CN111505185A - 一种从红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法及其检测方法，采用正交试验设计及大孔树脂吸附纯化技术，优化芒果苷动态吸附与解吸纯化工艺参数，以HPLC法为检测手段，探讨以D101型大孔吸附树脂对芒果苷纯化效果的影响，本发明工艺方法稳定可行、操作简便，适用于红花龙胆中芒果苷的富集纯化，可为其今后生物活性的研究与产品开发利用提供参考，适用于红花龙胆芒果苷日后的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及中药活性成分分离纯化及检测领域，尤其涉及一种从红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法及其检测方法。
背景技术
红花龙胆(Gentiana rhodantha Franch.)又名小青鱼胆草，是龙胆科龙胆属多年生草本植物，为2015年版《中国药典》一部和贵州、四川、湖南地方标准收载品种[1-6]。全草入药，性味苦寒，具有清热除湿、解毒泻火、止咳之功效，临床上常用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、支气管炎等[7]。通过文献查阅分析，红花龙胆是芒果苷含量较高的植物之一，具有良好的抗氧化、抗结核杆菌、抗乙酰胆碱酯酶等活性，为芒果苷高含量的新资源[8-10]。现代药理学研究表明，芒果苷又名芒果素、知母宁，属双苯吡酮类化合物，具有良好的止咳、化痰、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性，这为涉及红花龙胆新药的研究与开发拓宽了思路[11-12]。近年来，芒果苷成分的分离纯化研究日益备受关注[13-15]，以芒果苷为原料制成的芒果苷传递体制剂、外用乳膏、(碱性)环糊精包合物、磷脂复合物、多元芒果苷固体分散体等剂型更是应用普遍[16-17]，因此研究红花龙胆中芒果苷有效成分的富集、纯化工艺，对于红花龙胆产业升值和高值化利用具有长远的战略发展意义。
大孔吸附树脂是一种同时具备吸附及筛选功能的高分子聚合物，具有理化性质稳定、选择性好、易解吸附、再生效果好、价格便宜等优点，被广泛应用于中药活性成分的分离纯化[18-19]。
因目前未见关于红花龙胆中芒果苷在大孔吸附树脂上的吸附-解析行为的研究报道，不利于对红花龙胆药材的进一步开发利用，鉴于此，本发明团队采用正交试验设计及大孔树脂吸附纯化技术，优化芒果苷动态吸附与解吸纯化工艺参数，以HPLC法为检测手段，探讨以D101型大孔吸附树脂对芒果苷纯化效果的影响，以期为红花龙胆的深入开发利用提供理论指导。
发明内容
本发明的目的是提供一种从红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法。
本发明的另一目的是提供一种利用HPLC法测定红花龙胆中芒果苷的方法。
本发明所述的一种从红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法包括以下步骤：1) 红花龙胆干浸膏、上样液的制备；2)D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附； 3)D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附。
所述红花龙胆干浸膏、上样液的制备具体步骤为：精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入50～80％甲醇回流2～5次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3～1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入10～200mL水超声溶解20～40min，制备成质量浓度为 0.00750～0.0300g/mL的上样液，备用。
优选的，所述红花龙胆干浸膏、上样液的制备具体步骤为：精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入55～75％甲醇回流3～4次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3～1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入10～160mL水超声溶解25～35min，制备成质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液，备用。
进一步优选的，所述红花龙胆干浸膏、上样液的制备具体步骤为：取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入70％甲醇回流3次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.6g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入40mL水超声溶解30min，制备成质量浓度为 0.0150g/mL的上样液，备用。
所述D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附具体步骤为：
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于80～95％乙醇溶液浸泡15～30h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止(体积比1:5)，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:12～1:26的树脂柱中，加入质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液10～160mL，以0.4～1.2mL/min的体积流量动态吸附。
优选的，所述D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附具体步骤为：
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡24h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止(体积比1:5)，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:21的树脂柱中，加入质量浓度为0.0150g/mL的上样液40mL，以 0.8mL/min的体积流量动态吸附。
所述D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附具体步骤为：
