CN111511394B - 具有益生菌特性的活减毒霍乱疫苗 - Google Patents

Abstract

本文提供基因工程化的霍乱弧菌细菌菌株，包括该细菌菌株的组合物，以及将其用于在受试者中预防霍乱弧菌感染的方法。

Description

具有益生菌特性的活减毒霍乱疫苗

联邦政府资助的研究或开发

本发明由美国国立卫生研究院授予的资助号AI042347和AI-120665在政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2017年7月12日提交的美国申请No.62/531,551以及2018年6月4日提交的美国申请No.62/680,286的权益。上述申请各自的内容均通过引用整体并入本文。

技术领域

本文描述的为基因工程化的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)细菌，包括该细菌的药物组合物，以及使用该细菌和/或包括该细菌的药物组合物通过快速益生菌保护(probiotic protection)并且诱导适应性免疫应答的组合来预防由霍乱弧菌的毒力菌株引起的疾病的方法。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2018年7月10日，命名为29618-0175WO1_SL.txt，并且大小为5.03兆字节。

背景技术

霍乱是由革兰氏阴性菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)感染引起的腹泻病。该疾病可以是迅速致命的，而且疫情往往呈爆发性传播。抵抗疾病的努力包括口服补液和抗生素治疗。然而，该疾病是发展中国家和不稳定国家中的主要公共健康危害(参见，例如，Bohles等人(2014)Hum.Vaccin.Immunother.10(6)：1522-35)。目前正在开展疫苗接种活动，部署包含已灭活的霍乱弧菌细菌菌株的疫苗。但是，利用这些疫苗减少正在进行的流行病的扩散(所谓的“反应性疫苗接种”)取决于疫苗接种受试者对霍乱产生抵抗力所需的时间。当前疫苗引发的保护性免疫应答通常需要数天或数周才能显现出来，并且通常需要多重疫苗剂量。因此，需要可以在单剂量后诱导针对霍乱弧菌的快速保护的疫苗。

发明内容

本文描述的为减毒霍乱弧菌细菌菌株，其以前所未有的方式作为益生菌剂，以快速预防霍乱，并作为传统疫苗，以引发在现有霍乱疫苗中观察到的对霍乱的长期保护性免疫。本文所述的减毒霍乱弧菌细菌菌株，如HaitiV，来自最近的临床分离菌株，包括多种遗传修饰，并表现出稳健的、多日的肠道占有率，其暗示/预测了它们可能使人类产生对霍乱的长期免疫力。令人惊讶地，在霍乱的幼兔模型中，在施用HaitiV后24小时内，单次剂量的减毒细菌菌株能够赋予针对致命性攻击的保护。在幼仔感染模型中观察到的这种快速保护与由传统疫苗引起的保护性免疫不一致。相反，活HaitiV快速介导定殖抗性和针对多种攻击菌株的疾病保护的能力表明HaitiV与现有疫苗不同，其赋予了针对霍乱的益生菌保护。此外，数学建模表明，HaitiV介导的保护的前所未有的速度可以大大提高反应性疫苗接种的公共健康影响。因此，本文所述的细菌菌株的施用可通过产生快速和长期的保护而用于降低霍乱感染的风险，特别是在正在进行的流行期间。

此外，减毒霍乱弧菌细菌菌株可以通过重新获得毒力基因(virulence gene)以诱导逆转为毒力菌株(virulent strain)，并且还提供了防止和/或减轻HaitiV转化为产毒性的可能性的方法。特别令人担忧的是编码作为病原体的主要腹泻因子的霍乱毒素的基因，其从活霍乱疫苗中缺失。水平基因转移的任何方法，包括通过编码霍乱毒素的噬菌体(CTXΦ)的再感染或自然转化，都足以诱导疫苗转化。申请人已经开发了减毒霍乱弧菌细菌菌株，其被修饰以包括能够特异性靶向ctxA基因的RNA指导的核酸内切酶***，所述ctxA基因编码霍乱毒素的活性亚基。该策略提供了一种生物安全机制，通过包括由CTXΦ噬菌体感染的任何方式防止霍乱弧菌细菌重新获得ctxA。此外，该策略可通过对菌株进行工程化以从质粒编码的或染色体整合的构建体中产生抗毒力因子(anti-virulence factor)CRISPR***，推广到其他减毒疫苗株(例如Vaxchora和Peru-15)中。

一方面，本发明提供一种基因工程化的霍乱弧菌细菌，其在编码霍乱毒素亚基A的核酸序列中具有缺失；编码Cas9核酸酶分子的异源核酸序列；和编码指导RNA(gRNA)的异源核酸序列，其中所述gRNA包含与ctxA的靶核酸序列互补的靶向结构域。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码霍乱毒素亚基A的核酸序列中具有缺失，所述缺失位于整合至细菌基因组的ctxA基因中。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在整合至细菌基因组中的CTXΦ基因组的核心区域的核酸序列中具有缺失。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在整合至细菌基因组中的CTXΦ基因组的RS2区的核酸序列中具有缺失。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌在整合至细菌基因组的CTXΦ基因组中具有完全缺失。

在另一方面，本公开提供一种基因工程化的霍乱弧菌，其具有编码Cas9核酸酶分子的异源核酸序列；和编码指导RNA(gRNA)的异源核酸序列，其中所述gRNA包含与CTXΦ的靶核酸序列互补的靶向结构域。

在一些实施方案中，CTXΦ基因组的靶核酸序列位于选自由以下组成的组的基因中：rstR、rstA、rstB、psh、cep、orfU、ace、zot、ctxA和ctxB。在一些实施方案中，CTXΦ基因组的靶核酸序列位于ctxA基因中。在一些实施方案中，所述gRNA包含核酸序列5'-cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3'(SEQ ID NO：3)，或由其组成。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌先前没有整合至细菌基因组中的CTXΦ基因组的拷贝。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码多功能自加工毒素重复序列(multifunctional-autoprocessing repeats-in-toxin,MARTX)毒素的核酸序列中具有缺失。在一些实施方案中，编码MARTX毒素的核酸序列选自由以下组成的组：rtxA、rtxB、rtxC、rtxD和rtxE。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码DNA结合蛋白HU-β的核酸序列中具有缺失。在一些实施方案中，编码DNA结合蛋白HU-β的核酸序列是hupB基因。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码鞭毛蛋白的核酸中具有缺失。在一些实施方案中，编码鞭毛蛋白的核酸序列选自由以下组成的组：flaA、flaB、flaC、flaD和FlaE。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌包含异源核酸，其中所述异源核酸包含可操作地连接至启动子的编码霍乱毒素亚基B的基因。在一些实施方案中，编码霍乱毒素亚基B的基因是ctxB基因。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是P_htpg启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码RecA蛋白的核酸序列中具有缺失。在一些实施方案中，编码RecA蛋白的核酸序列是recA基因。

在另一方面，本发明提供一种基因工程化的霍乱弧菌细菌，其在选自由rtxA、rtxB、rtxC、rtxD、rtxE和rtxH组成的组的一种或多种编码MARTX毒素的核酸序列中具有缺失；选自由flaA、flaB、flaC、flaD和FlaE组成的组的一种或多种鞭毛蛋白基因中的缺失；recA基因中的缺失；和异源核酸，其中所述异源核酸包含可操作地连接至启动子(例如组成型启动子或诱导型启动子)的ctxB基因。在一些实施方案中，细菌包含整合至细菌基因组中的CTXΦ基因组的完全缺失。在一些实施方案中，细菌先前没有整合至细菌基因组中的CTXΦ噬菌体基因组的拷贝。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌包含编码Cas9核酸酶分子的异源核酸序列；和编码指导RNA(gRNA)的异源核酸序列，其中所述gRNA包含与ctxA的靶核酸序列互补的靶向结构域。在一些实施方案中，CTXΦ的靶核酸序列位于ctxA基因中。在一些实施方案中，gRNA包含核酸序列5’-cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’(SEQ ID NO：3)，或由其组成。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在以下一种或多种中具有缺失：编码赋予甲氧苄啶抗性的产物的核酸序列、编码赋予磺胺甲噁唑抗性的产物的核酸序列、编码赋予链霉素抗性的产物的核酸序列、和编码赋予氯霉素抗性的产物的核酸序列。在一些实施方案中，编码赋予甲氧苄啶抗性的产物的基因是dfrA。在一些实施方案中，编码赋予磺胺甲噁唑抗性的产物的基因是sul2。在一些实施方案中，编码赋予链霉素抗性的产物的基因是strAB。在一些实施方案中，编码赋予氯霉素抗性的产物的基因是floR。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌源自属于ElTor生物型的亲本菌株。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌源自Haiti亲本菌株。

在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌包含第一细菌染色体，所述第一细菌染色体包含SEQ ID NO：7的核酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌包含第二细菌染色体，所述第二细菌染色体包含SEQID NO：51的核酸序列，或由其组成。

一方面，本公开提供基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌，相对于其亲本菌株(例如，毒力的亲本菌株)，在与具有ATCC保藏号PTA-125138的菌株相同的基因中具有突变。

在另一方面，本公开提供一种基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌是具有ATCC保藏号PTA-125138的霍乱弧菌菌株。

本公开还提供一种药物组合物，其包含本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌和药学上可接受的赋形剂。

本公开还提供一种在受试者中诱导针对霍乱弧菌的毒力菌株的保护性应答的方法，其包括向受试者施用本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌或包含该细菌的药物组合物，从而在受试者(例如，人受试者)中诱导针对霍乱弧菌的毒力菌株的保护性应答。在一些实施方案中，保护性应答在向受试者施用基因工程化的霍乱弧菌细菌或药物组合物的24小时内诱导。

本公开还提供本文提供的基因工程化的霍乱弧菌，其用于在受试者中诱导针对霍乱弧菌的毒力菌株的保护性应答的方法。

还提供本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其用于治疗具有霍乱弧菌的毒力菌株的受试者的方法。

在另一方面，本公开还提供一种基因工程化的细菌，其具有至少一种毒力基因的缺失；编码Cas9核酸酶分子的异源核酸；和一种或多种编码指导RNA(gRNA)的异源核酸，其中所述gRNA包含与缺失的毒力基因的靶核酸序列互补的靶向结构域；其中所述Cas9核酸酶分子能够与所述gRNA结合从而形成复合体，并且其中所述复合体能够靶向并切割所述缺失的毒力基因的核酸序列。在一些实施方案中，细菌是选自由以下组成的组的种：霍乱弧菌、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)，索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)、和艰难梭菌(Clostridioides difficile)。在一些实施方案中，毒力基因选自由以下组成的组：ctxA、aroA、aroQ、aroC、aroD、htrA、ssaV、cya、crp、phoP、phoQ、guaB、guaA、clpX、clpP、set、sen、virG/icsA、luc、aroA、msbB2、stxA、stxB、ampG、dnt、tcdA和tcdB。

本公开还提供一种药物组合物，其包含本文提供的基因工程化的细菌和药学上可接受的赋形剂。

还提供在受试者中诱导针对本文所述的细菌的毒力菌株(例如霍乱弧菌、肠道沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、索氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、百日咳博德特氏菌和艰难梭菌)的保护性应答的方法，其包括向受试者施用本文提供的基因工程化的细菌，或包含所述基因工程化的细菌的药物组合物，从而在受试者(例如，人类受试者)中诱导针对细菌的毒力菌株的保护性应答。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；本领域已知的其他合适的方法和材料也可以使用。所述材料、方法和实例仅是说明性的，而无意于限制。本文提及的所有出版物，专利申请，专利，序列，数据库条目和其他参考文献均通过引用整体并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

根据以下详细描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。

附图说明

图1显示CTXΦ噬菌体及其邻近序列的缺失，所述邻近序列包括卫星噬菌体、TLC和RS1、以及MARTX毒素基因(阴影区域是缺失的区域)。

图2显示赋予对甲氧苄啶(dfrA)、磺胺甲噁唑(sul2)链霉素(strAB)和氯霉素(floR)的抗性的基因的缺失。

图3A、3B和3C显示提供对CTXΦ感染的免疫力的抗ctxA CRISPR***。图3A显示化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9以及编码靶向ctxA的指导RNA的序列，其整合至HaitiV lacZ基因座中。图3B是显示通过抗ctxACas9-sgRNA复合体靶向CTXΦ基因组的示意图。图3C是显示具有/不具有CRISPR***(CRISPR+/-)的HaitiV中的转导效率的柱状图，所述CRISPR***用CTXΦ-IGKn(靶标+；基因间Kan^R盒，完整的ctxA)或CTX-KnΦ(靶标-；ctxA替换为Kan^R盒)两者任一个来转染，并监测转导子(transductant)的数量。未检测到的Kan^R转导子显示为“*”。

