CN111518186A - 植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用 - Google Patents

植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用 Download PDF

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plant salt
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杨瑞娟
刘文文
张晓伟
曹英萍
白史且
周传恩
吴振映
王亚梅
姜珊珊
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    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
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Abstract

本发明涉及一种植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用，属于植物基因工程技术领域，植物抗盐蛋白MsVNI1氨基酸序列SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明对植物抗盐蛋白MsVNI1进行分子调控，能够显著增加拟南芥的耐盐品质，提高紫花苜蓿叶片大小。对于牧草及其他作物生物量和抗逆性的遗传改良具有重要的参考意义。

Description

植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为多年生豆科牧草，是我国种植面积最广泛的牧草品种。因其产量高、营养品质高，且适口性强，被誉为“牧草之王”，在我国畜牧业发展中起着重要的作用。此外，紫花苜蓿根系非常发达，具有较强的非生物胁迫抗性。随着紫花苜蓿大面积栽培和集约化生产，对于优质高抗高产的新苜蓿品种需求也日趋急迫。利用基因工程手段进行苜蓿品质改良，能够更快速的培育出优质、高产、高抗逆性的苜蓿品种，推动牧草畜牧业发展。
土地盐渍化是一个困扰中国乃至世界的普遍性难题，全世界约有10亿hm2的盐渍化土地，其中中国约占1/10，沿海地带土地盐碱化程度最高，已经成为影响农业生产的重要因素。近年来对植物耐盐能力的研究已经逐渐成为全球关注的热点。本着“不与民争粮，不与粮争地”的原则，通过遗传改良将耐盐性较强的牧草施用于盐碱地改良，将实现节约耕地面积和提高盐碱地区畜牧业发展的双重目标。
转录因子位于基因表达调控的上游，往往可以实现多个性状的共同调控，使之成为植物多性状调控的候选靶标之一。拟南芥的研究中发现
VND-INTERACTING1和2(VNI1/2)是与VND7(VASCULAR-RELATED NAC-DOMAINPROTEIN 7)互作的NAC转录因子，其中，VNI1的研究鲜有报道(Yamaguchi et al,VND-INTERACTING2,a NAC domain transcription factor,negatively regulates xylemvessel formation in Arabidopsis.Plant Cell,22:1249-1263)。NAC蛋白家族是植物特异性的转录因子超家族，在植物生长发育、代谢调控和逆境胁迫等生物过程中均发挥着重要作用。目前，在改良植物耐盐性能的研究中，大多数基因不能够同时满足耐盐和保重植株产量的双重需求。因此，利用现代生物学的方法研究紫花苜蓿MsVNI1的基因功能，为提高紫花苜蓿耐盐性能、保证作物产量提供可能。
发明内容
针对背景技术中植物耐盐领域中的技术需求，本发明的目的在于提供一种植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用，解决目前植物耐盐基因资源库不足，不能同时满足改良植株产量和品质分子设计的需要的问题。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种植物抗盐蛋白MsVNI1，其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供编码植物抗盐蛋白MsVNI1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供含有植物抗盐蛋白MsVNI1基因的重组载体
pCABIA1300-MsVNI1-cGFP。
本发明还提供所述重组载体在调控植物耐盐性能及叶片大小方面的应用。
本发明的还提供一种提高植物体内植物抗盐蛋白MsVNI1表达水平的方法，所述方法利用MsVNI1基因全长序列构建过量表达载体，提高拟南芥和紫花苜蓿体内MsVNI1表达水平。
本发明还提供植物抗盐蛋白MsVNI1在调控植物耐盐性能及叶片大小方面的应用。