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用4～16BV蒸馏水洗脱，然后用15～95％乙醇洗脱溶液3～15BV，以0.4～1.2mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至 250mL，即可。
优选的，所述D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附具体步骤为：
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用25％乙醇洗脱溶液6BV，以1.0mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即可。
本发明所述的一种利用HPLC法测定红花龙胆中芒果苷的方法包括以下步骤：
色谱条件的设定为：Thermo AQUASIL-C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，等度洗脱，等度洗脱程序为：0～ 35min，13％A，87％B，检测波长：240～280nm；柱温：20～30℃；流速：0.8～1.2mL/min；进样量：10μL；
对照品溶液的制备具体步骤为：取芒果苷对照品适量，精密称定，加40～70％甲醇溶液溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.75mg/mL的芒果苷对照品储备液，再分别吸取对照品溶液适量置于10mL量瓶中，加40～70％甲醇溶液配成0.001500，0.1875，0.3750，0.5625，0.7500mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备具体步骤为：1)取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入50～80％甲醇回流2～5次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3～1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入20～60mL水超声溶解20～40min，制备成质量浓度为0.00750～ 0.0300g/mL的上样液；
2)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于80～95％乙醇溶液浸泡15～30h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
3)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:12～1:26的树脂柱中，加入质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液30～50mL，以0.4～1.2mL/min的体积流量动态吸附；
4)动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用15～95％乙醇洗脱溶液3～15BV，以0.4～1.2mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至 250mL，即得供试品溶液；
HPLC法测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算质量含量。
优选的，本发明所述方法包括以下步骤：
色谱条件的设定为：Thermo AQUASIL-C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，等度洗脱，等度洗脱程序为：0～ 35min，13％A，87％B，检测波长：254nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；
对照品溶液的制备具体步骤为：取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.75mg/mL的芒果苷对照品储备液，再分别吸取对照品溶液适量置于10mL量瓶中，加50％甲醇溶液配成 0.001500，0.1875，0.3750，0.5625，0.7500mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备具体步骤为：
1)取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入70％甲醇回流3次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.6g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入40mL水超声溶解30min，制备成质量浓度为0.0150g/mL的上样液，即得供试品溶液；
2)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡24h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止(体积比1:5)，临用前用水置换出乙醇；
3)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:21的树脂柱中，加入质量浓度为0.0150g/mL的上样液40mL，以 0.8mL/min的体积流量动态吸附；
4)动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用25％乙醇洗脱溶液6BV，以1.0mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即得供试品溶液。
HPLC法测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算质量含量。
本发明所述的1BV＝18mL。
有益效果：
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、现有技术中未见关于红花龙胆中芒果苷在大孔吸附树脂上的吸附-解析方法的研究报道，不利于对红花龙胆药材的进一步开发利用，本发明团队采用正交试验设计及大孔树脂吸附纯化技术，优化芒果苷动态吸附与解吸纯化工艺参数，以HPLC法为检测手段，研究以D101型大孔吸附树脂对芒果苷纯化效果的影响，为红花龙胆的深入开发利用提供了理论指导。
2、本发明以红花龙胆中芒果苷的吸附率、解析率、得率为考察指标，在单因素试验基础上，采用正交设计原理结合大孔吸附树脂技术对红花龙胆药材进行醇提工艺的优化和分析，筛选出最佳的富集、纯化工艺条件。
3、本发明采用正交设计对芒果苷提取工艺的参数进行优化，确定D101大孔树脂纯化芒果苷的最佳工艺条件为：上样液浓度0.0150g/mL、上样体积流量为 0.8mL/min、上柱体积40mL、树脂径高比为1:21、以10BV水洗除杂，以解析体积流量为1.0mL/min的25％乙醇6BV洗脱。
