CN111534510A - 一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法 - Google Patents

一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111534510A
CN111534510A CN202010438066.4A CN202010438066A CN111534510A CN 111534510 A CN111534510 A CN 111534510A CN 202010438066 A CN202010438066 A CN 202010438066A CN 111534510 A CN111534510 A CN 111534510A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
concentration
kit
pathogen nucleic
magnetic beads
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010438066.4A
Other languages
English (en)
Inventor
肖理慧
孙凤娟
王庆专
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Lingjun Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Lingjun Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Lingjun Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Lingjun Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010438066.4A priority Critical patent/CN111534510A/zh
Publication of CN111534510A publication Critical patent/CN111534510A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,具体涉及核酸提取技术领域,所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液;提取方法为:利用生理盐水和蛋白酶处理液处理离心的样本;加入裂解液、异丙醇和纳米磁珠震荡后静置;采用纳米磁珠多次吸附核酸;最后干燥、水浴洗脱即得病原体核酸。本发明提取纯化步骤简单、操作过程安全便捷、病原体核酸含量高,纯度高,通过简单的操作步骤得到高纯度、高浓度的病原体核酸,方便研究人员进行后续的检测。

Description

一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法
技术领域
本发明实施例涉及核酸提取技术领域,具体涉及一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法。
背景技术
口腔由于呼吸和进食,会存留大量种类繁多的细菌。正常人咽峡部培养应有口腔正常菌群,而无致病菌生长。但在机体全身或局部抵抗力下降和其他外部因素下可以出现感染等而导致疾病,如呼吸道感染、流感等。因此,咽拭子分泌物中病原体(细菌、病毒、衣原体等)的检测,是临床上重要的诊断手段。
目前病原体核酸提取纯化的方法有很多种,如离心柱法和磁珠法。这些方法各有优缺点,但都应考虑以下原则:将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净;排除有机溶剂和金属离子的污染。基于纳米磁珠的提取技术是利用亲水性纳米磁珠特异性地吸附样品溶液中的核酸,在外加磁场的作用将吸附的核酸-磁珠复合物从样品溶液中分离,通过洗涤液洗涤去除溶液中的蛋白和盐离子,最后在仅留有特异吸附核酸的磁珠中加入洗脱液,将核酸释放于洗脱液中。磁珠法提取病原体核酸与离心柱法相比,操作简单,不易污染,已经成为目前分子生物学和临床检验医学研究的理想方法。
但是现有纳米磁珠提取技术还存在以下不足:提取纯化步骤较多,操作繁琐,所得病原体核酸含量底,且纯度不高,不能够直接用于后续检测。
发明内容
为此,本发明实施例提供一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,提取纯化步骤少,操作简便,整个过程不涉及有毒试剂,安全便捷,所得病原体核酸含量高,纯度高,可直接用于后续检测,以解决现有技术中存在的问题。
为了实现上述目的,本发明实施例提供如下技术方案:一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒,所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液;
本发明还提供了一种咽拭子样本中病原体核酸的提取方法,包括如下步骤:
步骤S1:取一新鲜咽拭子样本于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和10-40ul蛋白酶处理液,震荡混匀1min, 56℃水浴静置10min;
步骤S2:取50-200ul步骤S1中的样本处理液于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入75-300ul裂解液、75-300ul异丙醇和纳米磁珠5-20ul,震荡混匀1min,室温静置10min;
步骤S3:将步骤S2中的离心管置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
步骤S4:使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入300-800ul洗涤液,将该离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
步骤S5:重复步骤S4一次;
步骤S6:室温开盖干燥5-20min直至管内无液体残留;
步骤S7:使用无菌移液枪头向步骤S6离心管中加入100-200ul洗脱液, 56℃水浴5-10min;
步骤S8:将步骤S7离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管,即获得样本中的病原体核酸。
进一步地,步骤S1中所述的蛋白酶处理液浓度为10-200mg/ml。
进一步地,所述蛋白酶处理液包括蛋白酶K,且蛋白酶K浓度为10-50 mg/ml。