所述应用方法为获得植物抗盐蛋白MsVNI1基因的CDS区序列，根据已完成基因组测序的苜蓿品种蒺藜苜蓿设计植物抗盐蛋白MsVNI1两侧扩增引物MsVNI1-F和MsVNI1-R。将扩增得到的片段进行测序后得到植物抗盐蛋白MsVNI1全长序列1074bp；进一步，将得到的全长序列片段，基于Gateway技术重组整合到表达载体pEG100中；采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，转入植物中，通过草铵膦抗性筛选，获得抗性再生植株。通过PCR分析最终确定阳性转基因植株；拟南芥种子萌发实验表明，转基因植株耐盐能力提高；紫花苜蓿转基因植株稍过量表达水平植株叶片变大。
本发明的核心特点和发明理念包括：
1、本发明利用基因工程的手段，通过过量表达技术提高植物抗盐蛋白MsVNI1在紫花苜蓿体内的表达水平，能够在短期内获得显著效果；
2、本发明从调控植株耐盐及多种性状的基因着手，在保证作物产量的同时，分析紫花苜蓿基因盐胁迫的调控机制，为植物耐盐资源提供更多基因资源。
本发明与现有技术相比的有益效果如下：
1、本发明中获得植物抗盐蛋白MsVNI1基因是调控苜蓿耐盐品质的关键基因，这对于通过分子育种手段获得高转化效率的植株具有重要意义；
2、本发明中对植物抗盐蛋白MsVNI1进行分子调控，能够显著增加拟南芥的耐盐品质，提高紫花苜蓿叶片大小。对于牧草及其他作物生物量和抗逆性的遗传改良具有重要的参考意义；
3、本发明中所产生的遗传改良植物能够整合到常规育种项目，从而为牧草作物的品种培育提供新的种质资源。
附图说明
图1紫花苜蓿中的植物抗盐蛋白MsVNI1克隆电泳图。
图2紫花苜蓿中的植物抗盐蛋白MsVNI1与蒺藜苜蓿同源基因MtVNI1序列比对图。
图3紫花苜蓿pEG100-MsVNI1-OE表达载体图。
图4MsVNI1-OE转基因拟南芥和野生型植株中MsVNI1基因定量PCR结果。
图5MsVNI1-OE转基因拟南芥和野生型植株盐胁迫处理种子萌发率统计图。
图6MsVNI1-OE转基因紫花苜蓿和野生型植株中MsVNI1基因定量PCR结果。
图7MsVNI1-OE转基因紫花苜蓿植株表型及叶片大小表型图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所用的材料、试剂和分子标记探针等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购买。
实施例1：MsVNI1基因的克隆
根据紫花苜蓿同源性较高的基因组测序品种蒺藜苜蓿MtVNI1全长序列两侧设计引物：MsVNI1-F和MsVNI1-R，以紫花苜蓿的cDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。
所述引物序列如下：
MsVNI1-F：CCCTTCCGTGCTTCATA
MsVNI1-R：CTCAAATAAATCAGCCATCA
PCR反应体系为：2μL cDNA，5μL 10×Buffer，4μL 2.5mMdNTP，10μM的正/反向引物各1μL，0.5μL 5U/μLTaq酶和36.5μL ddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：94℃5min；94℃30sec，56℃45sec；72℃2min，34个循环；72℃10min。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到片段大小为1544bp的片段(图1)，对扩增片段进行凝胶回收(使用Promega凝胶回收试剂盒)，常规测序(北京六合华大基因科技有限公司)，测序结果显示，紫花苜蓿MsVNI1与蒺藜苜蓿同源基因差异较小，基因全长均为1074bp且存在8个碱基的差异，如图2所示。
实施例2：重组载体构建及在烟草细胞中瞬时表达观察亚细胞定位
以上述得到的序列片段为模板，设计MsVNI1带有与表达载体pCABIA1300-cGFPInfusion的接头引物，用高保真酶扩增该片段；用限制性内切酶BamHⅠ酶切表达载体pCABIA1300-cGFP。回收MsVNI1基因片段和pCABIA1300-cGFP载体片段。再利用Infusion酶(购自Vazyme公司)将回收的两个片段进行同源重组连接。连接产物用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加600μL液体LB培养基，孵育1h，涂于卡纳抗生素的LB平板上，37℃培养14h。挑取单克隆菌落，在含有卡纳霉素的液体LB培养基中扩增培养，进行PCR扩增检测和测序验证，得到重组质粒pCABIA1300-MsVNI1-cGFP。
将构建成功的重组载体pCABIA1300-MsVNI1-cGFP转化到农杆菌EHA105中并保存菌种。将上述菌种在YEP液体配培养基(含50mg/mL卡纳霉素，50mg/mL利福平)摇菌过夜到OD600达到1.0-1.5。室温4000rpm离心6min，弃上清，用重悬液(10mM MgCL2)将菌液调至OD600为0.9-1.1。加入200μM AS室温孵育菌体1～2h后注射烟草。将侵染液转入5mL注射器内，用拇指按压注射器反板将液体从叶片下表皮注射到烟草叶片内。转化后的烟草植株重新放回培养室培养，补足水分。将烟草培养36-48h后，剪下转化叶片在激光共聚焦显微镜下观察荧光表达情况。显示带有绿色荧光蛋白标签的MsVNI1蛋白在烟草细胞核上的定位，示经DAPI染色后的烟草细胞核定位，目的蛋白与DAPI染色的细胞核定位完全重叠；所以说MsVNI1蛋白主要在细胞核内表达，符合转录因子特性。