4、在优选工艺条件下，红花龙胆芒果苷平均吸附率为96.47％，平均得率为21.71％(RSD为0.63％)，固形物减少至纯化前的五分之一，由0.60g减少至平均的0.12g，其平均解析率为75.22％，与最佳工艺的结果相近，且芒果苷转移率均达到70％以上，结果表明优选的D101大孔树脂富集工艺条件合理、可行、稳定，有利于红花龙胆药材的进一步开发利用。
5、采用D101大孔吸附树脂在最佳工艺的条件下纯化芒果苷成分，对吸附、解吸纯化后红花龙胆中芒果苷成分进行HPLC分析，纯化后的芒果苷成分对比提取物纯化前的HPLC谱图，综合纯化前后芒果苷纯度分析，纯化前后芒果苷的得率提高了3.5倍，由6.15％提升到21.71％，根据归一化法计算纯化后芒果苷纯度，其峰面积占25％乙醇洗脱部位总峰面积的45.78％，证明经D101大孔树脂纯化后的芒果苷成分纯度有较大的提高，该工艺富集、纯化效果明显。
6、该工艺方法稳定可行、操作简便，适用于红花龙胆中芒果苷的富集纯化，可为其今后生物活性的研究与产品开发利用提供参考，适用于红花龙胆芒果苷日后的工业化生产。
附图说明
图1上样液质量浓度对芒果苷吸附率的影响
图2上样体积流量对芒果苷吸附率的影响
图3径高比对芒果苷吸附率的影响
图4 D101大孔树脂对芒果苷的动态吸附泄露曲线
图5水洗用量对芒果苷解析率的影响
图6乙醇浓度对芒果苷解析率的影响
图7乙醇洗脱用量对芒果苷解析率的影响
图8解析液体积流量对芒果苷解析率的影响
图9对照品(A)、纯化后(B)及纯化前(C)红花龙胆中芒果苷的HPLC图
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1
红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法：
1、红花龙胆干浸膏、上样液的制备
精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入70％甲醇回流3次， 1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.6g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入40mL水超声溶解30min，制备成质量浓度为 0.0150g/mL的上样液，备用。
2、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡24h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止(体积比1:5)，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:21的树脂柱中，加入质量浓度为0.0150g/mL的上样液40mL，以 0.8mL/min的体积流量动态吸附。
3、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用25％乙醇洗脱溶液6BV，以1.0mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即可。
实施例2
红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法：
1、红花龙胆干浸膏、上样液的制备
精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入50％甲醇回流2次， 1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入10mL水超声溶解20min，制备成质量浓度为 0.0300g/mL的上样液，备用。
2、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于80％乙醇溶液浸泡15h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止(体积比1:5)，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:12的树脂柱中，加入质量浓度为0.0300g/mL的上样液10mL，以 0.4mL/min的体积流量动态吸附。
3、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用4BV蒸馏水洗脱，然后用15％乙醇洗脱溶液3BV，以0.4mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即可。
实施例3
红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法：
1、红花龙胆干浸膏、上样液的制备
精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入80％甲醇回流5次， 1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入160mL水超声溶解40min，制备成质量浓度为 0.00750g/mL的上样液，备用。
2、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡30h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:26的树脂柱中，加入质量浓度为0.00750g/mL的上样液160mL，以 1.2mL/min的体积流量动态吸附。
3、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用16BV蒸馏水洗脱，然后用95％乙醇洗脱溶液15BV，以1.2mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即可。
实施例4
红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法
1、红花龙胆干浸膏、上样液的制备
精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入55％甲醇回流3次， 1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入30mL水超声溶解25min，制备成质量浓度为 0.0100g/mL的上样液，备用。
2、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于85％乙醇溶液浸泡15h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:15的树脂柱中，加入质量浓度为0.0100g/mL的上样液20mL，以 0.6mL/min的体积流量动态吸附。
3、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用6BV蒸馏水洗脱，然后用20％乙醇洗脱溶液6BV，以0.6mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即可。