进一步地,所述裂解液包括异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸、Tween 20,其中异硫氰酸胍浓度为3-5mM,碘化锂浓度为1-5M,柠檬酸三钠浓度为50-200 mM,Tween 20浓度为1%-5%,所述裂解液pH值为4.0-7.0。
进一步地,步骤S2中所述的纳米磁珠添加浓度为50-200mg/ml。
进一步地,所述纳米磁珠为包裹有二氧化硅的Fe3O4,所述纳米磁珠直径为200-2000nm,浓度为50-200mg/ml。
进一步地,所述洗涤液包括Tris-HCL、NaCL和无水乙醇,所述Tris-HC 的pH为6.5-8.5,浓度为1-5mM,所述NaCL浓度为10-50mM,所述无水乙醇浓度为40%-80%。
进一步地,所述洗脱液为无菌DEPC水,pH值为7.0-9.0。
本发明实施例具有如下优点:
本发明病原体核酸提取试剂盒采用蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液,采用该试剂盒进行核酸提取,提取过程不涉及有毒试剂,安全便捷,且提取方法具有提取纯化步骤少,操作简便,所得病原体核酸含量高,纯度高,可直接用于后续检测的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是示例性的,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等,均仅用以配合说明书所揭示的内容,以供熟悉此技术的人士了解与阅读,并非用以限定本发明可实施的限定条件,故不具技术上的实质意义,任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整,在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下,均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例1提供的咽拭子样本呼吸道合胞病毒提取产物及其稀释物采用荧光PCR检测的扩增曲线。
图2为本发明实施例2提供的咽拭子样本柯萨奇病毒A组16型提取产物及其稀释物采用荧光PCR检测的扩增曲线。
图3为本发明实施例3提供的咽拭子样本肠道病毒71型提取产物采用荧光PCR检测的扩增曲线。
图4为本发明实施例4提供的咽拭子样本流感病毒提取产物采用荧光PCR 检测的扩增曲线。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
该实施例的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒,所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液;
进一步地,所述蛋白酶处理液包括蛋白酶K,且蛋白酶K浓度为10-50 mg/ml。
进一步地,所述裂解液包括异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸、Tween 20,其中异硫氰酸胍浓度为3-5mM,碘化锂浓度为1-5M,柠檬酸三钠浓度为50-200 mM,Tween 20浓度为1%-5%,所述裂解液pH值为4.0-7.0。
进一步地,所述纳米磁珠为包裹有二氧化硅的Fe3O4,所述纳米磁珠直径为200-2000nm,浓度为50-200mg/ml。
进一步地,所述洗涤液包括Tris-HCL、NaCL和无水乙醇,所述Tris-HC 的pH为6.5-8.5,浓度为1-5mM,所述NaCL浓度为10-50mM,所述无水乙醇浓度为40%-80%。
进一步地,所述洗脱液为无菌DEPC水,pH值为7.0-9.0。
本发明还提供了一种咽拭子样本中病原体核酸的提取方法,包括如下步骤:
步骤S1:取一新鲜咽拭子样本于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和10-40ul蛋白酶处理液,震荡混匀1min, 56℃水浴静置10min;
步骤S2:取50-200ul步骤S1中的样本处理液于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入75-300ul裂解液、75-300ul异丙醇和纳米磁珠5-20ul,震荡混匀1min,室温静置10min;
步骤S3:将步骤S2中的离心管置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
步骤S4:使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入300-800ul洗涤液,将该离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
步骤S5:重复步骤S4一次;
步骤S6:室温开盖干燥5-20min直至管内无液体残留;
步骤S7:使用无菌移液枪头向步骤S6离心管中加入100-200ul洗脱液, 56℃水浴5-10min;
步骤S8:将步骤S7离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管,即获得样本中的病原体核酸。
进一步地,步骤S1中所述的蛋白酶处理液浓度为10-200mg/ml。
进一步地,步骤S2中所述的纳米磁珠添加浓度为50-200mg/ml。
以下举出本发明的具体实施例。
实施例1:
1)取临床PCR检定呼吸道合胞病毒感染患者的咽拭子样本于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和浓度为10 mg/ml的蛋白酶处理液10ul,震荡混匀1min,56℃水浴静置10min;
2)取50ul上述样本处理液于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入75ul裂解液、75ul异丙醇和50mg/ml的纳米磁珠5ul,震荡混匀1min,室温静置10min;其中,裂解液内加入的成分分别是:浓度2.5mM 的异硫氰酸胍、浓度50mM的柠檬酸和5%Tween20,其余成分为水;裂解液的pH值为4.5;
3)将该离心管置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
4)从磁力架上取出离心管,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul 洗涤液,将该离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;其中,洗涤液内加入的成分分别是:pH 6.5且浓度1mM的Tris-HCL、浓度10mM NaCL和40%的无水乙醇,其余成分为水;