图4A，4B，4C，4D和4E显示，HaitiV可以在幼兔肠道内定殖(colonizes)而不会引起霍乱样疾病。图4A是显示同窝出生的幼兔(littermates)在用野生型(“WT”；n＝11)或HaitiV(“疫苗”；n＝10)两者任一个接种后的流体蓄积率(fluid accumulation ratios)的柱状图。该图显示来自2窝的平均值和标准偏差。****P<0.001，未配对t检验。图4B是显示用约10⁹CFU HaitiV(n＝10)接种的动物的连续日体重的线形图。图4C是显示在接种后第1天或第4天(2窝/组)从兔远端小肠(dSI)回收的WT CFU(圆圈)或HaitiV CFU(正方形)的点状图。线条表示几何平均值。空心点表示未回收CFU时的检测极限。NS：P>0.05，先后进行Kruskall-Wallis检验和Dunn的多重比较检验。图4D显示用WT和HaitiV的1：1混合物接种后1天的dSI细菌的竞争指数(CI)。空心点表示未回收疫苗CFU时的检测极限。线条和条形(lines and bars)表示跨2窝的CI的几何平均值和几何标准偏差(n＝6)。图4E是显示从共同接种的动物中回收的WT CFU(圆圈)和HaitiV CFU(正方形)的点状图；线条表示几何平均值。

图5A、5B、5C、5D、5E、5F和5G显示HaitiV介导与可变大小感染瓶颈相关的定殖抗性。图5A显示在用WT接种18小时后从动物的dSI中回收的WTCFU(圆圈)。在WT攻击前24小时，用碳酸氢钠缓冲液(模拟物，n＝8)或***灭活的HaitiV(灭活疫苗，n＝7)预处理同窝出生的幼兔；显示跨3窝中每组的几何平均值。NS：P＞0.05，Mann-Whitney检验。图5B显示用WT攻击18小时后从动物的dSI中回收的WT CFU(圆圈)或HaitiV CFU(正方形)。在攻击前24小时，将动物用灭活疫苗(n＝6)或活疫苗(n＝8)进行预处理。空心点表示未回收CFU时的检测极限，线条表示跨2窝中每组的几何平均值。***P<0.001，Mann-Whitney检验。图5C显示用WT攻击后18小时从动物的dSI中回收的N16961菌株的WT CFU(圆圈)或HaitiV CFU(正方形)。在攻击前24小时，将动物用灭活疫苗(n＝6)或活疫苗(n＝8)进行预处理。空心点表示未回收CFU时的检测极限，线条表示跨2窝中每组的几何平均值。*P<0.05，Mann-Whitney检验。图5D显示在未经预处理的转座子突变体文库接种后一天从单个动物的dSI(兔r1至r6)的dSI中回收的WT CFU(圆圈)和独特的转座子突变体(三角形)。图5F显示在转座子突变体文库接种后一天从个体动物的dSI(兔r1至r7)的dSI中回收的WT CFU(圆圈)、HaitiV CFU(正方形)和独特的转座子突变体(三角形)。在转座子突变体文库攻击之前，将动物用HaitiV预处理24小时。图5E和5G显示针对单接种(兔r4；图5E)和顺序接种(兔r6；图5G)具有最大数量的独特基因型的样品的Con-ARTIST(参见Pritchard等人(2014)PLoS Genet.10:e1004782)分析的结果。x轴表示体内每个基因的***突变体的相对丰度的变化，y轴表示每个基因内独立的***突变体的一致性。在跨多个突变体(平均逆P值(mean inverse P-value)>10²)中表现出大于2倍变化(Log₂(平均倍数变化)<-1或>1)的基因被认为是缺失的/富集的。显示富集的突变体cqsS和hapR。关键定殖因子的突变，包括毒素共同调控菌毛的生物发生(圆圈)，以及相关的转录调节因子toxR和toxS(星号)，均缺失。

图6A、6B、6C和6D显示，在HaitiWT攻击后，HaitiV定殖预防疾病，并且建模显示霍乱爆发期间快速保护的益处。图6A显示在用灭活(黑色)或活疫苗(红色)进行预处理(t＝-24小时)后0小时用WT接种的动物中，追踪濒死疾病状态进展的存活曲线。***P<0.001，对数秩检验。图6B显示在出现可见的腹泻的动物(从图6A)中从腹泻发作到濒死状态的疾病进展。***P<0.001，对数秩检验。图6C显示从没有进展到濒死疾病状态的动物(来自图6A)的dSI中回收的WT CFU(圆圈)。图6D显示从100,000名易感群体中的一次感染开始的模拟暴发(R₀＝2.1)中，反应性疫苗接种对霍乱感染数量的影响，如虚线所示，其中一旦有症状的个体数量达到1000(占总群体的1％)，就会触发反应性疫苗接种活动(reactive vaccinationcampaign,RVC)。如最近的反应性疫苗接种活动所实现的那样，在7天内以恒定的速率对剂量分布进行建模，直到70％的群体接种疫苗为止。建模参数如图10B所述。

图7是显示HaitiV仅产生霍乱毒素的B亚基的蛋白质印迹。来自海地野生型(“海地WT”)和HaitiV的无细胞上清液以及纯化的霍乱毒素(“纯化的CT”)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。用多克隆抗CTX抗体免疫印迹显示HaitiV的上清液中存在CT-B，但不存在CT-A。

图8A、8B、8C和8D显示针对单接种样品的Con-ARTIST分析的结果。x轴表示体内每个基因的***突变体的相对丰度的变化，y轴表示每个基因中独立的***突变体的一致性。在多个突变体(平均逆P值>100)中表现出大于2倍变化(Log₂(平均倍数变化)<-1或>1)的基因被认为是缺失的/富集的。显示cqsS和hapR。还显示定殖因子的子集，包括毒素共调控菌毛的生物发生成分(圆圈)和相关的转录调节因子toxR和toxS(星号)。

图9A、9B、9C和9D显示顺序接种样品的Con-ARTIST分析的结果。x轴表示体内每个基因的***突变体的相对丰度的变化，y轴表示每个基因中独立的***突变体的一致性。在跨多个突变体中显示大于2倍变化(Log₂(平均倍数变化)<-1或>1)的基因被认为是缺失的/富集的(平均逆P值>10²)。显示cqsS和hapR。还显示定殖因子的子集，包括毒素共调控菌毛的生物发生成分(圆圈)和相关的转录调节因子toxR和toxS(星号)。

图10A显示具有延迟疫苗作用的SEIR霍乱传播模型的概况。圆圈表示模型的亚群(易感的，暴露的，感染的，恢复的(Susceptible,Exposed,Infectious,Recovered)，下标U：未接种疫苗的，V：已接种疫苗但尚未受保护的，P：受保护的)，而箭头表示亚群之间的转换。图10B是在建模中使用的参数的列表。

图11A和11B显示疫苗接种活动的传播潜力(R₀)和投放率(rollout rate)(图11A)和触发阈值(图11B)两者任一个对速效疫苗相对于慢效疫苗的相对保护(在某些情况下为分数降低)的影响。

图12A、12B、12C和12D是显示来自用HaitiV或CVD103-HgR*接种的小鼠的血清的杀弧菌活性的图。图12A是显示来自用HaitiV接种的C57BL/6小鼠的血清针对血清型Inaba霍乱弧菌菌株的杀弧菌应答的图。图12B是显示来自用HaitiV(黑色圆圈)和CVD103-HgR*(空正方形和虚线)两者任一个接种的Swiss-Webster小鼠的血清针对血清型Inaba霍乱弧菌菌株的杀弧菌应答的图。图12C是显示来自用HaitiV接种的C57BL/6小鼠的血清针对血清型Ogawa霍乱弧菌菌株的杀弧菌应答的图。图12D是显示来自用HaitiV(黑色圆圈)和CVD103-HgR*(空正方形和虚线)两者任一个接种的Swiss-Webster小鼠血清针对血清型Ogawa霍乱弧菌菌株的杀弧菌应答的图。x轴上方的粗黑点表示对动物进行HaitiV或CVD103-HgR*口胃接种的时间点。沿y轴的虚线表示检测的测定极限。

图13A、图13B、图13C和图13D是显示在用HaitiV或CVD103-HgR*接种的小鼠中针对来自血清型Ogawa霍乱弧菌菌株的O-抗原特异性多糖(OSP)的IgA和IgG应答随时间变化的图。图13A是显示在用HaitiV接种的C57BL/6小鼠中针对来自血清型Ogawa霍乱弧菌菌株的OSP的抗OSP IgA应答的图。图13B是显示在用HaitiV(黑色圆圈)和CVD103-HgR*(空心正方形和虚线)两者任一个接种的Swiss-Webster小鼠中针对来自血清型Ogawa霍乱弧菌菌株的OSP的抗OSP IgA应答的图。图13C是显示在用HaitiV接种的C57BL/6小鼠中针对来自血清型Ogawa霍乱弧菌菌株的OSP的抗OSP IgG应答的图。图13D是显示在用HaitiV(黑色圆圈)和CVD103-HgR*(空心正方形和虚线)两者任一个接种的Swiss-Webster小鼠中针对来自血清型Ogawa霍乱弧菌菌株的OSP的抗OSPIgG应答的图。x轴上方的粗黑点表示对动物进行HaitiV或CVD103-HgR*口胃接种的时间点。

图14A、图14B、图14C和图14D是显示在用HaitiV或CVD103-HgR*接种的小鼠中针对来自血清型Inaba霍乱菌菌株的O-抗原特异性多糖(OSP)的IgA和IgG应答随时间变化的图。图14A是显示在用HaitiV接种的C57BL/6小鼠中针对来自血清型Inaba霍乱弧菌菌株的OSP的抗OSP IgA应答的图。图14B是显示在用HaitiV(黑色圆圈)和CVD103-HgR*(空心正方形和虚线)两者任一个接种的Swiss-Webster小鼠中针对来自血清型Inaba霍乱弧菌菌株的OSP的抗OSP IgA应答的图。图14C是显示在用HaitiV接种的C57BL/6小鼠中针对来自血清型Inaba霍乱弧菌菌株的OSP的抗OSP IgG应答的图。图14D是显示在用HaitiV(黑色圆圈)和CVD103-HgR*(空心正方形和虚线)两者任一个接种的Swiss-Webster小鼠中针对来自血清型Inaba霍乱弧菌菌株的OSP的抗OSP IgG应答的图。x轴上方的粗黑点表示对动物进行HaitiV或CVD103-HgR*口胃接种的时间点。

具体实施方式

基因工程化的细菌

本文提供基因工程化的霍乱弧菌细菌，其可用于在其向受试者施用后24小时内诱导免受毒力霍乱弧菌威胁的保护。用活减毒霍乱弧菌细菌菌株接种疫苗是诱导针对该细菌的保护性免疫应答的有前途的策略。编码霍乱弧菌中主要毒力因子霍乱毒素(CT)的基因(ctxA和ctxB)从许多活减毒霍乱弧菌疫苗候选物中缺失，但由CTXΦ携带，CTXΦ是一种感染霍乱弧菌的丝状噬菌体，将其基因组整合至霍乱弧菌染色体和/或以质粒的形式在染色体外复制。因此，存在很大的风险，即霍乱弧菌减毒菌株的CTXΦ感染可诱导该菌株逆转为毒力状态；基因获取的其他方式(包括自然转化)也可以介导逆转。防止和/或减轻例如通过CTXΦ感染或由减毒霍乱弧菌细菌菌株转化而可能获得霍乱毒素的方法对于确保包括减毒霍乱弧菌菌株的疫苗的生物安全性是非常需要的。

在一些实施方案中，细菌是减毒的(即，与其源自的亲本菌株相比，具有减弱的毒力)。细菌可包括本文所述的一种或多种遗传修饰，以实现减毒状态。遗传修饰包括但不限于基因的全部或部分缺失，以及改变细菌表达基因的能力(例如，改变启动子元件使其不能工作)的遗传修饰。