实施例5
红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法
1、红花龙胆干浸膏、上样液的制备
精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入70％甲醇回流3次， 1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入120mL水超声溶解32min，制备成质量浓度为 0.0100g/mL的上样液，备用。
2、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于90％乙醇溶液浸泡15～30h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:12～1:26的树脂柱中，加入质量浓度为0.0100g/mL的上样液100mL，以1.0mL/min的体积流量动态吸附。
3、D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用12BV蒸馏水洗脱，然后用80％乙醇洗脱溶液12BV，以1.0mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即可。
实施例1-5红花龙胆中芒果苷的含量使用实施例6-8任一测定方法测定。
实施例6
利用HPLC法测定红花龙胆中芒果苷的方法：
色谱条件的设定为：Thermo AQUASIL-C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，等度洗脱，等度洗脱程序为：0～ 35min，13％A，87％B，检测波长：240nm；柱温：20℃；流速：0.8mL/min；进样量：10μL；
对照品溶液的制备具体步骤为：取芒果苷对照品适量，精密称定，加40～70％甲醇溶液溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.75mg/mL的芒果苷对照品储备液，再分别吸取对照品溶液适量置于10mL量瓶中，加40％甲醇溶液配成0.001500，0.1875，0.3750，0.5625，0.7500mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备具体步骤为：1)取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入50％甲醇回流2次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入2 0mL水超声溶解20min，制备成质量浓度为0.0150g/mL的上样液；
2)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于80％乙醇溶液浸泡15h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
3)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:12～1:26的树脂柱中，加入质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液30～50mL，以0.4～1.2mL/min的体积流量动态吸附；
4)动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用15～95％乙醇洗脱溶液3～15BV，以0.4～1.2mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至 250mL，即得供试品溶液；
HPLC法测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算质量含量。
实施例7
利用HPLC法测定红花龙胆中芒果苷的方法：
色谱条件的设定为：Thermo AQUASIL-C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，等度洗脱，等度洗脱程序为：0～35min，13％A，87％B，检测波长：280nm；柱温：30℃；流速：1.2mL/min；进样量：10μL；
对照品溶液的制备具体步骤为：取芒果苷对照品适量，精密称定，加70％甲醇溶液溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.75mg/mL的芒果苷对照品储备液，再分别吸取对照品溶液适量置于10mL量瓶中，加70％甲醇溶液配成 0.001500，0.1875，0.3750，0.5625，0.7500mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备具体步骤为：1)取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入80％甲醇回流5次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入 60mL水超声溶解40min，制备成质量浓度为0.0200g/mL的上样液；
2)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡30h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
3)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:26的树脂柱中，加入质量浓度为0.0200g/mL的上样液50mL，以 1.2mL/min的体积流量动态吸附；
4)动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用95％乙醇洗脱溶液15BV，以1.2mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即得供试品溶液；
HPLC法测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算质量含量。
实施例8
利用HPLC法测定红花龙胆中芒果苷的方法：
色谱条件的设定为：Thermo AQUASIL-C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，等度洗脱，等度洗脱程序为：0～ 35min，13％A，87％B，检测波长：254nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；
