按照经典实验书籍《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克等著)来完成实验。

实施例：

本实施例中所用到的家蚕胚胎细胞系(The Bombyx mori embryonic cell line,BmE)为生物实验中常用细胞系(PMID:17570024)。

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)含有绿色荧光蛋白(EGFP)为生物学常用材料(PMID:29875158)。

具体工作流程见图1。

1、家蚕胚胎细胞系BmE全基因组编辑细胞文库。

1)构建或购买一个piggyBac转座子***介导的家蚕CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库，绝大多数基因都设计了6个打靶位点，构建了6个基因编辑载体；总计设计并构建94000个基因编辑载体。

2)将步骤1)构建的家蚕全基因组编辑突变体库与piggyBac transposase表达载体A3-helper(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1)按照摩尔比1:1转染家蚕胚胎细胞系BmE，转染方法包括但不限于脂质体转染法、电穿孔转染法等。然后用包含Zeocin的完全培养基筛选2个月，构建成家蚕BmE细胞全基因组编辑细胞文库。细胞完全培养基为包含体积浓度10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS，赛默飞世尔公司)和青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin，20万单位/升，赛默飞世尔公司)的Grace昆虫培养基(Grace's InsectMedium，赛默飞世尔公司)。培养条件为27℃，Zeocin购买自赛默飞世尔公司，工作浓度为200μg/ml。

2、家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)的准备

1)BmNPV病毒的繁殖。将家蚕核型多角体病毒(Bombyx moriNucleopolyhedrovirus,BmNPV)感染BmE细胞，48小时后收集培养基，收集BmNPV病毒(PMID:29875158)。

2)BmNPV病毒感染复数的计算

将步骤1)收集BmNPV病毒用梯度稀释的方法感染BmE细胞，计算病毒感染复数。

3、将步骤1构建的家蚕BmE细胞全基因组编辑细胞文库均匀的分成两份，其中一份用低感染复数(MOI＝1)的BmNPV反复感染4次，间隔时间为一天，然后用流式细胞仪分选不发绿色荧光的细胞，另一份用完全培养基培养相同的时间，然后同时将两组细胞收集备用。

4、将步骤3收集的两组细胞分别抽提基因组DNA备用。

5、根据步骤1中构建的piggyBac转座子***介导的家蚕CRISPR/Cas9全基因组编辑载体文库，设计一对引物用于扩增sgRNA片段。

正向引物>gD-F，5-NNNNNNNNNNNNTAAATCACGCTTTCAATA，N表示碱基A、T、G或C，如SEQ ID NO.2所示；

反向引物>gD-R，5-NNNNNNNNNNNNCGACTCGGTGCCACTTT，N表示碱基A、T、G或C，如SEQID NO.3所示。

6、以步骤4抽提的两组基因组作为模板，用步骤5描述的引物对gD-F/gD-R扩增sgRNA片段，然后执行高通量测序，步骤4所得的全部基因组都要用于PCR扩增。

7、通过分析步骤6的高通量测序数据，统计两组细胞sgRNA的丰度，分析筛选家蚕抗BmNPV靶点基因，其中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或消耗的基因为家蚕细胞与BmNPV互作的候选靶点基因。

8、家蚕抗BmNPV靶点基因的筛选结果

1)已有文献报道的大量家蚕抗BmNPV基因都在我们筛选到的抗BmNPV靶点基因库中。见图2。

2)KEGG pathway富集分析显示，本专利筛选到的家蚕抗BmNPV基因主要分布在已有报道的Phagsome、Notch signaling pathway、Wnt signaling pathway等通路中，同时，也发现了新的通路如MAPK signaling-fly和Dorso-ventral axis formation。见图3。

3)sgRNA分析显示，Phagsome通路关键基因v-ATPase基因的sgRNA被高度富集。见图4。

4)家蚕BmE细胞系与BmNPV互作关键通路分析。左边图片表示Phagsome通路众多基因的sgRNA富集，表明Phagsome通路是BmNPV侵染关键通路，也是家蚕抗BmNPV靶点通路。右边图片表示Wnt signaling pathway关键基因sgRNA消耗情况，表明Wnt signalingpathway是BmNPV侵染抑制通路。见图5。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6161