在一些实施方案中，细菌是弧菌属(Vibrio)的。在一些实施方案中，细菌是霍乱弧菌种。如本文所述，任何霍乱弧菌菌株，包括临床分离菌株都可以使用。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌属于O1血清群。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌属于O1血清群并且属于经典生物型。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌属于O1血清群并且属于El Tor生物型。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌属于O1血清群并且属于变体El Tor生物型。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌属于O139血清群。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌属于Inaba血清型。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌属于Ogawa血清型。在一些实施方案中，霍乱弧菌属细菌属于Hikojima血清型。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌源自海地临床分离菌株。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌源自由以下组成的组的菌株：O395、N16961、B33、IB4122、IB4642和IB4755。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌源自H1菌株(也称为KW3菌株(参见NCBI参考序列GCF_000275645.1和参考序列GCF_001318185.1))。毒力霍乱弧菌菌株编码两个主要的毒力因子：霍乱毒素(CT)和毒素共调节菌毛(TCP)，分别由溶源性噬菌体CTXΦ和染色体致病岛编码。噬菌体CTXΦ可以通过噬菌体感染将霍乱弧菌的非致病性菌株转化为致病性菌株，这是一个将噬菌体基因组整合至宿主基因组中或被维持为质粒的过程，这两者都为宿主细菌提供毒力基因。

CTXΦ基因组的大小约为6.9kb，并组织为两个功能不同的区域(参见例如McLeod等人(2005)Mol.Microbiol.57(2):347-56；和Kim等人(2014)J.Microbiol.Biotechnol.24(6):725-31)。第一区域，重复序列2(RS2)包括三个基因：rstR、rstA和rstB。rstA和rstB分别编码蛋白质RstA和RstB，这是CTXΦDNA复制和整合至细菌染色体中所必需的。rstR编码阻遏蛋白RstR。第二区域称为核心区域，包括基因psh、cep、orfU(gIII)、ace、zot和ctxAB。psh、cep、orfU(gIII)、ace和zot基因分别编码蛋白Psh、Cep、OrfU(pIII^CTX)、Ace和Zot，这是噬菌体包装和分泌所必需的。ctxAB是操纵子，包括ctxA和ctxB基因，分别编码霍乱毒素、CtxA和CtxB的蛋白亚基。ctxA和ctxB一起编码由一个CT-A亚基和五个CT-B亚基组成的霍乱毒素(CT)毒力因子。

在一些实施方案中，本文所述的霍乱弧菌细菌包括一种或多种遗传改变，以便减少、抑制和/或改变一种或多种CTXΦ基因组基因的表达，所述CTXΦ基因组基因整合至细菌基因组中，从而降低该细菌的毒力。遗传改变包括但不限于在CTXΦ基因组基因的开放阅读框中缺失、突变、***，以改变基因产物的表达和功能，或在启动子或转录调控元件中缺失、突变、***，以抑制基因的表达。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括整合的CTXΦ基因组和相邻的(和相关的)RS1元件的所有拷贝的缺失，所述RS1元件是可以被CTXΦ包装的卫星噬菌体。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括整合的CTXΦ基因组基因的核酸序列中的缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌已被遗传修饰以完全缺失包括整合至细菌染色体的CTXΦ基因组的核酸序列，或由其组成的核酸序列。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌已被遗传修饰以部分缺失包括整合至细菌染色体中的CTXΦ基因组的核酸序列。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌已被遗传修饰以缺失包括整合至细菌染色体的CTXΦ基因组的RS2区域的核酸序列，或由其组成的序列。在一些实施方案中，霍乱弧菌已被遗传修饰以缺失包括整合至细菌染色体的CTXΦ基因组的核心区域核酸序列，或由其组成的核酸序列。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌已被遗传修饰以缺失包括选自由以下组成的组的基因的核酸序列，或由其组成的核酸序列：rstR、rstA、rstB、psh、cep、orfU(gIII)、ace、zot、ctxA和ctxB。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌已被遗传修饰以缺失包括ctxA基因的核酸序列，或由其组成的核酸序列。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌已被遗传修饰以缺失包括ctxB基因的核酸序列，或由其组成的核酸序列。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌已被遗传修饰以缺失包括ctxAB操纵子的核酸序列，或由其组成的核酸序列。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌已被遗传修饰以缺失CTXΦ噬菌体整合的attB(附着)位点。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括一种或多种遗传改变，以便减少、抑制和/或改变在细菌基因组中整合的一种或多种RS1卫星噬菌体基因和/或一种或多种TCL卫星噬菌体基因的表达。CTXΦ噬菌体基因组的整合拷贝通常位于RS1卫星噬菌体和TLC卫星噬菌体的拷贝的侧翼。TLC卫星噬菌体参与改变霍乱弧菌基因组，以增强CTXΦ和RS1噬菌体的整合，而RS1噬菌体使用一些CTXΦ编码的蛋白质进行包装和分泌(参见例如Samruzzaman等人(2014)Infect.Immun.82(9):3636-43。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括RS1噬菌体基因组完整拷贝的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括RS1噬菌体基因组完整拷贝的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括RS1噬菌体基因完整拷贝的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括RS1噬菌体基因完整拷贝的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括TLC噬菌体基因组完整拷贝的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括TLC噬菌体基因组的完整拷贝的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括TLC噬菌体基因完整拷贝的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括TLC噬菌体基因完整拷贝的完全缺失。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括使该细菌不能促进CTXΦ复制的遗传修饰。例如，DNA结合蛋白HUβ促进霍乱弧菌中CTXΦ的质粒形式的复制(参见Martinez等人PLoSGenetics 11(5):e1005256，其全部内容明确地通过引用并入本文)。在霍乱弧菌中，HUβ由hupB(也称为VC1919)编码。因此，在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括改变hupB的功能和/或表达的遗传改变。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括hupB基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括hupB基因的完全缺失。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括使细菌不能产生和/或分泌多功能自加工毒素重复序列(MARTX)毒素的遗传修饰。霍乱弧菌中的MARTX毒素rtx基因位点由两个不同转录的操纵子rtxHCA和rtxBDE组成。在霍乱弧菌中，MARTX毒素RtxA由rtxA基因编码，并促进肠道细菌定殖(参见例如Satchell等人(2015)Microbiol.Spectr.3(3)和Fullner等人(2002)J.Exp.Med.195(11):1455-62；和Olivier等人(2009)PLoS One 4(10):e7352，其每一个的全部内容均通过引用并入本文)。相邻基因rtxC编码假定的酰基转移酶rtxC，而rtxH编码具有未表征功能的假想蛋白质(参见Gavin和Satchell(2015)Pathog.Dis.73(9):ftv092，其全部内容通过引用并入本文)。rtxBDE操纵子的基因编码专用的MARTX毒素1型分泌***(T1SS)，其中rtxB和rtxE分别编码ATPase蛋白RtxB和RtxE，rtxD编码跨膜蛋白RtxD，其与外膜孔蛋白TolC协同作用将RtxA从细菌细胞质分泌到细胞外环境(参见Gavin和Satchell(2015))。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括改变MARTX毒素功能的遗传改变。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxA基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxA基因的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxB基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxB基因的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxC基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxC基因的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxD基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxD基因的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxE基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxE基因的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxH基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxH基因的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxHCA操纵子的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxHCA操纵子的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxBDE操纵子的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括rtxBDE操纵子的完全缺失。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括遗传修饰以在施用于受试者(例如人受试者)后降低细菌的反应原性。一些减毒的口服霍乱弧菌疫苗菌株已经诱导反应原性症状，包括非胆汁性腹泻和腹部绞痛；然而，已经证明缺乏鞭毛蛋白编码基因的霍乱弧菌菌株在动物模型中表现出降低的反应原性(参见，例如，Rui等人(2010)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA107(9):4359-64，其全部内容通过引用明确地并入本文)。霍乱弧菌包括两个操纵子，flaAC和flaDBE，其包括五个鞭毛蛋白编码基因。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括改变至少一种编码鞭毛蛋白的基因的功能的遗传改变。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括编码鞭毛蛋白基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括编码鞭毛蛋白基因的完全缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括鞭毛蛋白基因的完全或部分缺失，所述鞭毛蛋白基因选自由以下组成的组：flaA、flaB、flaC、flaD和flaE。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括flaAC操纵子的完全或部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括flaBDE操纵子的完全或部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括flaAC操纵子和flaBDE操纵子两者的全部或部分缺失。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括抗生素抗性基因的缺失，以防止抗生素抗性基因向其他细菌的扩散。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括抗生素抗性基因的部分缺失。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括抗生素抗性基因的完全缺失。在一些实施方案中，抗生素抗性基因选自由以下组成的组：floR(其赋予氯霉素抗性)、strAB(其赋予链霉素抗性)、sul2(其赋予磺胺异噁唑和磺胺甲噁唑抗性)和dfrA(其赋予甲氧苄啶抗性)。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括以下抗生素抗性基因中的每一个的完全缺失：floR、strAB、dfrA和sul2。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括使细菌不能产生RecA的遗传修饰。基因recA编码多功能蛋白RecA，其参与同源重组、DNA修复和SOS应答(参见，例如Thompson等人(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54(Pt.3):919-24，其全部内容通过引用明确地并入本文)。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括recA基因的缺失。在一些实施方案中，该缺失是部分缺失。在一些实施方案中，该缺失是完全缺失。不希望受到任何特定理论的束缚，recA的缺失防止通过霍乱弧菌细菌的同源重组依赖性基因获取以及防止其解决因环境暴露(如紫外线)引起的突变的能力。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括异源核酸或异源基因。术语“异源核酸”或“异源基因”是指自然界中通常不在给定细胞中发现的核酸(例如，外源引入至给定细胞的核酸；或已经以不同于相应天然核酸的形式引入至宿主细胞的核酸)。本领域技术人员将容易理解，异源核酸可包含经密码子优化以用于本文所述霍乱弧菌细菌的基因。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括编码抗原性多肽的异源核酸。在一些实施方案中，编码抗原性多肽的核酸的表达可操作地连接至组成型启动子。在一些实施方案中，编码抗原性多肽的核酸可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施方案中，将编码抗原性多肽的异源核酸整合至细菌基因组中。在一些实施方案中，编码抗原性多肽的异源核酸存在于质粒上。在一些实施方案中，抗原性多肽是霍乱毒素亚基CtxB。本文所述的通过霍乱弧菌细菌的霍乱毒素CtxB亚基的表达可以是特别有利的，因为它可以在施用细菌的受试者中促进抗CtxB免疫应答的诱导，从而产生针对霍乱弧菌和产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)的免疫保护(参见，例如，Kauffman等人(2016)mBio 7(6):e02021-16，其全部内容通过引用明确地并入本文)。因此，在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括包含霍乱弧菌ctxB基因的异源核酸。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括异源核酸，所述异源核酸包含可操作地连接至诱导型启动子(例如，P_htpg启动子)的霍乱弧菌ctxB基因。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括异源核酸，其包含可操作地连接至诱导型启动子的霍乱弧菌ctxB基因。在一些实施方案中，包含霍乱弧菌ctxB基因的异源核酸存在于细菌染色体上。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括突变N900_11550::Phtpg-ctxB。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括在与HaitiWT的N900_11550基因座同源的基因座(生物项目登录号PRJNA215281；生物样品登录号SAMN04191514)上整合至染色体中的编码CtxB的异源核酸。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括在与HaitiWT的N900_RS07040基因座同源的基因座上整合至染色体中的编码CtxB的异源核酸。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括在与HaitiWT的N900_RS07045基因座同源的基因座上整合至染色体中的编码CtxB的异源核酸。

在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括细菌染色体，其中所述细菌染色体包括SEQID NO：7的核酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌包括细菌染色体，其中所述细菌染色体包括SEQ ID NO：51的核酸序列组成，或由其组成。在一些实施方案中，霍乱弧菌包括第一细菌染色体和第二细菌染色体，其中所述第一细菌染色体包括SEQ ID NO：7的核酸序列，或由其组成，并且第二细菌染色体包括SEQ ID NO：51的核酸序列，或由其组成。在一些实施方案中，相对于其亲本菌株，霍乱弧菌细菌与具有ATCC保藏号PTA-125138的菌株在相同的基因中具有突变。在一些实施方案中，霍乱弧菌细菌是具有ATCC保藏号PTA-125138的霍乱弧菌菌株(在本文中被描述为HaitiV)。

可编程的RNA指导的核酸酶***

本公开还提供重组细菌菌株，其包含可编程的RNA指导的核酸酶***，所述***特异性靶向先前从细菌菌株中缺失的基因(例如，毒力基因)。通过靶向从细菌菌株中缺失的基因，可以(例如，通过防止基因的重新获得)防止和/或改善由重组细菌向毒力表型的逆转。使用如本文所述的可编程的RNA指导的核酸酶***在活减毒疫苗细菌菌株中特别有用，以维持菌株的减毒表型。