对照品溶液的制备具体步骤为：取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.75mg/mL的芒果苷对照品储备液，再分别吸取对照品溶液适量置于10mL量瓶中，加50％甲醇溶液配成 0.001500，0.1875，0.3750，0.5625，0.7500mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备：
1)取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入70％甲醇回流3次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.6g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入40mL水超声溶解30min，制备成质量浓度为0.0150g/mL的上样液，即得供试品溶液；
2)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡24h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
3)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:21的树脂柱中，加入质量浓度为0.0150g/mL的上样液40mL，以 0.8mL/min的体积流量动态吸附；
4)动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用25％乙醇洗脱溶液6BV，以1.0mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即得供试品溶液。
HPLC法测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算质量含量。
为了验证本发明的有效性，发明团队进行了一系列的试验，以选择最优的富集纯化方法及检测方法，具体如下：
实验目的：探讨红花龙胆芒果苷的大孔树脂富集、纯化工艺方法。
方法：运用动态吸附和解析工艺研究，采用单因素考察和正交试验设计法优选D101型大孔树脂纯化芒果苷的工艺参数，以HPLC法为检测手段，芒果苷解析率和得率为评价指标，通过测定纯化前后芒果苷的含量，考察各上样浓度、吸附体积流量、解析液体积分数纯化参数，确定芒果苷纯化的最佳工艺条件及检测方法。
1原料、试剂与仪器
1.1实验原料与试剂
红花龙胆药材，购自贵州健兴药业有限公司，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为龙胆科植物红花龙胆Gentiana rhodantha Franch.的干燥全草；芒果苷对照品(购自中国食品药品检定研究院，批号为111607-201704，纯度≥98％)；D101 型大孔吸附树脂(上海蓝学科技发展有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯(美国Tedia 公司)；磷酸为优级纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；其他试剂均为分析纯；实验用水为重蒸馏水。
1.2实验仪器
UltiMate-3000型高效液相色谱仪、AQUASIL-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，美国Thermo Fisher公司，ChromeleonTM色谱工作站；AG135型十万分之一电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500DE型超声器(昆山市超声仪器有限公司)；瑞士Buchi步琦R-215旋转蒸发仪(上海旦鼎国际贸易有限公司)。
2方法与结果
2.1红花龙胆干浸膏供试液的制备
取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入70％甲醇回流3 次，1h/次，合并3次提取液，过滤，减压浓缩得浸膏约71.28g(提取率为22.28％)。称取0.15g醇提浸膏，加入70％甲醇溶液超声溶解并定容于10mL量瓶中，制备成质量浓度为0.015g/mL的上样液，备用。
2.2对照品溶液的制备
取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.75mg/mL的芒果苷对照品储备液，再分别吸取对照品溶液适量置于10mL量瓶中，加50％甲醇溶液溶解并定容至刻度，即得质量浓度分别为0.001500，0.1875，0.3750，0.5625，0.7500mg/mL的对照品溶液，备用。
2.3红花龙胆中芒果苷的定量测定
2.3.1标准曲线的绘制
分别精密吸取“2.2”项下芒果苷对照品溶液10μL注入高效液相色谱中，按“2.3.2”项下方法测定峰面积，以进样量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，计算得回归方程为：A＝82.548C-84.354，r＝0.9998，结果表明，芒果苷进样量在 0.015～7.5μg范围内与峰面积值呈良好的线性关系。
2.3.2样品中芒果苷的含量测定
取“2.1”项下制备的供试品溶液，依照2015年版《中国药典》一部收载红花龙胆质量标准中的芒果苷含量测定项下方法测定，色谱柱为Thermo AQUASIL-C18(250mm×4.6mm，5μm)，按标准曲线计算其芒果苷质量浓度及得率。
2.4 D101树脂对红花龙胆中芒果苷的动力学吸附分析
2.4.1大孔树脂的预处理、装柱
D101大孔树脂对芒果苷成分的吸附效果较好[20]，用蒸馏水将其装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡24h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水(体积比1:5)不变浑浊为止，临用前用水置换出乙醇，即可使用。
2.4.2上样液质量浓度对树脂动态吸附率的影响
称取7份预处理后的D101大孔吸附树脂约10g(湿质量，柱床体积约为18mL)，以湿法装柱于玻璃层析柱(16mm×340mm)，避免气泡产生，静置，树脂上层保留适当高度的水层，分别加入质量浓度为0.00750，0.0100，0.0125，0.0150，0.0 200，0.0250，0.0300g/mL的上样液各40mL，以2BV/h的体积流量上柱，加入蒸馏水于吸附柱中对其进行水洗，一起收集未吸附液与水洗液，计算上样液纯化后芒果苷的质量浓度及吸附率，计算公式为吸附率(％)＝[(C0V0-C1V1)/C0V0×100％，式中：C0：芒果苷初始浓度mg/mL，V0：上样体积(mL)，C1：未吸附液和水洗液中芒果苷的质量浓度(mg/mL)，V1：未吸附液和水洗液总体积(mL)，作上样液质量浓度与吸附率的关系曲线，各上样质量浓度下的吸附率见图1。结果表明D10 1大孔吸附树脂对红花龙胆中芒果苷的吸附率随着上样液质量浓度的加大而减小，当质量浓度为0.0150g/mL时，吸附达到饱和状态，当质量浓度为0.0300g/mL时吸附率最小，随着质量浓度的增加，位于树脂孔道内分子的扩散运动受到抑制，相应的杂质增加，与红花龙胆中芒果苷成分竞争吸附树脂的位点的作用也会越来越强，导致树脂对芒果苷的吸附率下降。故上样质量浓度选择0.0150g/mL，即可。