实施例3：过量表达MsVNI1转基因拟南芥植物的获得
设计过量表达载体中连接入门载体引物：MsVNI1-OE-F和MsVNI1-OE-R，引物末端引入BamHⅠ酶切位点和入门载体pENTRE酶切位点后9个碱基(Infusion接头序列)，以得到的MsVNI1全长序列为模板，用上述引物进行PCR扩增。
所述引物序列如下：
MsVNI1-OE-F：TCCTTCACCCGGGATCCATGGCCGAAACAAAATTGAT
MsVNI1-OE-R：ACCCTTTATCGGGATCCCAGCCATCATGTTTAGTCT
其中，下划线为Infusion接头序列。
回收上述扩增片段。用限制性内切酶BamHⅠ酶切pENTRE载体，并回收。将上述两个片段连接并转化大肠杆菌，得到入门重组载体的阳性克隆并提取质粒。EcoR V核酸内切酶37℃酶切1h，最后通过Gateway技术将目的片段重组到pEG100载体上(图3)。重组反应为：100ng酶切回收片段，50ng pEG100载体质粒，1μL LR酶(Invitrogen，货号11791020)，补齐水至10μL。25℃培养6h。转化大肠杆菌并得到测序正确的阳性重组菌株质粒pEG100-MsVNI1-OE，转化农杆菌EHA105。
将得到的重组农杆菌接种于200mL YEP培养基(含50mg/mL卡纳霉素，50mg/mL利福平)中，过夜培养。收集菌体，室温4000rpm离心10min，用含有10％的蔗糖MS液体培养基稀释OD600为0.9-1.1。使用浸花法转化拟南芥(Col-0)，浸泡5分钟后，用黑色塑料袋遮光24h后正常培养，收取T1代种子，用50μg/L的草甘膦筛选阳性植株。T1代为T1代自交产生的种子及生长的植株，T3代为T2代自交产生的种子及长成的植株。从阳性T3代植株中筛选得到的转基因植株MsVNI1-OE-A、MsVNI1-OE-B和MsVNI1-OE-C作为纯合转基因株系，进行过表达鉴定。
选取阳性植株，用TriZol Reagent试剂盒(Invitrogen公司，货号15596026)提取叶片总RNA，琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪(NanoDrop)检测总RNA的含量和纯度，取1.0μg总RNA做逆转录反应，采用逆转录酶(Promega公司，货号M1701)反转为cDNA，逆转录反应步骤参考该使用说明。以上述cDNA为模板，使用引物MsVNI1-ORF-QF和MsVNI1-ORF-QR进行荧光定量PCR检测，内参基因为拟南芥Actin基因。引物序列如下：
AtActin-F：GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG
AtActin-R：AACGACCTTAATCTTCATGCTGC
MsVNI1-ORF-QF：AAAGACTGGGATAGCGAAGA
MsVNI1-ORF-QR：CCTGGAGCTGAAGGGTGT
实时荧光定量PCR反应体系为20μL，其中正/反向引物各1μL，cDNA模板2μL，SYBRGreen qRT Master Mix(购自宝生物工程有限公司)10μL，ddH2O补足至20μL。实时荧光定量PCR仪使用Roche480，使用两步法反应。检测结果表明，于野生型col-0相比，转基因植株MsVNI1-OE-A、MsVNI1-OE-B和MsVNI1-OE-C中MsVNI1的表达量均显著上升(图4)。
实施例4：过量表达MsVNI1转基因拟南芥抗盐能力检测
将经实例3的荧光定量PCR鉴定分析结果均为阳性且MsVNI1表达上调的T3代转基因植株MsVNI1-OE-A、MsVNI1-OE-B和MsVNI1-OE-C分别在含有0mM、50mM、100mM、130mM和150mM NaCL的1/2MS固体培养基上进行种子萌发的耐盐实验，每个株系单个处理萌发99棵种子。实验结果显示，随着盐浓度的升高，野生型拟南芥萌发率显著下降，当盐浓度达到130mM时，野生型拟南芥萌发率为44.44％，而转基因植株的萌发率随盐浓度的升高变化差异较小，当盐浓度达到130mM时，3个转基因株系种子萌发率均在80％以上。此外，当盐浓度达到150mM时，野生型植株与转基因植株均不发芽(图5)。
综上，通过上述转基因，将MsVNI1转化到植株中可显著增强植株抗盐能力。
实施例5：过量表达MsVNI1转基因紫花苜蓿植物的获得
将实例3中得到的的阳性重组菌株质粒pEG100-MsVNI1-OE转化的农杆菌EHA105接种于50mL YEP培养基(含50mg/mL卡纳霉素，50mg/mL利福平)中，过夜培养摇至OD600为0.6-0.8。收集菌体，室温4000rpm离心10min，用转化液(含有200μM AS的SH3a培养液)重悬菌体，孵育2h，最终稀释至OD600为0.2-0.3。取紫花苜蓿新鲜幼嫩叶片用0.5％次氯酸钠消毒，将消毒后的叶片剪至1cm2左右大小，倒入制备好的菌液，超声15min，倒掉菌液，将叶片摆放于共培养培养基(SH3a+100μM AS)上，黑暗培养至少24h。将共培养后的转化叶片转移至筛选培养基上，黑暗培养，诱导愈伤。将诱导的愈伤转移至分化培养基，约1-2周出现绿色芽点后转至SH9分化培养基。获得抗性苗经阳性鉴定后进行过量表达鉴定。