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

aaatcaactt gtgttatagt cacggatttg ccgtccaacg tgttcctcaa aaagttgaag 60

accaacaagt ttacggacac tattaattat ttgattttgc cccacttcat tttgtgggat 120

cacaattttg ttatattttt aaacaaagct tggcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg 180

actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca 240

gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga 300

atggcgaatg gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc 360

gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 420

acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca 480

gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga 540

aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa 600

taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 660

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 720

tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 780

ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 840

taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 900

gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta 960

aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc 1020

gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 1080

ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 1140

ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 1200

acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 1260

taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 1320

tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 1380

cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 1440

ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 1500

gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 1560

gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 1620

aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct 1680

aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 1740

actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 1800

gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 1860

atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 1920

atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 1980

ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 2040

gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 2100

cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 2160

tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 2220

cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 2280

ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 2340

gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 2400

tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 2460

ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 2520

gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 2580

cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 2640

gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 2700

ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 2760

acagctatga catgattacg aattcgaatt cccatccccc tagaatccca aaacaaactg 2820

gttattgtgg taggtcattt gtttggcaga aagaaaactc gagaaatttc tctggccgtt 2880

attcgttatt ctctcttttc tttttgggtc tctccctctc tgcactaatg ctctctcact 2940

ctgtcacaca gtaaacggca tactgctctc gttggttcga gagagcgcgc ctcgaatgtt 3000

cgcgaaaaga gcgccggagt ataaatagag gcgcttcgtc tacggagcga caattcaatt 3060

caaacaagca aagtgaacac gtcgctaagc gaaagctaag caaataaaca agcgcagctg 3120

aacaagctaa acaatctgca gtaaagtgca agttaaagtg aatcaattaa aagtaaccag 3180

caaccaagta aatcaactgc aactactgaa atctgccaag aagtaattat tgaatacaag 3240

aagagaactc tgggggatcc ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt 3300

ttgaactata acgaccgcgt gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta 3360

agatttaact catacgataa ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat 3420