2.4.3吸附体积流量对树脂动态吸附率的影响
称取预处理好的D101大孔吸附树脂约10g，湿法装柱，取质量浓度为 0.0150g/mL的红花龙胆上样液40mL，加入吸附柱中，分别控制体积流量为0.4、 0.6、0.8、1.0、1.2mL/min上样，进行动态吸附试验，通过其吸附前后未吸附液与水洗液的芒果苷含量变化，计算该质量浓度下的芒果苷吸附率，确定最佳上样液流速，作上样液体积流量与吸附率的关系曲线，见图2。随着各上样体积流量的增大，树脂吸附率逐渐变小，流速太快有效成分可能还来不及扩散到树脂内部就已流出树脂柱，太慢则吸附时间较长，工作效率较低。当增至0.8mL/min时其吸附率变化不明显，考虑工作时效，故上样体积流量选择为0.8mL/min。
2.4.4树脂径高比对树脂动态吸附率的影响
称取4份等质量的湿树脂，每份约10g，分别装入径高比为1:12，1:15，1:21， 1:26的不同型号树脂柱中，分别取质量浓度为0.0150g/mL药液40mL，以0.8mL/min流速上样，加水洗涤至流出液无色，一起收集未吸附液与水洗液，置于恒重的蒸发皿中蒸干，测定固形物量及其芒果苷含有量，见图3。由图可知树脂柱越粗，上样液穿透能力较差，树脂与上样液接触时间相对较短，药液还未能充分吸附就流出孔径，其未吸附液与水洗液的固形物量及其芒果苷含有量增大，故选择高径比为1:21。
2.4.5 D101大孔树脂吸附动力学考察
取“2.1”项的上样液(0.0150g/mL)200mL，上样于18mL已处理好的D101 吸附树脂柱中(径:高＝1:21)，上样速度为0.8mL/min，每流出10mL作为1份流出液，共收集20份，分别加水补足至25mL量瓶，摇匀，按“2.3.2”项下操作测定并计算每份流出液中芒果苷的质量浓度，绘制吸附泄露曲线，见图4。结果表明上样液体积超过50mL时，芒果苷出现明显泄露，为了节省上样时间，提高树脂利用率，扣除第一份流出液，选择0.0150g/mL作为上样质量浓度，上样体积40mL。
2.5 D101树脂对红花龙胆中芒果苷的动力学解吸附分析
2.5.1水洗用量对树脂动态解析率的影响
装柱方法同“2.4.1”，将红花龙胆提取液(芒果苷质量浓度0.922mg/mL) 40mL，分别加入4，7，10，13，16倍柱体积(BV，1BV＝18mL)的水以0.8mL/min 流速洗脱，计算水洗液中芒果苷含有量，收集洗脱液置于恒重的蒸发皿中蒸干，测定固形物及解析液中芒果苷质量，见图5。随着水洗用量的加大，在提高芒果苷纯度的同时芒果苷具有一定的损失，加水量为10BV时能将大量水溶性杂质洗脱除去，且解析液中芒果苷质量最大，故选择水洗用量180mL进行除杂。
2.5.2解吸液体积分数对树脂动态解析率的影响
称取7份处理好的D101型树脂各10g，取最佳上样质量浓度的红花龙胆提取液(0.0150g/mL)40mL于柱中，以0.8mL/min速率上样，动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV水洗脱，再分别加入等体积的质量分数为15％，20％，25％，30％， 35％，60％，95％的乙醇溶液以0.8mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至 250mL，按照“2.3.2”项下方法测定其A值并计算芒果苷吸附率和解吸率，计算公式为解析率(％)＝[C2V2/(C0V0-C1V1)]×100％，C0：芒果苷初始浓度(mg/mL)， V0：上样体积(mL)，C1：未吸附液和水洗液中芒果苷的质量浓度(mg/mL)，V1：未吸附液和水洗液总体积(mL)，C2：醇洗液中芒果苷的质量浓度(mg/mL)，V2：醇洗液的体积(mL)，结果见图6。由图可知，随着乙醇体积分数的增加，解吸率呈先增加后降低，以30％、35％乙醇对红花龙胆中芒果苷的解析率影响较大，分别为86.02％、85.74％，而60％、95％乙醇洗脱液中芒果苷质量浓度很低，无法破坏树脂和其之间的吸附作用力，故选择30％乙醇对红花龙胆中的芒果苷进行洗脱。
2.5.3洗脱液用量对树脂动态解析率的影响
称取湿树脂10g装柱，5份，装柱方法同“2.4.1”，取0.0150g/mL药液40mL 上样，控制洗脱体积流量为0.8mL/min，先用蒸馏水10BV洗涤至流出液无色，然后用3、6、9、12、15BV30％乙醇洗脱，每份洗脱液分别收集并调整其体积至250mL，进行动态解吸试验，通过其解吸前后A值的变化，分别测定每份洗脱液芒果苷的质量浓度，计算吸附率及解析率，建立洗脱曲线，见图7。结果表明当洗脱液用量为6～8BV时，解吸率开始趋于稳定状态，随着洗脱液用量的增加其解析率变化不明显，表明此时树脂上吸附的芒果苷成分已充分洗脱，因此确定乙醇洗脱体积为6BV。
2.5.4解吸液体积流量对树脂动态解析率的影响
称取湿树脂10g装柱，5份，装柱方法同“2.4.1”，取0.0150g/mL药液 40mL上样，以0.8mL/min的流速进行吸附。待动态吸附结束后，用蒸馏水洗脱至近无色，用30％乙醇6BV以0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL/min的速度洗脱。依次收集洗脱液，并调整其体积至250mL，按照“2.3.2”项下操作测定芒果苷含量，计算芒果苷吸附率及解吸率，见图8。结果表明，解析率随冼脱流速的加快呈先增加后降低的趋势，在流速为0.6～1.0mL/min时洗脱效果好。洗脱流速直接影响到解析液和树脂的交换时间，流速太慢，操作周期长，生产成本高，流速太快，解析液与吸附树脂的接触时间减少，物质吸附-解析不充分，从而增加了操作成本和后续浓缩成本。综合考虑生产效率和洗脱效果选择解析流速为1.0mL/min。
2.6正交试验设计优化与分析
在单因素实验基础上，选取乙醇体积分数(A)、洗脱液用量(B)、上样流速(C)为影响因素，D为误差项，采用L9(34)正交设计实验设计3因素3水平表进行正交试验，见表1。具体方法：分别按上述实验设计进行提取，装柱，上样，吸附和洗脱，将洗脱液浓缩于恒重的蒸发皿中，并置于90℃烘箱干燥3h，称定各膏重，用相应乙醇溶解并定容至50mL的量瓶，摇匀，按照“2.3.2”项下操作测定解析液中芒果苷的得率，以考察上述因素对红花龙胆中芒果苷提取纯化的影响。
表1提取正交试验因素水平表
对表2的结果进行直观分析，再结合表3的方差分析结果，可以看出各因素极差大小顺序为A＞B＝C，且因素A(乙醇浓度)为主要影响因素，具有显著性差异，B，C因素无显著性差异。但在表2中优化的芒果苷解析率和得率之间，其指示出的最优化水平不一致，芒果苷得率以第1水平即乙醇体积分数/用量(25％/6BV) 最好，其得率及解析率分别为22.82％，73.85％；解析率以第3水平即体积分数/ 用量(35％/9BV)最好，其得率及解析率分别为16.55％，88.57％。从尽可能保留有效成分的角度，可选择3水平；从提高提取物中有效成分纯度及节约能源的角度，可选择1水平。为既满足一定的纯度要求，同时尽可能保留芒果苷成分，确定最优方案为A1B2C2，即25％乙醇洗脱液用量为6BV，吸附体积流量为0.8mL/min。