5)重复步骤4)一次;
6)从磁力架上取出离心管,室温开盖干燥5min直至管内无液体残留;
7)使用无菌移液枪头向该离心管中加入100ul洗脱液,56℃水浴5min;其中,洗脱液为无菌DEPC水;洗脱液的pH值为7.0;
8)将该离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管,即获得样本中的病原体核酸;
9)用上述的核酸提取产物制备其10倍梯度稀释物,用于荧光PCR扩增检定提取结果,如下表和附图1所示:
表1
合胞病毒核酸 Ct值
原液 24.12
稀释10倍后的稀释物 27.41
稀释100倍后的稀释物 30.61
稀释1000倍后的稀释物 33.69
结论:采用实施例1成功从咽拭子中提取到了呼吸道合胞病毒核酸RNA,该RNA经10倍梯度稀释后,PCR检测结果曲线呈明显S型,且梯度均一,说明提取的核酸RNA纯度较高。
实施例2:
1)取临床PCR检定为柯萨奇病毒A组16型感染患者的一新鲜咽拭子样本于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和浓度为10mg/ml的蛋白酶处理液40ul,震荡混匀1min,56℃水浴静置10 min;
2)取200ul上述样本处理液于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul裂解液、300ul异丙醇和50mg/ml的纳米磁珠20ul,震荡混匀1min,室温静置10min;其中,裂解液内加入的成分分别是:浓度4.5 mM的异硫氰酸胍、浓度150mM的柠檬酸和10%Tween 20,其余成分为水;裂解液的pH值为6.5;
3)将该离心管置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
4)从磁力架上取出离心管,使用无菌移液枪头向该离心管中加入800ul 洗涤液,将该离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;其中,洗涤液内加入的成分分别是:pH 8.5且浓度5mM的Tris-HCL、浓度50mM NaCL和80%的无水乙醇,其余成分为水;
5)重复步骤4)一次;
6)从磁力架上取出离心管,室温开盖干燥20min直至管内无液体残留;
7)使用无菌移液枪头向该离心管中加入100ul洗脱液,56℃水浴10min;其中,洗脱液为无菌DEPC水;洗脱液的pH值为8.0;
8)将该离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管,即获得样本中的病原体核酸;
9)用上述的核酸提取产物制备其10倍梯度稀释物,用于荧光PCR扩增检定提取结果,如下表2和附图2所示:
表2
柯萨奇病毒A组16型核酸 Ct值
原液 23.00
稀释10倍后的稀释物 26.15
稀释100倍后的稀释物 29.40
稀释1000倍后的稀释物 32.60
稀释10000倍后的稀释物 36.05
结论:采用实施例2成功从咽拭子中提取到了柯萨奇病毒A组16型核酸RNA,该RNA经10倍梯度稀释后,PCR检测结果曲线呈明显S型,且梯度均一,说明提取的核酸RNA纯度较高。
实施例3:
1)取临床PCR检定为肠道病毒71型感染患者的一新鲜咽拭子样本于1.5 ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和浓度为 50mg/ml的蛋白酶处理液10ul,震荡混匀1min,56℃水浴静置10min;
2)取六份50ul上述样本处理液于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向六个离心管中加入150ul裂解液、150ul异丙醇和100mg/ml的纳米磁珠 10ul,震荡混匀1min,室温静置10min;其中,裂解液内加入的成分分别是:浓度4.0mM的异硫氰酸胍、浓度100mM的柠檬酸和10%Tween 20,其余成分为水;裂解液的pH值为6.0;
3)将六个离心管置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
4)从磁力架上取出离心管,使用无菌移液枪头向六个离心管中加入500ul 洗涤液,将该离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;其中,洗涤液内加入的成分分别是:pH 7.5且浓度3mM的Tris-HCL、浓度20mM NaCL和50%的无水乙醇,其余成分为水;
5)重复步骤4)一次;
6)从磁力架上取出六个离心管,室温开盖干燥10min直至管内无液体残留;
7)使用无菌移液枪头向六个离心管中加入100ul洗脱液,56℃水浴10 min。其中,洗脱液为无菌DEPC水。洗脱液的pH值为7.5;
8)将六个离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管,即获得样本中的病原体核酸;
9)将上述六个核酸提取产物用于荧光PCR扩增检定提取结果,如下表和附图3所示:
表3
Figure RE-GDA0002538924750000091
结论:采用实施例3成功从咽拭子中提取到了肠道病毒71型核酸RNA,六个样本处理液的PCR检测结果曲线均呈明显S型,且重复性好(CV值小于 1%),说明提取过程均一性较好。
实施例4:
1)取临床PCR检定为流感病毒感染患者的一新鲜咽拭子样本于1.5ml 离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和浓度为40 mg/ml的蛋白酶处理液20ul,震荡混匀1min,56℃水浴静置10min;
2)取六份各50ul上述样本处理液于六个1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头分别向六个离心管中加入250ul裂解液、250ul异丙醇和200mg/ml 的纳米磁珠20ul,震荡混匀1min,室温静置10min;其中,裂解液内加入的成分分别是:浓度3.5mM的异硫氰酸胍、浓度150mM的柠檬酸和7%Tween 20,其余成分为水;裂解液的pH值为5.5;
3)将六个离心管置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
4)从磁力架上取出离心管,使用无菌移液枪头向六个离心管中加入800ul 洗涤液,将六个离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;其中,洗涤液内加入的成分分别是:pH 8.5且浓度4mM的Tris-HCL、浓度40mM NaCL和70%的无水乙醇,其余成分为水;