任何减毒细菌菌株可以经修饰以表达可编程的RNA指导的核酸酶***，以防止和/或改善向毒力表型的逆转。例如，可以将霍乱弧菌、肠道沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、索氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、百日咳博德特氏菌和艰难梭菌(以前称为Clostridioidesdifficile)种(species)的活减毒细菌菌株进行遗传操作，以表达靶向在菌株中缺失的基因(即，与减毒细菌菌株所源自的菌株相比)的可编程的RNA指导酶***。表1提供示例性活减毒细菌菌株和菌株中缺失的毒力基因的描述。表2提供这些活减毒细菌菌株中缺失的毒力基因的示例性序列。如本文所述，可以对表1提供的每个细菌菌株进行遗传修饰，以包括特异性靶向菌株中已经缺失的至少一种基因的RNA指导的核酸酶***。例如，在一些实施方案中，细菌菌株是霍乱弧菌菌株，其包括在ctxA基因中的缺失以及靶向ctxA基因的可编程的RNA指导的核酸酶***(例如，编码Cas9核酸酶分子的异源核酸序列和编码指导RNA(gRNA)的异源核酸序列)。在一些实施方案中，细菌菌株是肠道沙门氏菌(S.enterica)菌株，其包括选自由以下组成的组的至少一种毒力基因中的缺失：aroC、aroD、htrA、ssaV、cya、crp、phoP、phoQ、guaB、guaA、clpX和clpP，以及靶向至少一种缺失的毒力基因(例如，aroC、aroD、htrA、ssaV、cya、crp、phoP、phoQ、guaB、guaA、clpX和clpP)的可编程的RNA指导的核酸酶***。在一些实施方案中，细菌菌株是弗氏志贺氏菌(S.flexneri)菌株，其包括选自由以下组成的组的至少一种毒力基因中的缺失：guaB、guaA、set、sen、virG/icsA、luc、aroA和msbB2，以及靶向至少一种缺失的毒力基因(例如，guaB、guaA、set、sen、virG/icsA、luc、aroA和msbB2)的可编程的RNA指导的核酸酶***。在一些实施方案中，细菌菌株是痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)菌株，其包括选自由以下组成的组的至少一种毒力基因中的缺失：guaB、guaA、sen、stxA、stxB和msbB2，以及靶向至少一种缺失的毒力基因(例如，guaB、guaA、sen、stxA、stxB和msbB2)的可编程的RNA指导的核酸酶***。在一些实施方案中，细菌菌株是索氏志贺氏菌(S.sonnei)菌株，其包括在stxA基因和/或stxB基因中的缺失，以及靶向缺失的毒力基因(例如，stxA和/或stxB)的可编程的RNA指导的核酸酶***。在一些实施方案中，细菌菌株是百日咳博德氏特菌(B.pertussis)菌株，其包括在dnt基因、aroA基因和/或aroQ基因中的缺失，以及靶向缺失的毒力基因(例如，dnt、aroA和/或aroQ)的可编程的RNA指导的核酸酶***。在一些实施方案中，细菌菌株是艰难梭菌菌株，其包括在tcdA基因和/或tcdB基因中的缺失，以及靶向缺失的毒力基因(例如，tcdA和/或tcdB)的可编程的RNA指导的核酸酶***。

在一些实施方案中，细菌是霍乱弧菌细菌，其具有特异性靶向CTXΦ核酸的可编程的RNA指导的核酸酶***，从而防止或中断以下过程中的一个或多个：将CTXΦ遗传物质***细菌基因组中，CTXΦ的复制，CTXΦ的组装，和/或CTXΦ从细菌的释放；或灭活包含CTXΦ基因组完整拷贝的细菌。在一些实施方案中，可编程的RNA指导的核酸酶***靶向ctxA基因。

可以使用的相关核酸酶***包括但不限于：锌指核酸酶，转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)，普氏菌属和弗朗西斯氏菌属源的CRISPR 1(Cpf1)核酸酶(CRISPR fromPrevotella and Francisella 1(Cpf1)nucleases)，巨核酸酶和CRISPR/Cas9核酸酶***。如本文所用，涉及可编程的RNA导指的核酸酶***的术语“编辑”包括例如点突变、***、缺失、移码或错义突变的靶核酸处的突变。RNA指导的核酸酶***包括指导RNA，其包含与毒力基因(例如，存在于CTXΦ基因组中的基因，例如ctxA)中的核酸(即，靶向结构域)的核酸序列互补的序列，以及由核酸酶分子(例如，Cas9核酸酶分子)可靶向的序列(例如，PAM序列或直接重复序列)。如本文所用，术语指导RNA(“gRNA”)包括将核酸酶分子引导至靶核酸的任何RNA分子(例如，gRNA、crRNA、tracrRNA、sgRNA等)。成功靶向后，核酸酶分子切割毒性基因(例如ctxA)中的核酸。通过用可编程的RNA指导的核酸酶***特异性靶向毒力基因，可以防止和/或改善减毒细菌(例如，减毒肠道沙门氏菌或霍乱弧菌)向毒力细菌的逆转。术语“预防”是指减毒细菌逆转为毒力形式的风险的任何降低，无论多么轻微(例如，不必100％降低)。

在一些实施方案中，细菌包括编码Cas9核酸酶分子的异源核酸。如下所述，尽管本实例举例说明了化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9核酸酶分子(SpCas9)的使用，但是也可以使用来自其他物种的其他Cas9核酸酶分子(例如，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9核酸酶分子(SaCas9))。多种Cas9核酸酶分子的序列以及它们各自的PAM序列是本领域已知的(参见，例如，Kleinstiver等人(2015)Nature 523(7561):481-5；Hou等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.；Fonfara等人(2014)NucleicAcids Res.42:2577-90；Esvelt等人(2013)Nat.Methods 10:1116-21；Cong等人(2013)(2013)Science 339:819-23；和Horvath等人(2008)J.Bacteriol.190:1401-12；PCT公开号WO 2016/141224，WO 2014/204578和WO 2014/144761；美国专利号9,512,446；以及美国专利公开号2014/0295557；其每一个的全部内容通过引用并入本文)。还可以使用SpCas9***的变体(例如，截短的sgRNA(Tsai等人(2015)Nat.Biotechnol.33:187-97；Fu等人(2014)Nat.Biotechnol.32：279-84)，切口酶突变(Mali等人((2013)Nat.Biotechnol.31:833-8(2013)；Ran等人(2013)Cell 154:1380-9)，FokI-dCas9融合体(Guilinger等人(2014)Nat.Biotechnol.32:577-82；Tsai等人(2014)Nat.Biotechnol.32:569-76；和PCT公开号WO2014/144288；其每一个的全部内容通过引用并入本文)。核酸酶可以包括以下的一种或多种：SpCas9 D1135E变体；SpCas9 VRER变体；SpCas9 EQR变体；SpCas9 VQR变体；嗜热链球菌Cas9核酸酶分子(StCas9)；齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9核酸酶分子(TdCas9)；或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)Cas9核酸酶(NmCas9)，及其变体，所述变体与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并保留至少一种它们所源自的酶的功能，例如，与gRNA形成复合体、结合至由gRNA指定的靶DNA、和改变靶DNA的序列(例如切割)的能力。

在一些实施方案中，细菌(例如霍乱弧菌细菌)包括编码Cpf1核酸酶分子的异源核酸。Cpf1是可以被编程为切割靶DNA序列的Cas蛋白(Zetsche等人(2015)Cell 163:759-71；Schunder等人(2013)Int.J.Med.Microbiol.303:51-60；和Makarova等人(2015)Nat.Rev.Microbiol.13:722-36；Fagerlund等人(2015)Genome Biol.16:251)。在一些实施方案中，Cpf1核酸酶分子是氨基酸球菌种(Acidaminococcus sp.)BV3L6(AsCpf1；NCBI参考序列：WP_021736722.1)，或其变体。在一些实施方案中，Cpf1核酸酶分子是毛螺旋菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006(LbCpf1；GenBank登录号WP_051666128.1)或其变体。与SpCas9不同，Cpf1仅需要单个42nt的crRNA，在其3'端具有23nt的与靶DNA序列的原间隔序列互补的核酸序列(Zetsche等人(2015))。此外，尽管SpCas9识别的是原间隔序列3'的NGG PAM序列，而AsCpf1和LbCp1识别的则是原间隔序列5'存在的TTTN PAM(Zetsche等人(2015))。在一些实施方案中，Cpf1核酸酶分子是野生型Cpf1分子的变体，其与野生型Cpf1核酸酶分子具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并保留至少一种它们所源自的酶的功能，例如，与gRNA形成复合体、结合至由gRNA指定的靶DNA、和改变靶DNA的序列(例如切割)的能力。

为了确定两个序列的同一性百分比，将序列进行比对以达到最佳的比较目的(根据最佳比对的需要，在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入缺口，并且出于比较的目的，可以将非同源序列忽略不计)。为了比较目的而比对的参考序列的长度是进行至少80％(在一些实施方案中，参考序列的长度的约85％、90％、95％或100％)的比对。然后比较相应位置的核苷酸或残基。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置相同的核苷酸或残基占据时，则分子在该位置是同一的。考虑到缺口数和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数，其需要引入以实现两个序列的最佳比对。

序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。例如，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用Needleman和Wunsch算法(参见Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：444-53)来确定，该算法已经并入GCG软件包中的GAP程序，其使用Blossum62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。

野生型SpCas9的氨基酸序列如下：

野生型SaCas9的氨基酸序列如下：

在一些实施方案中，细菌包括编码gRNA的异源核酸序列，其中所述gRNA包括与毒力基因(例如，CTXΦ基因组基因，例如ctxA)的靶核酸序列互补的靶向结构域。在一些实施方案中，gRNA包括与表2所列毒力基因(例如，ctxA、aroD、或htrA)上存在的靶核酸序列互补的靶向结构域。设计和制备对特定靶标具有特异性的gRNA的方法在本领域中是已知的，并且例如在Prykhozhij等人(2015)PLos One 10(3):e0119372；Doench等人(2014)Nat.Biotechnol.32(12):1262-7；和Graham等人(2015)Genome Biol.16:260中描述，其每一个通过引用明确地并入本文。

具有可编程的RNA指导的核酸酶***的霍乱弧菌

在一些实施方案中，毒力基因是CTXΦ基因，细菌是减毒霍乱弧菌细菌。不希望受任何特定理论的束缚，通过特异性靶向CTXΦ基因组的核酸序列，可以防止CTXΦ基因组向霍乱弧菌细菌基因组的整合和/或防止CTXΦ基因组以质粒的形式的维持，这两种情况任何一个都可以导致细菌适应和/或逆转为毒力状态。gRNA可包含与CTXΦ基因组中存在的靶核酸序列互补的靶向结构域；然而，优选地，gRNA特异性地靶向CTXΦ基因组的核酸序列而不是细菌基因组核酸序列。在一些实施方案中，gRNA包括与CTXΦ基因(例如，rstR、rstA、rstB、psh、cep、orfU(gIII)、ace、zot、ctxA和ctxB)中存在的靶核酸序列互补的靶向结构域。特别期望靶向ctxA。在一些实施方案中，gRNA包括与ctxA基因中存在的靶核酸序列互补的靶向结构域。在一些实施方案中，gRNA包括核酸序列：5’-cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’(SEQID NO：3；特异于ctxA的靶序列以粗体突出显示)。在一些实施方案中，gRNA包括核酸序列5’-tttttgtcgattatcttgctgttctagagagcgggagctcaagttagaataaggctagtccgtattcagtgcgggagcacggcaccgattcggtgc-3’(SEQ ID NO：4；特异于rstA的靶序列以粗体突出显示)。在一些实施方案中，gRNA包括核酸序列5’-taaacaaagggagcattatagttggagaggcatgagaatgccaagttccaataaggctagtccgtacacctaggagactaggggcaccgagtcggtgc-3’(SEQ ID NO：5；特异于ctxA的靶向序列以粗体突出显示)。

如上所述，在一些实施方案中，基因工程化的霍乱弧菌细菌可包括异源核酸，其中所述异源核酸包括ctxB基因。不希望受到任何特定理论的束缚，CtxB的表达可以在受试者中诱导抗ctxB免疫应答。这种抗ctxB免疫应答可预防由霍乱弧菌细菌菌株和/或产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)两者任何一个引起的腹泻疾病(参见，例如，Kauffman等人(2016)MBio.7(6):e 02021-16)。本领域技术人员将容易地理解，如果细菌包括包含ctxB基因的异源核酸以及包含与ctxB基因中存在的靶核酸序列互补的靶向结构域的gRNA，则可以将包含ctxB基因的异源核酸和编码gRNA的核酸两者任一个进行基因工程化，以使gRNA不会靶向包含ctxB基因的异源核酸。例如，可以将包含ctxB基因的异源核酸修饰，以用同义密码子序列替换密码子序列，从而使其与gRNA靶向结构域序列不互补。