表2动态吸附L9(34)正交试验设计结果
注：*标注此列为空白列，用于估计实验误差
表3纯化工艺方差分析表
2.7乙醇提取工艺验证试验
为进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性，按优选最佳提取工艺条件进行3 次验证试验，结果见表4。从表中数据可知，采用此工艺，红花龙胆芒果苷平均吸附率为96.47％，平均得率为21.71％(RSD为0.63％)，固形物减少至纯化前的五分之一，由0.60g减少至平均的0.12g，其平均解析率为75.22％，与最佳工艺的结果相近，且芒果苷转移率均达到70％以上，结果表明优选的D101大孔树脂富集工艺条件合理、可行、稳定，有利于红花龙胆药材的进一步开发利用。
表4验证试验结果(n＝3)
2.8HPLC法分析吸附、解吸前后红花龙胆芒果苷提取物
采用D101大孔吸附树脂在最佳工艺的条件下纯化芒果苷成分，对吸附、解吸纯化后红花龙胆中芒果苷成分进行HPLC分析，纯化后的芒果苷成分对比提取物纯化前的HPLC谱图见图9，综合纯化前后芒果苷纯度分析，纯化前后芒果苷的得率提高了3.5倍，由6.15％提升到21.71％，根据归一化法计算纯化后芒果苷纯度，其峰面积占25％乙醇洗脱部位总峰面积的45.78％，证明经D101大孔树脂纯化后的芒果苷成分纯度有较大的提高，该工艺富集、纯化效果明显。
3分析与讨论
本试验以红花龙胆中芒果苷的吸附率、解析率、得率为考察指标，在单因素试验基础上，采用正交设计原理结合大孔吸附树脂技术对红花龙胆药材进行醇提工艺的优化和分析，筛选出最佳的富集、纯化工艺条件，试验比较了水及系列浓度乙醇的洗脱效果，结果表明水洗在去除部分极性杂质和提高芒果苷纯度的同时，对其芒果苷含量存在一定的损失，而25％～35％乙醇能较充分的进入树脂空隙中将吸附在树脂表面上的芒果苷溶解洗脱下来，该极性下目标成分的保留量与最终提取物中的含量(纯度)并非成正比，这取决于某一因素在某一参数水平位置时，目标成分和“杂质”成分量的大小及增减趋势[21]。由于芒果苷微溶于乙醇，溶于热稀乙醇，所以当乙醇体积分数超过90％时，芒果苷的溶解度反而减少，从而导致芒果苷洗脱效果不明显[15]。
大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构和选择性吸附功能的高分子材料，目前已广泛应用于黄酮类、皂苷类等有效成分的分离纯化，其分离效果受被分离物极性、树脂柱的清洗、分子体积、洗脱液的种类等因素制约，可避免物理、化学处理过程产生的有效成分损失或者生物活性降低问题[22-23]。本试验采用正交设计对芒果苷提取工艺的参数进行优化，确定D101大孔树脂纯化芒果苷的最佳工艺条件为：上样液浓度0.0150g/mL、上样体积流量为0.8mL/min、上柱体积40mL、树脂径高比为1:21、以10BV水洗除杂，以解析体积流量为1.0mL/min的25％乙醇6BV洗脱。在此条件下，D101大孔树脂纯化红花龙胆的中芒果苷的解析率为 75.22％，其转移率均达到70％以上，纯化前后芒果苷的得率提高了3.5倍，固形物量减少至纯化前的五分之一。该工艺方法稳定可行、操作简便，适用于红花龙胆中芒果苷的富集纯化，可为其今后生物活性的研究与产品开发利用提供参考。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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Claims (10)
1.一种从红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)红花龙胆干浸膏、上样液的制备；2)D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附；3)D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，红花龙胆干浸膏、上样液的制备具体步骤为：精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入50～80％甲醇回流2～5次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3～1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入10～200mL水超声溶解20～40min，制备成质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液，备用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，红花龙胆干浸膏、上样液的制备具体步骤为：精密称定红花龙胆药材粉末320g，按照料液比1:40加入55～75％甲醇回流3～4次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3～1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入10～160mL水超声溶解25～35min，制备成质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液，备用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，红花龙胆干浸膏、上样液的制备具体步骤为：取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入70％甲醇回流3次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.6g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入40mL水超声溶解30min，制备成质量浓度为0.0150g/mL的上样液，备用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附具体步骤为：
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于80～95％乙醇溶液浸泡15～30h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:12～1:26的树脂柱中，加入质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液10～160mL，以0.4～1.2mL/min的体积流量动态吸附。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学吸附具体步骤为：