取转基因阳性植株嫩叶组织，按照实例3中的方法进行植株总RNA提取和逆转录，得到紫花苜蓿cDNA。以上述cDNA为模板，使用引物MsVNI1-ORF-QF和MsVNI1-ORF-QR进行荧光定量PCR检测，内参基因为紫花苜蓿Actin基因。引物序列如下：
MsActin-F：CCCACTGGATGTCTGTAGGT
MsActin-R：AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA
实时荧光定量PCR反应体系与方法如实例3所述。检测结果表明，于野生型紫花苜蓿相比，转基因植株MsVNI1-OE-10/14/17/1/11/15中MsVNI1的表达量均显著上升(图6)。
实施例6：过量表达MsVNI1转基因紫花苜蓿的表型
将经实例5中的荧光定量PCR鉴定分析结果均为阳性且MsVNI1表达上调的转基因植株MsVNI1-OE-10/14/17/1/11/15植株分别按照其表达水平与相对应的表型进行分组(图7)。结果显示，当转基因植株MsVNI1表达量为野生型的2-5倍时(MsVNI1-OE-10/14/17)，植株出现叶片变大的表型。而当转基因植株MsVNI1表达量为野生型的10倍以上时，植株出现叶片变小的表型。
综上，在植株中稍过量表达MsVNI1时，植株出现叶片变大的表型，这一性状对植株生产具有重要意义。
序列表
<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120> 植物抗盐蛋白MsVNI1及编码基因和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1074
<212> DNA
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)
<400> 1
atggccgaaa caaaattgat gattccaggg tttcgttttc accccactga tgttgagctg 60
gtaatgtatt ttctcaagag gaagattttg ggtagaaaat tcccttttca tgtcattgct 120
gaacttgaca tttacaagta tgctccatgg gatctaccag aaaaatcttt gctcaagagt 180
ggtgatttgc aatggtactt ctttacccct gtcggaaaga aatattgcac gggagggagg 240
atgaatcggg caacagaagt aggctactgg aagactacag ggaaggatag gtcgattgaa 300
cataggaatc aagtggtggg gatgataaga accctggtgt ttcacactgg caaagctcct 360
aaaggagacc gaactgattg ggttatgcat gaatacagac ttgaaaacaa agacctagct 420
gacaatggtg ttccacagaa ctcctatgtg atttgtaggg tatttcaaaa ggaaggtcct 480
ggtcccagga atggtgcaca gtatggaaaa ccatttaatg agaaagactg ggatagcgaa 540
gaggaaattg attatgtaca agctgtccct gttgctgctg tgtctgcacc agctctcatt 600
ctacctagct caagccatat ttctgaagaa aatgatatgc atacctctgc aaggggatgc 660
actggacaga cctctttatc aggtctatca agattgatgc cctctggcac gacacaccct 720
tcagctccag gcaatcaagc tgatgatgac attttatcca tgcttgctat ctttgacgat 780
gaaaatgcat tggctgggaa tgaaaacaat ggatctgaga aggtcgataa tcctggtcag 840
gcaaacaatg ctgaagatgt accttattta atttcaaatg agatttttga ggacttggga 900
gatctcaaca gcttggttgg attagatgaa ggaggcggtt tttcctatgg ccaaaaagat 960
gagtacgaaa agctttctac tggcaacgtc tctttgtttt gcaacccccc tgatttcttt 1020
gagttgcttg acctagaggt gccattatct tggcagacta aacatgatgg ctga 1074
<210> 2
<211> 357
<212> PRT
<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa L.)