表1.示例性活疫苗菌株

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使用方法

另一方面涵盖使用本文提供的基因工程化的细菌(例如，基因工程化霍乱弧菌)的方法。例如，在本文提供的一些实施方案中，所述方法是通过向受试者施用(例如，口服)本文所述的基因工程化的细菌来调节受试者的免疫***的方法。该方法包括向受试者(例如，人受试者)施用有效量的包含本文所述的基因工程化的细菌的组合物。本领域技术人员将理解，组合物的有效量是将产生所需应答(例如，保护性应答、粘膜应答、体液应答或细胞应答)的量。可以通过本领域已知的方法定量应答。

在一些实施方案中，本文提供了在受试者中诱导针对霍乱弧菌的毒力菌株的保护性应答的方法，该方法包含施用本文所述的经遗传修饰的霍乱弧菌细菌，或本文所述的包含经遗传修饰的霍乱弧菌细菌的药物组合物。在一些实施方案中，将药物组合物的经遗传修饰的细菌施用于受试者后约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、或约84小时内产生保护性应答。在一些实施方案中，将药物组合物的经遗传修饰的细菌施用于受试者后约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、84小时、或更长时间内产生保护性免疫应答。

在另一个实施方案中，本文所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌可用于在有此需要的宿主中减轻霍乱的一种或多种症状的方法中。霍乱症状包括腹泻、恶心、呕吐和脱水。该方法包括施用有效量的包含本文所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌的组合物。

本文所述的基因工程化的细菌和包含该细菌的组合物可以施用于任何受试者。下文详述包含基因工程化的细菌的示例性疫苗组合物制剂和施用方法。

药物组合物

本文所述的包含基因工程化的细菌的药物组合物可任选地包含一种或多种可能的药学上可接受的赋形剂，例如载体、防腐剂、冷冻保护剂(例如蔗糖和海藻糖)、稳定剂、佐剂和其他物质。例如，当组合物包括活的基因工程化的细菌时，选择赋形剂以使活细菌不被灭活，或使得细菌有效地定殖受试者的能力不会因使用赋形剂而受到损害。合适的药物载体是本领域已知的，例如包括生理浓度或接近生理浓度的液体载体，例如生理盐水和其他无毒盐，以及固体载体，例如滑石和蔗糖。在一些实施方案中，药物组合物包含佐剂。在一些实施方案中，药物组合物可以是适合于雾化施用于受试者的形式。在一些实施方案中，药物制剂为冻干形式(即，冻干形式)。在一些实施方案中，药物制剂是明胶胶囊。合适的药物载体和佐剂以及剂型的制备描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，(Gennaro编辑,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985)，其通过引用并入本文。

本文所述的基因工程化的细菌对受试者的施用可以通过任何已知技术进行，包括但不限于口服施用、直肠施用、***施用、或鼻腔施用。

如本领域技术人员所理解的，施用于受试者的基因工程化的细菌的剂量可以并且将取决于基因工程化的细菌、施用途径和预期的受试者而变化。一般而言，该剂量仅需足以引起受试者的保护性宿主应答。例如，取决于细菌将要施用的受试者的年龄，口服施用的典型剂量可以是约1×10⁷至1×10¹⁰菌落形成单位(CFU)。施用多次剂量的基因工程化的细菌也可以根据需要使用以提供期望的保护水平。

还提供包含本文所述的基因工程化的细菌或药物组合物的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括使用说明书。在一些实施方案中，将药物组合物冻干，使得添加水合剂(例如，缓冲盐水)重构该组合物，以产生适合于施用于受试者(例如，口服)的药物组合物。

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术表示发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，可以在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍可获得相同或相似的结果，因此，在附图中阐述或显示的所有内容均应被解释为说明性的，而不是限制性的。

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1.基因工程化的霍乱弧菌细菌菌株在施用的一天之内赋予对霍乱弧菌的毒力菌株的抗性

在也门和海地发生的大规模的且仍在进行的霍乱疫情表明，这种古老的腹泻疾病仍然是对公共卫生的重大威胁(Balakrishnan(2017)Lancet Infect.Dis.17,700-1；和Ali等人(2015)PLoS Negl.Trop Dis.9，e0003832)。霍乱是由摄入被霍乱弧菌(革兰氏阴性细菌病原体)污染的水或食物引起的。霍乱弧菌在小肠内定殖并产生霍乱毒素，引起大量水泻和随之而来的脱水，如果没有补液疗法，脱水会迅速致命(Clemens等人(2017)Lancet 390(10101):1539-49)。由于霍乱流行病的肆虐传播，尤其是与卫生基础设施和供水中断有关，因此限制霍乱传播的公共卫生干预措施至关重要。由被灭活的全霍乱弧菌细胞组成的口服霍乱疫苗(OCV)在流行地区具有适度的保护功效(Qadri等人(2015)Lancet 386(10001):1362-71)，并且这些疫苗是最近在非霍乱疫情地区爆发期间部署的，其作为“反应性疫苗”计划的一部分，旨在阻止霍乱的蔓延(参见，例如，Luquero等人(2014)N.Engl.J.Med.370(22):2111-20)。然而，灭活的OCV的最佳功效需要间隔14天施用2次冷冻剂量(参见，例如，Kabir(2014)Clin.Vaccine Immunol.21(9):1195-1205)，并且这些特征可以限制灭活的OCV在不稳定或资源有限的环境中迅速限制持续爆发的能力。单剂量活减毒OCV在攻击(challenge)研究(参见例如，Chen等人(2016)Clin.Infect.Dis.62(11):1329-35)和在流行地区的早期临床试验(Qadri等人(2007)Vaccine 25(2):231-8)中表现出功效，并且进行活减毒OCV反应性疫苗接种可有助于减少爆发期间霍乱的发生率(参见Calain等人(2004)Vaccine 22(19):2444-51)。然而，无活的OCV基于全球主要的“变体”El Tor菌株，如引起2010年海地霍乱爆发的菌株(参见Chin等(2011)N.Engl.J.Med.364(1):33-42)。此外，没有显示灭活或活减毒OCV已经介导对霍乱的快速(例如在施用后24小时内)预防；相反，目前的疫苗被认为需要引发保护性适应性免疫应答所必需的时间(至少1周)，以实现对霍乱的预防。该实施例描述了基于海地爆发菌株的新的活减毒霍乱疫苗的产生，发现该疫苗能在施用后的一天之内快速保护幼兔免于致命的霍乱样疾病的侵害。

材料和方法

在该实施例中使用以下材料和方法。

研究设计

这项研究的目的是设计一种新的活减毒霍乱疫苗候选物，评估该菌株在肠道中安全定殖的能力，确定该菌株是否可以在施用后不久保护动物免受霍乱样疾病的侵害，并量化观察到的保护参数对流行期间霍乱感染的发生率的潜在影响。候选疫苗通过连续的等位基因交换步骤(参见遗传操作)源自全球主要的霍乱弧菌菌株的分离物，并通过全基因组测序(参见全基因组测序)验证突变。根据联邦和机构有关研究动物使用的准则，使用幼兔感染模型(参见幼兔感染研究)进行肠道定殖和霍乱样疾病的研究。将1-2天大的动物随机分配至治疗组，并使用窝内(即，共同饲养和年龄匹配)对照来最小化窝间差异的影响。对于疾病进展的研究，评估者不知道施用于每组的治疗，并且排除了在攻击后10小时内发现死亡的动物，因为它们受到与母体排斥一致的身体创伤。转座子***测序研究是使用ARTIST管线进行的，该管线对实验噪声进行建模和补偿，并为强加效应大小阈值提供建议(请参见转座子***测序分析)。最后，进行将疫苗保护的可变时间并入先前公布的疾病传播参数集的建模(参见霍乱爆发建模)。

统计分析

使用t检验(流体蓄积率)的双面检验(α＝0.05)，非参数数据(细菌负载)的Mann-Whitney U检验或对数秩检验(存活曲线)进行两个样品的比较。使用Kruskall-Wallis检验和Dunn的多重比较检验(细菌负载)对三个样品进行比较。

菌株、培养基和培养条件

表3包含本研究中使用的菌株的列表。除非另有说明，否则霍乱弧菌和大肠杆菌在溶源性液体培养基(LB：10g/L的胰蛋白胨，5g/L的酵母提取物，5g/L的NaCl)中于37℃下摇动(250RPM)生长。噬菌体转导测定中的受体菌株在AKI培养基(15g/L的蛋白胨，4g/L的酵母提取物，5g/L的NaCl，高压灭菌，然后补充新鲜制备的、无菌过滤的0.3％的NaHCO₃)中生长。

除非另有说明，否则抗生素和底物按以下浓度使用：链霉素(Sm)(200μg/mL)，羧苄青霉素(50μg/mL)，氯霉素(20μg/mL)，SXT(160μg/mL的磺胺甲噁唑，32μg/mL的甲氧苄啶)，卡那霉素(Kn)(50μg/mL)和5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-Gal 60mg/mL)。

表3.本研究中使用的菌株和质粒。

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基因操作

将所有基因缺失和置换通过使用***载体pCVD442，DH5α-λpir和供体菌株MFD-λpir(参见Ferrieres等人(2010)J.Bacteriol.192(24):6418-27)或SM10-λpir(表3)经同源重组进行构建。对于所有缺失，将相应ORF上游和下游的大约500-700bp的同源区域通过使用下文所述的引物组合进行扩增，并使用等温组装将其克隆至XbaI酶解的pCVD442中。

为了从Haiti WT菌株产生(derivation)HaitiV，首先，将CTXΦ噬菌体和周围序列通过使用引物TDPsCTX1/TDPsCTX2和TDPsCTX3/TDPsCTX4进行缺失，以扩增rtx毒素转运蛋白上游5'端和该区域的推定脱氢酶上游3'端的同源区域。这导致包括整个CTXΦ噬菌体的42,650bp片段的缺失，其包括ctxAB，CTX附着位点，RS1和TLC卫星噬菌体以及MARTX毒素基因rtxABCDE。敲除经使用引物TD1027/TDP1028的聚合酶链式反应(PCR)进行验证。

接下来，如先前在Millet等人(2014)PLoS Pathog.10(10):e1004405中所述进行flaBDE操纵子的缺失。将flaAC操纵子缺失质粒通过使用引物TDP1172/1174(上游同源性)和TDP1173a/TDP1173(下游同源性)进行构建。随后，将SXT ICE编码的抗生素抗性基因座，dfrA，sul2，strAB和floR通过使用引物TDP1193/TDP1194+TDP1195/1196(dfrA，甲氧苄啶抗性)和TDP1287/TDP1288+TDP1291/TDP1292(磺胺甲噁唑，链霉素和链霉素抗性基因座)进行缺失。全基因组测序表明，等位基因交换过程中的第二次交换不是发生在***质粒中包括的同源区域之间，而是发生在染色体的flor/sul区域侧翼的重复序列之间(N900_11210和N900_11260)。将疫苗前体菌株的Sm^R突变体通过在链霉素(1000μg/mL)上铺板分离，并通过Sanger测序确认rpsL^K43RSNV。

对于CtxB过表达，将htpG启动子通过使用引物FD54/FD103(添加强核糖体结合位点AGGAGG(SEQ ID NO：6))从Peru-15中进行扩增(参见Kenner等人(1995)J.Infect.Dis.172(4):1126-9)，将ctxB通过使用引物FD33/FD34从含有ctxB7等位基因的HaitiWT中进行扩增。将验证的中性基因座vc0610/N900_11550(参见Abel等人(2015)Nat.Methods 12(3):223-6)的基因间区域侧翼的同源区域通过用引物对FD30/FD31和FD73/FD74进行扩增。然后将这些片段通过一步等温组装反应克隆至pCVD442中。CtxB的过表达通过对来自上述AKI条件下生长的培养物中的无细胞上清液进行蛋白质印迹来证实(Abcam ab123129，抗霍乱毒素；图7)。

接下来，将hupB缺失质粒通过使用引物对Vc-hupB5-F1/Vc-hupB5-R1和VC-hupB3-F1/Vc-hupB3-R1进行构建。该缺失用引物VC-hupB-SF2/Bc-hupB-SR2进行验证。