5)重复步骤4)一次;
6)从磁力架上取出离心管,室温开盖干燥15min直至管内无液体残留。
7)使用无菌移液枪头分别向六个离心管中加入100ul洗脱液,56℃水浴 10min;其中,洗脱液为无菌DEPC水;洗脱液的pH值为9.0;
8)将六个离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管,即获得样本中的病原体核酸;
9)将上述六个核酸提取产物用于荧光PCR扩增检定提取结果,如下表和附图4所示:
表4
Figure RE-GDA0002538924750000101
Figure RE-GDA0002538924750000111
结论:采用实施例4成功从咽拭子中提取到了流感病毒核酸RNA,六个样本处理液的PCR检测结果曲线均呈明显S型,且重复性好(CV值小于1%),说明提取过程均一性较好。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,其特征在于:所述试剂盒包括蛋白酶处理液、裂解液、纳米磁珠、洗涤液和洗脱液;利用该试剂盒进行病原体核酸提取的方法如下:
步骤S1:取一新鲜咽拭子样本于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul生理盐水和10-40ul蛋白酶处理液,震荡混匀1min,56℃水浴静置10min;
步骤S2:取50-200ul步骤S1中的样本处理液于1.5ml离心管中,使用无菌移液枪头向该离心管中加入75-300ul裂解液、75-300ul异丙醇和纳米磁珠5-20ul,震荡混匀1min,室温静置10min;
步骤S3:将步骤S2中的离心管置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
步骤S4:使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入300-800ul洗涤液,将该离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸弃上清溶液;
步骤S5:重复步骤S4一次;
步骤S6:室温开盖干燥5-20min直至管内无液体残留;
步骤S7:使用无菌移液枪头向步骤S6离心管中加入100-200ul洗脱液,56℃水浴5-10min;
步骤S8:将步骤S7离心管震荡混匀1min,置于磁力架上30s,待纳米磁珠完全吸至管壁之后,使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管,即获得样本中的病原体核酸。
2.根据权利要求1所述的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,其特征在于:步骤S1中所述的蛋白酶处理液浓度为10-200mg/ml。
3.根据权利要求2所述的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,其特征在于:所述蛋白酶处理液包括蛋白酶K,且蛋白酶K浓度为10-50mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,其特征在于:所述裂解液包括异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸、Tween20,其中异硫氰酸胍浓度为3-5mM,碘化锂浓度为1-5M,柠檬酸三钠浓度为50-200mM,Tween 20浓度为1%-5%,所述裂解液pH值为4.0-7.0。
5.根据权利要求1所述的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,其特征在于:步骤S2中所述的纳米磁珠添加浓度为50-200mg/ml。
6.根据权利要求5所述的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,其特征在于:所述纳米磁珠为包裹有二氧化硅的Fe3O4,所述纳米磁珠直径为200-2000nm,浓度为50-200mg/ml。
7.根据权利要求1所述的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,其特征在于:所述洗涤液包括Tris-HCL、NaCL和无水乙醇,所述Tris-HC的pH为6.5-8.5,浓度为1-5mM,所述NaCL浓度为10-50mM,所述无水乙醇浓度为40%-80%。
8.根据权利要求1所述的一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法,其特征在于:所述洗脱液为无菌DEPC水,pH值为7.0-9.0。
CN202010438066.4A 2020-05-21 2020-05-21 一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法 Pending CN111534510A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010438066.4A CN111534510A (zh) 2020-05-21 2020-05-21 一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010438066.4A CN111534510A (zh) 2020-05-21 2020-05-21 一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111534510A true CN111534510A (zh) 2020-08-14

Family

ID=71979514

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010438066.4A Pending CN111534510A (zh) 2020-05-21 2020-05-21 一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111534510A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996108A (zh) * 2020-09-03 2020-11-27 北京橡鑫生物科技有限公司 移液器枪头、包含其的试剂盒及dna提取方法