tatatatata ttttcttgtt atagatatcg tgactaatat ataataaaat gggtagttct 3480

ttagacgatg agcatatcct ctctgctctt ctgcaaagcg atgacgagct tgttggtgag 3540

gattctgaca gtgaaatatc agatcacgta agtgaagatg acgtccagag cgatacagaa 3600

gaagcgttta tagatgaggt acatgaagtg cagccaacgt caagcggtag tgaaatatta 3660

gacgaacaaa atgttattga acaaccaggt tcttcattgg cttctaacag aatcttgacc 3720

ttgccacaga ggactattag aggtaagaat aaacattgtt ggtcaacttc aaagtccacg 3780

aggcgtagcc gagtctctgc actgaacatt gtcagatctc aaagaggtcc gacgcgtatg 3840

tgccgcaata tatatgaccc acttttatgc ttcaaactat tttttactga tgagataatt 3900

tcggaaattg taaaatggac aaatgctgag atatcattga aacgtcggga atctatgaca 3960

ggtgctacat ttcgtgacac gaatgaagat gaaatctatg ctttctttgg tattctggta 4020

atgacagcag tgagaaaaga taaccacatg tccacagatg acctctttga tcgatctttg 4080

tcaatggtgt acgtctctgt aatgagtcgt gatcgttttg attttttgat acgatgtctt 4140

agaatggatg acaaaagtat acggcccaca cttcgagaaa acgatgtatt tactcctgtt 4200

agaaaaatat gggatctctt tatccatcag tgcatacaaa attacactcc aggggctcat 4260

ttgaccatag atgaacagtt acttggtttt agaggacggt gtccgtttag gatgtatatc 4320

ccaaacaagc caagtaagta tggaataaaa atcctcatga tgtgtgacag tggtacgaag 4380

tatatgataa atggaatgcc ttatttggga agaggaacac agaccaacgg agtaccactc 4440

ggtgaatact acgtgaagga gttatcaaag cctgtgcacg gtagttgtcg taatattacg 4500

tgtgacaatt ggttcacctc aatccctttg gcaaaaaact tactacaaga accgtataag 4560

ttaaccattg tgggaaccgt gcgatcaaac aaacgcgaga taccggaagt actgaaaaac 4620

agtcgctcca ggccagtggg aacatcgatg ttttgttttg acggacccct tactctcgtc 4680

tcatataaac cgaagccagc taagatggta tacttattat catcttgtga tgaggatgct 4740

tctatcaacg aaagtaccgg taaaccgcaa atggttatgt attataatca aactaaaggc 4800

ggagtggaca cgctagacca aatgtgttct gtgatgacct gcagtaggaa gacgaatagg 4860

tggcctatgg cattattgta cggaatgata aacattgcct gcataaattc ttttattata 4920

tacagccata atgtcagtag caagggagaa aaggttcaaa gtcgcaaaaa atttatgaga 4980

aacctttaca tgagcctgac gtcatcgttt atgcgtaagc gtttagaagc tcctactttg 5040

aagagatatt tgcgcgataa tatctctaat attttgccaa atgaagtgcc tggtacatca 5100

gatgacagta ctgaagagcc agtaatgaaa aaacgtactt actgtactta ctgcccctct 5160

aaaataaggc gaaaggcaaa tgcatcgtgc aaaaaatgca aaaaagttat ttgtcgagag 5220

cataatattg atatgtgcca aagttgtttc tgactgacta ataagtataa tttgtttcta 5280

ttatgtataa gttaagctaa ttacttattt tataatacaa catgactgtt tttaaagtac 5340

aaaataagtt tatttttgta aaagagagaa tgtttaaaag ttttgttact ttatagaaga 5400

aattttgagt ttttgttttt ttttaataaa taaataaaca taaataaatt gtttgttgaa 5460

tttattatta gtatgtaagt gtaaatataa taaaacttaa tatctattca aattaataaa 5520

taaacctcga tatacagacc gataaaacac atgcgtcaat tttacgcatg attatcttta 5580

acgtacgtca caatatgatt atctttctag ggttaaataa tagtttctaa tttttttatt 5640

attcagcctg ctgtcgtgaa taccgtatat ctcaacgctg tctgtgagat tgtcgtattc 5700

tagccttttt agtttttcgc tcatcgactt gatattgtcc gacacatttt cgtcgatttg 5760

cgttttgatc aaagacttga gcagagacac gttaatcaac tgttcaaatt gatccatatt 5820

aacgatatca acccgatgcg tatatggtgc gtaaaatata ttttttaacc ctcttatact 5880

ttgcactctg cgttaatacg cgttcgtgta cagacgtaat catgttttct tttttggata 5940

aaactcctac tgagtttgac ctcatattag accctcacaa gttgcaaaac gtggcatttt 6000

ttaccaatga agaatttaaa gttattttaa aaaatttcat cacagattta aagaagaacc 6060

aaaaattaaa ttatttcaac agtttaatcg accagttaat caacgtgtac acagacgcgt 6120

cggcaaaaaa cacgcagccc gacgtgttgg ctaaaattat t 6161

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

nnnnnnnnnn nntaaatcac gctttcaata 30

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

nnnnnnnnnn nncgactcgg tgccacttt 29

Claims (6)

1.一种高通量筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建转基因***递送的真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑载体文库；

(2)将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种真核生物CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库；

(3)将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用病毒感染作为实验组，另一份作为对照组，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA；

(4)以步骤(3)抽提的全部基因组作为模板，设计引物扩增各组细胞的sgRNA片段，执行高通量测序，统计sgRNA丰度，筛选真核生物细胞与病毒互作靶点基因，靶点基因的筛选标准为p-value<0.05。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述真核生物为家蚕、果蝇、人，所述病毒为能够感染真核生物的病毒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：

(1-1)设计打靶位点，每个基因设计6个左右的打靶位点，并且用DNA芯片的方式合成包含打靶位点的单链寡核苷酸库；

(1-2)将所得单链寡核苷酸库克隆到转基因载体上，构建得到基因编辑载体库。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：将步骤(1)构建的载体文库稳定整合到真核生物细胞基因组上，得到一种CRISPR/Cas全基因组编辑细胞文库。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：将步骤(2)所构建的细胞文库均匀分成两份，其中一份用病毒感染，直至细胞数量降低至5％，另一份用不含病毒的培养基培养相同时间，然后同时将两组细胞收集，并分别抽提基因组DNA。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，与对照组相比，实验组sgRNA富集或消耗的基因即为真核生物细胞与病毒互作的候选靶点基因。

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