对于cas9-sgRNA模块，将cas9使用引物TDP1747/TDP1748从质粒DS_SpCas9(addgene.org/48645/)中扩增。将sgRNA区域通过用引物TDP1761/TDP1762从gBlock‘VC_3x_sgRNA_gBlock’(表4)中进行扩增。将两个片段合并，并通过等温组装将其克隆至pJL1的StuI位点(Butterton(1995)Infect Immun 63:2689-96)。测序表明，组装期间的重组步骤去除了3个sgRNA中的2个，剩下一个指导靶向ctxA。将该***载体经与辅助质粒pRK600的三亲配对(triparental mating)而引入至疫苗菌株。

表4.本研究使用的寡核苷酸

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最后，将recA缺失质粒通过使用引物对Vc-recA5-F1/Vc-recA5-R1和Vc-recA3-F1/Vc-recA3-R1进行构建；缺失通过用引物Vc-recA-SF2/Vc-recA-SR2进行验证。

全基因组测序

将来自HaitiWT和HaitiV的基因组DNA通过使用Nextera XT文库制备试剂盒(ILLUMINA)进行制备，并在MiSeq(试剂盒v2，2x250)上测序。HaitiV细菌染色体的基因组序列在本文提供为SEQ ID NO：7和51。根据布达佩斯条约的条款，HaitiV菌株于2018年6月22日保藏在位于美国弗吉尼亚州(邮编：20110)马纳萨斯市大学大道10801号的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，并分配其ATCC专利保藏号PTA-125138。将每个样品定位到其推定的基因组和使用GATK3.6鉴定的变体。

CTXΦ转换测定

将来自具有CTXΦ-IGKn(基因组包括ctxA的噬菌体(参见，例如，Lazar和Walder(1998)Infect.lmmun.66:394-7)或CTX-KnΦ(基因组缺少ctxA的噬菌体(参见，例如，Science 272(5270):1910-4)(在LB中于30℃下生长至OD₆₀₀为1.0)的霍乱弧菌O395菌株的上清液浓缩(约50倍；Ultracel-100K离心过滤器，MILLIPORE)并过滤(0.22μm过滤器，MILLIPORE)以得到无细胞的噬菌体上清液。为了在正在测定CTXΦ敏感性的菌株中诱导TCP(噬菌体受体)的表达，将过夜的LB培养物以1：100的比例反稀释至16×150mm玻璃培养管中的10mL的AKI中，并在37℃下在不摇动的情况下孵育4小时。然后将除1mL的培养物以外全部弃去，然后将培养物移至振荡器(250rpm)在37℃下再放置2小时进行有氧培养。将受体培养物离心洗涤一次，与噬菌体上清液以2：1进行混合，然后在室温下孵育20分钟。然后将系列稀释液铺在LB和LB+卡那霉素(100μg/mL)琼脂平板上，并且转导效率计算为(CFU/mL)Kan₁₀₀/(CFU/L)_LB。

HaitiWT-Tn文库的生成

将带有pir依赖性Himar转座子载体pSC189(Chiang和Rubin(2002)Gene296(1-2):179-85)的大肠杆菌SM10λpir与受体HaitiWT缀合以产生转座子***文库。将每个菌株的过夜培养物在37℃下进行有氧培养，然后在37℃下在培养基中以1：100稀释。经过4个小时的生长，将每种培养物4mL沉淀，并用LB洗涤一次。然后将培养物以1：1的比例混合，沉淀并重悬于800μL的LB中。将50μL的混合物点样到LB琼脂平板上的0.45μm过滤器中，共进行16次缀合反应。将反应在37℃下孵育4小时，然后将过滤器在LB中涡旋振荡(1mL/过滤器)，以重新悬浮附着的细菌。将悬浮液铺在245mm²的LB+Sm/Kan琼脂平板上以选择霍乱弧菌转移接合子(trans-conjugant)(2mL的悬浮液/平板)。将板在30℃下孵育过夜以计数细菌菌落。该文库由～300,000个菌落组成，并刮入LB+25％甘油中。将OD₆₀₀调节至约10，并将等分试样储存在-80℃下以供下游使用。

幼兔感染研究

幼兔研究是根据布莱根妇女医院动物委员会(the Brigham and Women’sHospital Committee on Animals)批准的方案(机构动物护理和使用委员会方案编号2016N000334，动物福利保证合规编号A4752-01)并根据美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用指南以及美国农业部的动物福利法中的建议进行。

为了准备用于接种的细菌，将过夜培养物在100mL的LB中按1：100稀释，并在37℃通气下培养直至对数后期(OD₆₀₀为0.5至0.9)。通过在6,000rpm下离心将约2×10¹⁰CFU沉淀，除去上清液，并将细胞沉淀重悬于10mL的2.5％碳酸氢钠溶液(100mL的水中加入2.5g；pH9.0)中，使最终细胞密度约为2×10⁹CFU/mL。对于共感染研究，通过在6,000rpm下离心将约1×10¹⁰CFU沉淀，除去上清液，将细胞沉淀重悬于5mL的2.5％碳酸氢钠溶液中，合并所得悬浮液，以形成1：1混合物，细胞密度约为2×10⁹CFU/mL。对于使用HaitiWT转座子文库的研究，将1mL的文库冷冻原液(OD₆₀₀＝10)转移至100mL的LB中，以使初始OD₆₀₀为0.1。然后在37℃通气下将文库培养至OD₆₀₀为0.8(约2小时)，并如上所述在2.5％的碳酸氢钠溶液中制备约2×10⁹CFU/mL的细胞悬浮液。制备***灭活的疫苗需要以下额外步骤：将细胞沉淀重悬于8mL的10％***中，将***悬浮液在6,000rpm下离心，除去上清液，将细胞重悬于5倍体积的1×磷酸盐缓冲盐水(40mL的1×PBS)洗去多余的***，将PBS悬浮液在6,000rpm下离心，除去上清液，并将细胞重悬于10mL的2.5％碳酸氢钠溶液中。该程序消除了所有活(viable)的霍乱弧菌。对于所有实验，将最终的细胞悬液在1×PBS中连续稀释，一式三份铺板在LB+Sm/X-Gal上，并在30℃下孵育过夜以计算精确剂量。对于共同感染研究，HaitiV中lacZ的破坏使得分别计数HaitiWT和HaitiV CFU，蓝色和白色菌落。对于使用HaitiWT转座子文库的研究，将约2×10¹⁰CFU的文库接种物铺板在LB+Sm200/Kan50上，并在30℃下过夜孵育，以生成用于后续统计比较的代表性文库接种物样品。

如先前所述(Ritchie等人(2010)MBio.1(1):e00047-10)进行幼兔感染，并进行下述细微改动。所有实验均使用1-4天大的新西兰白兔进行，在所有研究的期间，将动物与同窝出生仔和泌乳母畜共同饲养，其长度根据评估的表型而异。动物从Pine Acre兔场(Norton,MA,USA)和加拿大查尔斯河两者任一个中获得，并且两家供应商的动物的表型一致。动物研究总是使用窝内对照进行，来最小化窝内之间变异的影响。HaitiWT和HaitiV菌落定殖的初步研究(图4A-C)在腹膜内注射盐酸雷尼替丁(2μg/g体重)以降低胃酸度之后进行，然而，由于这种处理对HaitiWT或HaitiV定殖没有明显影响，因此所有后续研究均省略了该处理。将所有动物通过使用5号法国导管(Arrow International，Reading，PA，USA)用约10⁹CFU(500μL的2×10⁹CFU/mL的细菌悬浮液)进行口胃接种。将一天大的动物用于单次接种和共同接种研究。这些动物通常在接种后约18小时接受安乐死；然而，HaitiV定殖的纵向研究通过接种1日龄的动物并在接种后约90小时内监测其状况而进行。为了进行连续接种研究，将1日龄的动物用以下3种处理之一进行接种：“模拟”–500μL的2.5％碳酸氢钠溶液，“灭活疫苗”–500μL的2×10⁹CFU/mL的***灭活的HaitiV的悬浮液，或“活疫苗”-500μL的2×10⁹CFU/mL的HaitiV的悬浮液。24小时后，将相同的动物用约10⁹CFU(500μL的2×10⁹CFU/mL的攻击菌株悬浮液：HaitiWT：图5A、5B、6A-C；N16961：图5C；或HaitiTn：图5D和5F)接种。对于报告细菌负载的顺序接种研究，动物在攻击后约18小时接受安乐死，图6C除外。

尸检时，将整个肠道切除，盲肠液通过使用26-½计量注射针提取，并转移至预先称重的Eppendorf管中。将末端小肠的2-3cm切片以及整个盲肠放入预先称重的均质管中，该均质管中装有1mL的无菌PBS和两个3.2mm的不锈钢珠(BioSpec Products Inc.,Bartlesville,OK,USA)，将所有填充的管称重。从盲肠中回收的流体质量除以盲肠质量，以获得流体蓄积率(FAR)。将含有组织的试管在mini-beadbeater-16(BioSpec ProductsInc.，Bartlesville，OK，美国)上均质化2分钟，在1×PBS中连续稀释，然后铺板。将板在30℃下过夜孵育，并将观察到的菌落数除以适当的稀释比和相应组织/流体样品的质量，以产生CFU/g组织的量度。将匀浆铺板在LB+Sm200/X-Gal60上以计算总负载(即HaitiWT+HaitiV)，铺板在LB+SXT上以仅计算HaitiWT的负载。对于共同接种或顺序接种研究，除非HaitiV的负载与HaitiWT相当(即100倍以内)，否则缺少HaitiV特异性可选择的标记会阻止HaitiV CFU的计数。类似地，对于利用对SXT敏感的N16961 WT菌株进行的研究，将LB+Sm200/X-Gal60上的蓝色菌落数量用来计数WT的负载。对于共同接种研究，竞争指数计算如下：

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对于使用HaitiWT转座子文库的研究，远端小肠的末端10cm在尸检时获得，称重并如上所述进行均质化。将匀浆在1×PBS中连续稀释，并铺板在LB+Sm200/X-Gal60上以计数总负载，并铺板在LB+Sm200/Kan50上以计数HaitiTn的负载。将剩余的900μL的未稀释的组织匀浆铺板在LB+Sm200/Kan50上以回收体内通过的HaitiTn文库的代表性样品，该样品用于后续的转座子***位点分析。

在疾病进展研究中，未报告处于疾病的濒死状态的动物的定殖数据，因为在这些研究中，接种和安乐死之间的间隔存在很大差异，这很可能会影响细菌负载。相反，在评估特征为可见的腹泻(腹面染色)、脱水(皮肤***)、体重减轻、嗜睡(最小运动)和体温下降(摸起来冷)的濒死状态时对动物实施安乐死。这些评估是以对动物是否接受灭活疫苗还是活疫苗不知情的方式进行的。一只动物发展为濒死状态而没有表现出可见的腹泻，这解释了图6A和6B之间样品大小的差异)。

转座子***测序分析

转座子***文库的特征在于大规模平行测序；如先前所述(参见Pritchard等人(2014)PLoS Genet.10(11):e1004782)，对序列数据进行处理并将其定位至霍乱弧菌H1基因组(参见，例如，Bashir等人(2012)Nat.Biotechnol.30(7):701-7)。使用ARTIST管线(pipeline)将复杂度更高的文库(>30,000种独特的基因型)与输入文库进行比较。使用100,000bp窗口的LOESS校正对数据进行原点邻近校正。使用Con-ARTIST基于多项分布的随机抽样(n＝100)，将接种物数据集相对于肠道数据集进行独立归一化。Con-ARTIST的Mann-Whitney U函数的修改版本用于将肠道数据集与其100个模拟对照数据集进行比较。应用平均信息点阈值>5|Log₂(平均倍数变化)|>1，平均反向P值>100，以鉴定相对于接种物的肠道数据集中相应***突变体显著富集或缺失的基因座。