CN114457069A (zh) * 2022-03-07 2022-05-10 江苏迅睿生物技术有限公司 一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒及使用方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010102460A1 (zh) * 2009-03-10 2010-09-16 东北制药总厂 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒
CN103614371A (zh) * 2013-11-21 2014-03-05 安徽华卫集团禽业有限公司 一种同时提取血清、双拭子中动物dna病毒和rna病毒核酸的方法
CN103820431A (zh) * 2014-02-25 2014-05-28 苏州天隆生物科技有限公司 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒
CN106867992A (zh) * 2017-01-11 2017-06-20 上海芯超生物科技有限公司 一种全血dna提取试剂盒及提取方法
CN109022417A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 益善生物技术股份有限公司 一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法
CN109913447A (zh) * 2019-04-04 2019-06-21 深圳市南科征途有限公司 游离dna提取富集试剂盒及游离dna提取方法
CN110628762A (zh) * 2019-10-14 2019-12-31 杭州同创越诚基因科技有限公司 一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010102460A1 (zh) * 2009-03-10 2010-09-16 东北制药总厂 定性定量检测病原微生物遗传物质的方法及其试剂盒
CN103614371A (zh) * 2013-11-21 2014-03-05 安徽华卫集团禽业有限公司 一种同时提取血清、双拭子中动物dna病毒和rna病毒核酸的方法
CN103820431A (zh) * 2014-02-25 2014-05-28 苏州天隆生物科技有限公司 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒
CN106867992A (zh) * 2017-01-11 2017-06-20 上海芯超生物科技有限公司 一种全血dna提取试剂盒及提取方法
CN109022417A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 益善生物技术股份有限公司 一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法
CN109913447A (zh) * 2019-04-04 2019-06-21 深圳市南科征途有限公司 游离dna提取富集试剂盒及游离dna提取方法
CN110628762A (zh) * 2019-10-14 2019-12-31 杭州同创越诚基因科技有限公司 一种基于纳米磁珠的核酸提取方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
蒋小丽主编: "《临床医学检验技术与实践操作》", 31 March 2020, 河南大学出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996108A (zh) * 2020-09-03 2020-11-27 北京橡鑫生物科技有限公司 移液器枪头、包含其的试剂盒及dna提取方法
CN114457069A (zh) * 2022-03-07 2022-05-10 江苏迅睿生物技术有限公司 一种磁珠法病原体核酸提取试剂盒及使用方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103820431B (zh) 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒
JP6793709B2 (ja) 目的の核酸の特異的な単離方法
CN111534510A (zh) 一种咽拭子样本中病原体核酸提取试剂盒及提取方法
CN109402240A9 (zh) 核酸释放剂、核酸pcr扩增方法和pcr扩增试剂盒
CN104673783A (zh) 磁珠法提取病毒dna/rna的试剂盒以及使用方法
WO2021164396A1 (zh) 一种基于玻纤滤纸的病毒核酸提取方法
CN112899266A (zh) 一种核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用
EP3904532A1 (en) Nucleic acid extraction composition, reagent and kit containing the same and use thereof
CN111088319A (zh) 一种灭活型病毒样本rna保存液及其制备方法
CN112251492A (zh) 一种提取病毒核酸的试剂盒和提取方法
CN105695450A (zh) 基于磁珠法提取游离dna的试剂盒及其使用方法
CN102796727B (zh) ***核酸提取方法
CN111996190A (zh) 一种全血基因组dna提取试剂盒
CN106867992A (zh) 一种全血dna提取试剂盒及提取方法
CN111057705A (zh) 一种提取游离核酸的试剂盒及使用方法
CN111041024A (zh) 一种核酸提取试剂盒及提取核酸的方法
CN102911932A (zh) 一种同时提取和纯化rna和dna的试剂盒及方法
CN106701740A (zh) 一种基因组dna提取试剂盒及提取方法
CN103789277A (zh) 一种包含hcv和hiv核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法
CN112626067A (zh) 一种病毒rna快速提取的方法和试剂盒
CN109402239A (zh) 一种用于实时荧光定量pcr的免提取直接扩增试剂及其应用
CN115637267A (zh) 一种核酸的提取试剂及其试剂盒和提取方法
WO2023109031A1 (zh) 一种呼吸道病原体检测试剂盒及其制备方法与应用
CN112501162A (zh) 一种用纳米磁珠提取新冠病毒rna的试剂盒及提取方法
CN108179172B (zh) 一种牛支原体药敏快速检测试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200814