1)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡24h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
2)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:21的树脂柱中，加入质量浓度为0.0150g/mL的上样液40mL，以0.8mL/min的体积流量动态吸附。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附具体步骤为：
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用4～16BV蒸馏水洗脱，然后用15～95％乙醇洗脱溶液3～15BV，以0.4～1.2mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即可。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，D101树脂对红花龙胆芒果苷的动力学解吸附具体步骤为：
动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用25％乙醇洗脱溶液6BV，以1.0mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即可。
9.一种利用HPLC法测定权利要求1-8任一项所述方法而得的芒果苷含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
色谱条件的设定为：Thermo AQUASIL-C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，等度洗脱，等度洗脱程序为：0～35min，13％A，87％B，检测波长：240～280nm；柱温：20～30℃；流速：0.8～1.2mL/min；进样量：10μL；
对照品溶液的制备具体步骤为：取芒果苷对照品适量，精密称定，加40～70％甲醇溶液溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.75mg/mL的芒果苷对照品储备液，再分别吸取对照品溶液适量置于10mL量瓶中，加40～70％甲醇溶液配成0.001500，0.1875，0.3750，0.5625，0.7500mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备具体步骤为：1)取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入50～80％甲醇回流2～5次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.3～1.2g，精密称定，置三角锥形瓶中，加入20～60mL水超声溶解20～40min，制备成质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液；
2)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于80～95％乙醇溶液浸泡15～30h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
3)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:12～1:26的树脂柱中，加入质量浓度为0.00750～0.0300g/mL的上样液30～50mL，以0.4～1.2mL/min的体积流量动态吸附；
4)动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用15～95％乙醇洗脱溶液3～15BV，以0.4～1.2mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即得供试品溶液；
HPLC法测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算质量含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
色谱条件的设定为：Thermo AQUASIL-C18柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸水溶液，等度洗脱，等度洗脱程序为：0～35min，13％A，87％B，检测波长：254nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；
对照品溶液的制备具体步骤为：取芒果苷对照品适量，精密称定，加50％甲醇溶液溶解并定容至25mL量瓶中，摇匀，制成质量浓度为0.75mg/mL的芒果苷对照品储备液，再分别吸取对照品溶液适量置于10mL量瓶中，加50％甲醇溶液配成0.001500，0.1875，0.3750，0.5625，0.7500mg/mL的对照品溶液；
供试品溶液的制备具体步骤为：
1)取红花龙胆药材粉末320g，精密称定，按照料液比1:40加入70％甲醇回流3次，1h/次，合并提取液，过滤，减压浓缩得浸膏71.28g，取红花龙胆醇提浸膏0.6g，精密称定，置三角锥形瓶中，精密加入40mL水超声溶解30min，制备成质量浓度为0.0150g/mL的上样液，即得供试品溶液；
2)用蒸馏水将D101大孔树脂装入玻璃层析柱中进行动态淋洗，洗去破碎大孔树脂及杂质，然后于95％乙醇溶液浸泡24h，使其充分膨胀，最后用乙醇动态洗脱至流出液加水不变浑浊为止，体积比1:5，临用前用水置换出乙醇；
3)称取处理后的D101大孔吸附树脂10g，柱床体积为18mL，以湿法装柱于径高比为1:21的树脂柱中，加入质量浓度为0.0150g/mL的上样液40mL，以0.8mL/min的体积流量动态吸附；
4)动态吸附4h，使之吸附平衡后，用10BV蒸馏水洗脱，然后用25％乙醇洗脱溶液6BV，以1.0mL/min速率洗脱，收集洗脱液并调整其体积至250mL，即得供试品溶液；
HPLC法测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算质量含量。
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| CN202010547185.3A CN111505185A (zh) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | 一种从红花龙胆中富集纯化芒果苷的方法及其检测方法 |
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| CN109776515A (zh) * | 2019-03-29 | 2019-05-21 | 广西工业职业技术学院 | 从扁桃叶中提取芒果苷的方法 |
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