霍乱爆发建模

根据先前研究(Azman(2015)PLoS Med.12:e1001867)改编的我们的模型在图10A中进行图示描述。用于疾病传播的参数先前已经公开(图10B)。将疫苗投放进行建模，如以在活动期间(图6D、11B中为7天；图11A中天数发生变化)每天以恒定的剂量进行接种，直到总人口的70％完成接种。当有症状的病例数(估计为先前易感群体中总感染的25％；参见Jackson等人(2013)Am.J.Trop.Med.Hyg.89:654–64)超过阈值(图6D、11A中为1,000人；图11B中人数发生变化)时，就会触发活动。用于模拟的传输速率(β)是在假设基本生殖(R₀)数在1至5的范围内计算的，与先前的霍乱爆发相符，R₀＝β/γ。与先前的建模研究(Azman等人(2013)J.Infect.66:432-8)一致，家庭传播研究中估计的平均传染性持续时间(1/γ)是假定的(Weil等人(2009)Clin.Infect.Dis.49:1473-9)。为了比较使用快速疫苗(如HaitiV)与具有相同的抗感染功效的作用较慢的替代品的影响，在接受单剂量疫苗后，开始保护的平均时间为1天与10天(1/τ)是假定的。将使获得率降低了70％(θ)的疫苗作用的“泄漏”模式进行建模。使用ode45函数在MATLAB R2016b(Mathworks，Natick，MA)中求解常微分方程，其初始条件是其他易感群体中的单个暴露个体。对于此模型，微分方程***为：

λ＝β(f_U+I_V+f_p)/N

/>

结果

用作活减毒疫苗的基因工程化的霍乱弧菌细菌菌株HaitiV的产生

产生九种不同的修饰以获得(derive)新疫苗HaitiV(表5)，并且使用全基因组测序来确认存在突变。将突变工程化以确保在霍乱疫苗中达到前所未有的程度的生物安全性，同时保持HaitiV的肠道菌落定殖能力，从而像野生型霍乱弧菌和一些先前试验过的活疫苗候选物一样(Cohen等人(2002)Infect.Immun.70:1965-70；和Chen等人(2016)Clin.Infect.Dis.62(11):1329-35)，单次口服剂量后可能会产生长期免疫力。为确保HaitiV的安全性，我们去除了编码霍乱毒素(CT)的噬菌体(CTXΦ)(Waldor和Mekalanos(1996)Science 272(5270):1910-4)(图1)，病原体的主要毒力因子和为产毒逆转提供了严格的障碍。CTXΦ缺失的边界导致去除了其染色体整合所需的序列，以及编码多功能MARTX毒素的基因rtxA(参见Fullner等人(2002)J.Exp.Med.195(11):1455-62)。此外，HaitiV缺乏hupB，这是CTXΦ游离型维持(episomal maintenance)的必需基因(参见Martinez等人(2015)PLoS Genet.11(5):e1005256)。HaitiV也编码特异性靶向毒素基因ctxA的CRISPR/Cas9***。携带完整ctxA的CTXΦ无法感染带有该***的疫苗，而缺少ctxA的CTXΦ变体则没有这种感染屏障(图3A-3C)。额外的疫苗工程包括以下步骤：1)通过缺失霍乱弧菌的5个鞭毛蛋白来降低潜在的疫苗反应原性(参见Rui等人(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107(9):4359-64)；2)消除疫苗转移基因的能力，赋予位于SXT整合结合元件(ICE)内的抗生素抗性(图2)；3)使疫苗产生CT的无毒B亚基(图7)，可引发预防由产肠毒素大肠杆菌以及霍乱弧菌引起的腹泻疾病(Kauffman等人(2016)MBio.7(6):e02021-16)；4)通过缺失recA最小化潜在的基因获得，从而显著降低菌株的DNA重组能力。表5总结了HaitiV活减毒霍乱疫苗的遗传改变。

表5.示例性的HaitiV活减毒霍乱疫苗中存在的遗传改变

HaitiV是减毒霍乱弧菌菌株

经口胃接种的HaitiV与其源自的野生型霍乱弧菌分离菌株(在本文中称为HaitiWT)的比较研究在幼兔中进行，小动物模型概述了人类霍乱的许多方面，包括快速死亡率(参见Ritchie等人(2010)MBio.1(1):e00047-10)。用HaitiWT接种的所有动物在接种后18小时(18HPI)都发展为濒死状态。尸检后，这些动物的盲肠充满流体(图4A)，先前已经发现类似于ctxAB依赖性胆汁性腹泻(参见Ritchie等人(2010))。与之形成鲜明对比的是，在18HPI，很少或没有流体蓄积在用HaitiV接种的同窝幼仔的盲肠中(图4A)。在延长至90HPI的观察期内，用HaitiV接种的动物没有出现霍乱样疾病，尽管在极少数情况下，动物表现出轻度和自限性的非霍乱性腹泻。用HaitiV接种的动物持续增加体重直到90HPI时，这进一步表明HaitiV接种对动物的整体健康或发育无害(图4B)。

对HaitiWT或HaitiV接种的不同应答与这两种菌株在肠道定殖之间的差异无关。在18HPI时，在用HaitiV或HaitiWT接种的同窝仔之间，远端小肠霍乱弧菌定殖没有显著差异(图4C)。HaitiV负载显示在90HPI时没有降低(图4C)，表明延长的HaitiV的肠道定殖不会引起疾病。尽管通过HaitiV和HaitiWT进行的肠道定殖水平在单次接种实验中在统计学上无法区分，但是当将动物与HaitiWT和HaitiV的1：1混合物共同接种时，野生型菌株胜过疫苗菌株(图4D)。HaitiV的定殖与Peru-15密切相关的菌株的定殖相当(参见Rui等人(2010))，所述Peru-15密切相关的菌株是一种较早的活霍乱疫苗候选者，被发现是安全的并且以单剂量赋予保护性免疫力(参见Cohen等人(2002))；因此，单剂量的HaitiV有望促进保护性适应性免疫。

用HaitiV接种诱导对毒力霍乱弧菌菌株HaitiWT的保护性应答

鉴于HaitiV强且长期占有肠道，因此进行了实验以确定甚至在适应性免疫应答发生之前，例如由于病原体肠道生态位的改变，HaitiV定殖的动物是否会表现出对HaitiWT定殖的抵抗。用HaitiV(活疫苗)、***灭活的HaitiV(灭活疫苗)和缓冲液对照(模拟)三者任一个接种动物，然后在24小时后用致死剂量的HaitiWT攻击。缓冲液和***组中的动物在HaitiWT攻击后出现严重的霍乱样疾病，这些动物中HaitiWT的肠道负载类似于未经预处理的那些(图5A、5B和4C)。相反，在接受HaitiWT攻击后的18小时内，接受活疫苗的动物没有表现出严重疾病的迹象，且与先前用灭活疫苗接种的动物相比，从先前用活疫苗接种的动物的肠道中回收的HaitiWT水平较低(图5B)。在先前用活疫苗接种的动物中，HaitiWT负载的减轻幅度各不相同，均低于两只动物的检出限。活疫苗对HaitiWT定殖的拮抗作用(即定殖抗性)似乎取决于先前用HaitiV的接种；在同时而不是顺序用两种菌株接种的动物中观察到HaitiWT的正常负载(图4E和图5B)。

为了评估定殖抗性的特异性，重复疫苗研究，用霍乱弧菌N16961进行攻击，霍乱弧菌N16961是在霍乱疫苗功效研究中施用于人类志愿者的一种早期El Tor菌株(参见Chen等人(2016)Clin.Infect.Dis.62(11):1329-35)。重要的是，海地和N16961菌株是独立分离的并且具有不同的血清型(参见Chin等人(2011)N.Engl.J.Med.364(1):33-42)。用活HaitiV而不是灭活HaitiV接种的动物也表现出对N16961 WT攻击的定殖抗性(图5C)，表明HaitiV介导的定殖抗性既不是菌株特异性也不是血清型特异性。

鉴于用HaitiV接种的动物中低水平的HaitiWT负载，疫苗的肠道占用可能会干扰攻击菌株定殖所需的过程。因此，进行了正向基因筛选，以鉴定允许HaitiWT抵抗或逃避疫苗介导的拮抗作用的突变。这种突变可以提供对HaitiV介导定殖抗性机制的见解，并预测赋予HaitiWT适应性优势，特别是在HaitiV定殖的肠道中。在没有预处理(单次接种，图5D和5E)或用活疫苗接种后24小时(连续接种，图5F和5G)的情况下，用合并的HaitiWT转座子***文库(HaitiTn)攻击动物。在没有预处理的情况下的HaitiTn定殖与先前用模拟治疗或灭活疫苗接种的动物的HaitiWT定殖没有区别(图5D与图5A和5B)。另外，在疫苗预处理的动物中HaitiTn定殖的范围概括了在顺序接种HaitiV和HaitiWT后观察到的高度可变的HaitiWT负载(图5F与图5B)。

为了鉴定富集的突变体，将从远端小肠回收的HaitiTn的转座子接头进行测序，并对未经预处理(图5)或在HaitiV接种后(图5G)受到HaitiTn攻击的动物中进行突变体丰度的全基因组比较。为了确保必要的统计能力，分析限于由足够多样的HaitiTn群定殖的动物，其每个基因涵盖多个独立的破坏(单次接种为兔r3-r6，连续接种为兔r4-r7)。值得注意的是，破坏cqsS和hapR(弧菌特异性群体感应(QS)途径的组分)的***在多只动物中富集，而与预处理无关(图5E和5G，图8A-9D)。在高细胞密度下，QS下调毒力和定殖因子的表达(Rutherford和Bassler(2012)Cold Spring Harb.Perspect.Med.2(11):pii:a012427；Zhu等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:3129-34；Duan和March(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:11260-4；和Hsiao等人(2014)Nature 515:423-6)，以及对这种抑制视而不见的cqsS和hapR突变体的富集表明QS途径限制了HaitiWT在肠道中的生长。相应的QS突变体富集未在紧密相关的霍乱弧菌分离菌株的类似分析中鉴定到(Kamp等人(2013)PLoS Pathog.9:e1003800)，这表明QS在变体El Tor菌株的发病机理中可能起着独特的作用。全基因组筛选未能鉴定出在疫苗定殖的动物中一致且特异地富集的任何突变体，这表明单一的功能丧失突变不太可能使HaitiWT抵抗或逃避疫苗介导的拮抗作用。

在上述实验中利用的HaitiTn文库固有的遗传多样性可以评估HaitiV介导的定殖抗性是否与霍乱弧菌在体内遇到的感染瓶颈严重程度的变化有关(Abel等人(2015)(2015)Nat.Methods 12:223-6；Abel等人(2015)PLoS Pathog.11:e1004823)。从肠道中回收的霍乱弧菌源于细菌接种物随机收缩后持续的原有生物群(Abel等人(2015)Nat.Methods 12:223-6)。该感染瓶颈的严重程度可以通过从肠道中回收的独特的转座子***突变体的数量来评估(Chao等人(2016)Nat.Rev.Microbiol.14:119-28)。将先前用活疫苗接种的一部分动物用相对少的独特***突变体定殖，并显示出低的HaitiTn负载(图5F，兔r1-r3)，这表明在某些情况下，HaitiV介导的定殖抗性与高限制性感染瓶颈有关。重要的是，从低多样性动物中回收的突变体之间没有重叠，这表明在某些HaitiV接种的动物中观察到的限制性感染瓶颈是随机的且与基因型无关。在疫苗似乎没有造成瓶颈的动物中，也观察到了减少的定殖(图5F，兔r4-7)。在疫苗定殖的动物中观察到的可变瓶颈，以及无法鉴定对疫苗拮抗作用具有抗性的突变体，突显了定殖抗性的潜在机制可能是复杂的和/或多因素的。然而，疫苗定殖的动物在受到攻击后，HaitiWT的负载较低且没有严重疾病，这表明用HaitiV接种可足以预防霍乱样疾病。

HaitiV在施用后24小时内诱导预防毒力霍乱弧菌菌株HaitiWT

为了量化针对霍乱样疾病的HaitiV依赖型的保护，将幼兔用活疫苗或灭活疫苗接种，在24小时后用HaitiWT攻击，并定期监测以评估其状况。用灭活疫苗接种的所有动物都出现腹泻(中位发作时间为15小时)，并在HaitiWT接种后29小时(中位时间为18.8小时)内发展为濒死状态(图6A)。与之形成鲜明对比的是，用活疫苗接种的动物出现腹泻的速度明显减慢(中位时间为28.3小时；一只动物没有出现明显的腹泻)，并且在致死性攻击后存活时间(中位时间>41.3小时；图6A)和腹泻发作后的存活率(＞13小时，而对照动物为5小时；图6B)显示显著的增加。另外，尽管在所有动物中都可检测到HaitiWT定殖，但在致死性攻击后40小时结束研究时，有4只用活疫苗接种的动物仍未处于濒死状态(图6A和6C)。因此，即使在没有绝对定殖抗性的情况下，HaitiV仍可预防疾病。HaitiV诱导的定殖抗性和疾病保护的迅速性，以及在幼仔感染模型中观察到这些表型，与疫苗引起的适应性免疫保护不一致。相反，数据显示HaitiV在肠道中定殖并介导针对霍乱的存活能力依赖性保护，这些特性与益生菌剂的定义相一致(参见Hill等人(2014)Nat.Rev.Gastroenetrol.Hepatol.11:506-514)。