<400> 2
Met Ala Glu Thr Lys Leu Met Ile Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr
1 5 10 15
Asp Val Glu Leu Val Met Tyr Phe Leu Lys Arg Lys Ile Leu Gly Arg
20 25 30
Lys Phe Pro Phe Asn Val Ile Asp Glu Leu Asp Ile Tyr Lys Tyr Ala
35 40 45
Pro Trp Asp Leu Pro Glu Lys Ser Leu Leu Lys Ser Gly Asp Leu Gln
50 55 60
Trp Tyr Phe Phe Thr Pro Val Gly Lys Lys Tyr Cys Thr Gly Gly Arg
65 70 75 80
Met Asn Arg Ala Thr Glu Val Gly Tyr Trp Lys Thr Thr Gly Lys Asp
85 90 95
Arg Ser Ile Glu His Arg Asn Gln Val Val Gly Met Ile Arg Thr Leu
100 105 110
Val Phe His Thr Gly Lys Ala Pro Lys Gly Asp Arg Thr Asp Trp Val
115 120 125
Met His Glu Tyr Arg Leu Glu Asn Lys Asp Leu Ala Asp Asn Gly Val
130 135 140
Pro Gln Asn Ser Tyr Val Ile Cys Arg Val Phe Gln Lys Glu Gly Pro
145 150 155 160
Gly Pro Arg Asn Gly Ala Gln Tyr Gly Lys Pro Phe Asn Glu Lys Asp
165 170 175
Trp Asp Ser Glu Glu Glu Ile Asp Tyr Val Gln Ala Val Pro Val Ala
180 185 190
Ala Val Ser Ala Pro Ala Leu Ile Leu Pro Ser Ser Ser His Ile Ser
195 200 205
Glu Glu Asn Asp Met His Thr Ser Ala Arg Gly Cys Thr Gly Gln Thr
210 215 220
Ser Leu Ser Gly Leu Ser Arg Leu Met Pro Ser Gly Thr Thr His Pro
225 230 235 240
Ser Ala Pro Gly Asn Gln Ala Asp Asp Asp Ile Leu Ser Met Leu Ala
245 250 255
Ile Phe Asp Asp Glu Asn Ala Leu Ala Gly Asn Glu Asn Asn Gly Ser
260 265 270
Glu Lys Val Asp Asn Pro Gly Gln Ala Asn Asn Ala Glu Asp Val Pro
275 280 285
Tyr Leu Ile Pro Asn Glu Ile Phe Glu Asp Leu Gly Asp Leu Asn Ser
290 295 300
Leu Val Gly Leu Asp Glu Gly Gly Gly Phe Ser Tyr Gly Gln Lys Asp
305 310 315 320
Glu Tyr Glu Arg Leu Ser Thr Gly Asn Val Ser Leu Phe Cys Asn Pro
325 330 335
Pro Asp Phe Phe Glu Leu Leu Asp Leu Glu Val Pro Leu Ser Trp Gln
340 345 350
Thr Lys His Asp Gly
355
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccttccgtg cttcata 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcaaataaa tcagccatca 20
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccttcaccc gggatccatg gccgaaacaa aattgat 37
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accctttatc gggatcccag ccatcatgtt tagtct 36
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtaacattg tgctcagtgg tgg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacgacctta atcttcatgc tgc 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaagactggg atagcgaaga 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctggagctg aagggtgt 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccactggat gtctgtaggt 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaattaagt agcagcgcaa a 21

Claims (6)

1.一种植物抗盐蛋白MsVNI1，其特征在于其氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述植物抗盐蛋白MsVNI1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.含有权利要求2所述植物抗盐蛋白MsVNI1基因的重组载体pCABIA1300-MsVNI1-cGFP。
4.权利要求3所述重组载体在调控植物耐盐性能及叶片大小方面的应用。
5.一种提高植物体内植物抗盐蛋白MsVNI1表达水平的方法，所述方法利用权利要求1所述的MsVNI1基因全长序列构建过量表达载体，提高拟南芥和紫花苜蓿体内MsVNI1表达水平。
6.权利要求1所述植物抗盐蛋白MsVNI1在调控植物耐盐性能及叶片大小方面的应用，方法为获得植物抗盐蛋白MsVNI1基因的CDS区序列，根据已完成基因组测序的苜蓿品种蒺藜苜蓿设计植物抗盐蛋白MsVNI1两侧扩增引物MsVNI1-F和MsVNI1-R，将扩增得到的片段进行测序后得到植物抗盐蛋白MsVNI1全长序列1074bp；将得到的全长序列片段，基于Gateway技术重组整合到表达载体pEG100中；采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，转入植物中，通过草铵膦抗性筛选，获得抗性再生植株。
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