为了研究HaitiV的快速保护会如何影响反应性疫苗接种活动，对先前发布的易感群体霍乱爆发的数学模型进行修改，该模型优先考虑反应性OCV干预的流行环境(Azman(2015)PLoS Med.12:e1001867；Reyburn等人(2011)PLoS Negl.Trop.Dis.5:e952)。对数学模型的修改(图10A)允许计算在1天(快速疫苗–基于图5A-5G、6A和6B中的观察结果)或10天中(慢速疫苗-当一些灭活OCV受体表现出杀弧菌滴度时(Matias等人(2016)PLoSNegl.Trop.Dis.10:e0004753)给予平等保护等级的疫苗的效果。各种不同的模型参数显示快速疫苗相对于慢速疫苗的最大益处是在与近期爆发(R0：1.5至3)和快速疫苗施用(图10B、11A和11B)的传播动力学相一致的情况下发生的。这些模拟显示，与慢速疫苗相比，同样有效的快速疫苗可以通过防止在慢速疫苗施用和保护性免疫出现之间的时间窗内可能获得的感染，避免了100,000的群体中的另外的20,000个感染(图6D)。

本文提供新的活减毒霍乱疫苗候选物HaitiV的设计和表征。上面的研究表明，HaitiV不能抵抗产毒逆转，并且在霍乱动物模型中定殖，而不会引起霍乱样疾病或其他不良影响。幼兔模型非常适合上面报道的肠道定殖和疾病进展研究。这项研究受限于表征不佳的肠道菌群和幼兔适应性免疫能力，这限制了对该***中HaitiV的作用机理和免疫原性的进一步研究。没有强大的动物模型来研究针对霍乱的适应性免疫；与以前的霍乱疫苗一样，评估HaitiV引起的适应性免疫应答将需要人类志愿者研究。令人鼓舞的是，在同一模型中，HaitiV的定殖与Peru-15密切相关的菌株的定殖相当(Rui等人(2010)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 107(9):4359-64)，较早的活霍乱疫苗候选物在人类中是安全的，并且以单剂量赋予保护(Cohen等人(2002)Infect.Immun.70:1965-70)，即使是5岁以下不受灭活OCV保护的儿童(Qadri(2007)Vaccine 25:231–8。令人惊讶的是，发现HaitiV在施用后24小时内赋予保护，这一间隔与适应性免疫不一致，并且在现有疫苗中是空前的。值得注意的是，这些影响需要使用有活性的HaitiV；***灭活的HaitiV不提供对疾病的急性保护，这表明快速保护需要益生菌作用，而这种作用不太可能由灭活的OCV引起。人体攻击研究是一种完善的***，用于评估OCV引起的适应性免疫保护(Chen等人(2016)Clin.Infect.Dis.62(11):1329-35和Cohen等人(2002)Infect.Immun.70:1965-70)。如在幼兔模型中观察到的那样，并入其他急性攻击(例如，在疫苗接种后24小时内)将阐明OCV保护的发作和持续时间，从而评估HaitiV或其他OCV是否在适应性免疫应答之前就引起保护。

尽管HaitiV急性保护的潜在机制可能很复杂，需要进一步阐明，但这项研究中描述的数学建模表明，在霍乱流行期间进行反应性疫苗接种的情况下，HaitiV快速保护的公共卫生影响可能具有变革性。相对于对照，腹泻发作后，用致死剂量的HaitiWT攻击的经HaitiV接种的动物存活时间更长，显示出HaitiWT定殖的较低水平，并且在某些情况下，完全预防霍乱。HaitiV引起疾病进展的延迟表明，用HaitiV接种后感染致病性霍乱弧菌的个体在症状发作后可能有更多时间接受挽救生命的治疗。从症状发作到施用治疗经过的时间通常是霍乱爆发期间病死率的决定因素，因为补液疗法足以防止几乎所有有症状的个体死亡(Farmer等人(2011)PLoS Negl.Trop.Dis.5:e1145)。此外，由HaitiV而不是由***灭活的HaitiV介导的定殖抗性表明，用HaitiV接种可以减少产毒霍乱弧菌向环境中的散播，而这种传播途径是爆发的延续。尽管HaitiV对传播的潜在影响并未纳入建模研究中，但传播的减少可能会增强HaitiV对爆发控制的已经产生的巨大影响。总体而言，上述研究表明，益生菌疫苗在介导对疾病的快速保护的同时引起适应性免疫，可以构成一类新型的治疗方法，对爆发控制具有变革性的影响。

实施例2.HaitiV诱导小鼠中的杀弧菌抗体应答和抗OSP抗体

HaitiV在小鼠中诱导杀弧菌抗体应答

为了确定用HaitiV接种是否会诱导杀弧菌抗体应答，将C57BL/6和Swiss-Webster小鼠用HaitiV和源自霍乱弧菌细菌菌株CVD103-HgR的自发链霉素抗性突变体(在本文中称为CVD103-HgR*(对照))两者任一个接种。目前批准CVD-103HgR(Vaxchora^TM；PaxVax,Inc.,Redwood City,CA,USA)用于预防成年旅行者中由霍乱弧菌O1引起的霍乱。血清杀弧菌活性通过使用体外微稀释测定法进行分析，以评估补体介导的霍乱弧菌PIC018(Inaba血清型)或PIC158(Ogawa血清型)的细胞裂解。如图12A-12D所示，在最初用HaitiV和CVD103-HgR*两者任一个接种后7天，在从小鼠收集的血清中观察到稳健的杀弧菌应答。

在用HaitiV接种的小鼠中，抗OSP IgA和IgG滴度随时间增加

为了确定用HaitiV的接种是否会诱导针对O抗原特异性多糖(OSP)的抗体应答，用HaitiV和CVD103-HgR*(对照)两者任一个接种C57BL/6和Swiss-Webster小鼠，并且将针对Ogawa来源的OSP和Inaba来源的OSP两者任一个的抗OSP IgA和抗OSP IgG抗体的丰度使用ELISA来测定。如图13A-13D和14A-14D所示，抗OSP IgG和IgA抗体的丰度随时间增加。与用CVD103-HgR*接种的小鼠相比，用HaitiV接种的小鼠对Ogawa来源的OSP表现出更明显的IgG应答。

材料和方法

在该实施例中使用以下材料和方法。

为了产生CVD103-HgR的链霉素抗性菌株(Vaxchora^TM；PaxVax,Inc.,RedwoodCity,CA,USA)，将细菌菌株接种至5mL的LB液体培养基中，并在37℃下通气(250rpm)培养过夜。将1mL过夜培养物铺板于LB琼脂+链霉素(1000μg/mL)上，并在37℃下过夜孵育。LB琼脂+链霉素(1000μg/mL)上产生的菌落被认为是CVD103-HgR的自发抗链霉素抗性突变体，以下称为CVD103-HgR*。

HaitiV免疫原性研究是使用研究期间的BL-2动物设施内的雌性无菌C57BL/6小鼠(n＝7，马萨诸塞州宿主微生物中心)和雌性无菌Swiss-Webster小鼠(n＝6，塔康尼克农场)进行的。将HaitiV或CVD103-HgR*细菌重悬于2.5％碳酸氢钠溶液(pH 9.0)中，使其最终浓度为每mL10¹⁰个菌落形成单位(CFU/mL)。通过异氟烷吸入麻醉小鼠，并用100μL细菌悬浮液口服灌服(每只小鼠10⁹CFU)。初次免疫后第2、4、6、14、28和42天重复此程序。每天监测小鼠的疾病迹象，并在每次免疫接种前每4-5天称重。在每次称重时均获得粪便颗粒，并将颗粒在1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)中均质化，并将系列稀释液铺板在LB+链霉素(200μg/mL)上，以计数HaitiV的粪便负载。对于C57BL/6组，在免疫后第7、14、28和42天通过尾静脉切口获得血液样本。对于Swiss-Webster组，在免疫后1、7、14、28和42天通过尾静脉切口获得血液样本。使血液在室温下凝结1小时，在13,000rpm下离心5分钟，并收集上清液(血清)并在-20℃下保存以用于后续分析。

如先前所述通过霍乱弧菌PIC018(Inaba)或PIC158(Ogawa)的补体介导的细胞裂解的体外微稀释测定来进行杀弧菌抗体定量(Rollenhagen等人(2009)Vaccine 27(36):4917-22，和Tarique等人(2012)Clin.Vaccine Immunol.19(4):594-60，其每一个均通过引用并入本文)。据报道，与未添加血清的孔相比，杀弧菌应答为导致霍乱弧菌光密度降低50％的滴度(即血清稀释)。如Aktar等人(2016)Clin.Vaccine Immunol.23(5):427-35所述(其通过引用并入本文)，将针对Inaba和Ogawa O抗原特异性多糖(OSP)两者任一个的抗体应答通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行评估。数据表示为归一化应答，这是试验样品的ELISA信号与每个平板中包括的标准血清池的比率。

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其他实施方式

应理解，尽管已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。

Claims (23)

1.一种基因工程化的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)细菌，其包含：

(a)编码霍乱毒素亚基A的核酸序列中的缺失；

(b)编码Cas9核酸酶分子的异源核酸序列；

(c)编码指导RNA(gRNA)的异源核酸序列，其中所述gRNA包含与ctxA的靶核酸序列互补的靶向结构域；

(d)编码多功能自加工毒素重复序列(MARTX)毒素的核酸序列中的缺失；

(e)编码鞭毛蛋白的核酸中的缺失；和

(f)编码RecA蛋白的核酸序列中的缺失，

其中所述细菌源自属于El Tor生物型的亲本菌株。

2.根据权利要求1所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述编码霍乱毒素亚基A的核酸序列中的缺失位于整合至所述细菌的基因组中的ctxA基因中。

3.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的CTXΦ基因组的核心区域的核酸序列中的缺失。

4.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的CTXΦ基因组的RS2区域的核酸序列中的缺失。

5.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的CTXΦ基因组的完全缺失。

6.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述gRNA的核酸序列为5’-cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtcc

gttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’(SEQ ID NO：3)。

7.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中编码所述MARTX毒素的核酸序列选自由以下组成的组：rtxA、rtxB、rtxC、rtxD和rtxE。

8.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中编码所述鞭毛蛋白的核酸序列选自由以下组成的组：flaA、flaB、flaC、flaD和FlaE。

9.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌进一步包含编码DNA结合蛋白HU-β的核酸序列中的缺失。

10.根据权利要求9所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述编码DNA结合蛋白HU-β的核酸序列是hupB基因。

11.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含异源核酸，其中所述异源核酸包含可操作地连接至启动子的编码霍乱毒素亚基B的基因。

12.根据权利要求11所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述编码霍乱毒素亚基B的基因是ctxB基因。

13.根据权利要求11所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述启动子是诱导型启动子。

14.根据权利要求11所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述启动子是P_htpg启动子。

15.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述编码RecA蛋白的核酸序列是recA基因。

16.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含以下的一种或多种中的缺失：dfrA基因，其中所述dfrA基因编码赋予甲氧苄啶抗性的产物；sul2基因，其中所述sul2基因编码赋予磺胺甲噁唑抗性的产物；strAB基因，其中所述strAB基因编码赋予链霉素抗性的产物；和floR基因，其中所述floR基因编码赋予氯霉素抗性的产物。

17.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌源自Haiti亲本菌株，和/或为Inaba血清型、Ogawa血清型或Hikojima血清型。

18.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-17中任一项所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌和药学上可接受的赋形剂。

19.根据权利要求1-17中任一项所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌或根据权利要求18所述的药物组合物在制备用于通过以下方法在受试者中诱导针对霍乱弧菌的毒力菌株的保护性应答的药物中的用途，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-17中任一项所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌或根据权利要求18所述的药物组合物，从而在受试者中诱导针对霍乱弧菌的毒力菌株的保护性应答。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述受试者是人受试者。

21.根据权利要求19或20所述的用途，其中所述保护性应答在向所述受试者施用所述基因工程化的霍乱弧菌细菌或所述药物组合物的24小时内诱导。

22.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌或权利要求18所述的药物组合物，其用于在受试者中诱导针对霍乱弧菌的毒力菌株的保护性应答的方法。

23.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌或权利要求18所述的药物组合物，其用于治疗具有霍乱弧菌的毒力菌株的受试者的方法。