CN111500733A

CN111500733A - 外周血单核细胞中用于非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物

Info

Publication number: CN111500733A
Application number: CN202010460209.1A
Authority: CN
Inventors: 林艳丽; 王友亮; 钟荣斌; 王启伟; 吴晓洁; 靳杰
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-05-27
Also published as: CN111500733B

Abstract

本发明公开了外周血单核细胞中用于非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物。本发明提供了检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质、检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质和检测所述待检者的吸烟量情况的物质在制备具有1)和/或2)功能的产品中的应用：1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；2)区分或辅助区分待检者是非小细胞肺癌还是肺部良性结节患者；所述吸烟量情况为每年吸烟量是否大于40包。本发明的实验证明了CD226、CD247以及患者的吸烟量(大于40包/年)组成的诊断组合能够有效判别非小细胞肺癌患者和肺部良性结节病人，有望成为非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物。

Description

外周血单核细胞中用于非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种外周血单核细胞中用于非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物。

背景技术

2018年全球癌症统计数据显示肺癌依旧是发病率(11.6％)和死亡率(18.4％)第一位的恶性肿瘤。由于工业发展进程加快，空气污染加重以及吸烟人数增多，肺癌的发病率以及死亡率逐年上升，形势非常严峻。在所有肺癌病例中近85％为非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)，主要包括鳞癌、腺癌、大细胞癌等。非小细胞肺癌恶性程度高，患者5年生存率低且70％患者初次诊断时已属肺癌晚期。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤，由于人口基数较大，我国肺癌的新发病例和死亡病例数远超其他国家，疾病负担一直以来都十分沉重。美国近几年的肺癌发病率持续下降，主要归因于多级肺癌预防和筛查计划。现阶段的主要筛查手段为低剂量螺旋CT，但有辐射暴露、导致病人的焦虑情绪以及成本较高的缺陷，而且筛查结果假阳性较高，会导致过度诊断。以组织活检为基础的侵入性技术会造成气胸、出血等不良反应，组织活检取材的局限性和肿瘤的异质性，也容易产生假阴性的结果。因此，发现早期肿瘤标记物，实现术前无创性早期诊断迫在眉睫。

以体液为检测对象的液态活检是一种新兴的无创性分子病理检测方法，通过检测肿瘤细胞释放到体液中的标志物信息，从而获得患者体内肿瘤基因或者蛋白表达的全面信息。液态活检的主要检测物包括：肿瘤标志物分子、血细胞、循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cell,CTC)、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)和外泌体(exosomes)。液态活检的标本主要有血液、尿液、唾液、乳汁、胸水和脑脊液等。因其样本是体液，取材途径简便，可做到随时取样、随时分析、具有无滞后性并且重复性好的特点，弥补了组织病理学检查的一些短板。

尽管循环细胞外基因检测显示出了癌症早期检测的前景，但这些检测还存在一些缺陷，限制了其在临床上的应用。包括(1)血浆或血清中miRNA、mRNA等的回收率低；(2)红细胞等血细胞溶血后会释放到血浆或血清中大量核酸，产生非特异性结果；(3)循环细胞外血浆基因的变异性来源可能导致报告之间对同一类型癌症的诊断结果不一致甚至矛盾。由于在血液中miRNAs与蛋白质(如argonaute、3脂蛋白等)有关，问题变得更加复杂，或包含在被指定为外体、微粒、微泡或细胞外小泡的细胞片段中。此外，从2008年到2013年，在26种不同类型的肿瘤中，共鉴定出154个循环细胞外miRNA表达谱。然而，各种报告之间没有出现单一的诊断特征。虽说现有的非小细胞肺癌诊断标记物有一定的诊断效果，但是仍有若干任务有待解决，需要额外的外部验证确定一个标准的收集方案，并确认基因特征及其准确性，需要对肺结节患者进行更大规模的前瞻性队列研究，以更全面地确定潜在混杂效应或疾病的作用，并评估这种方法的总体临床可行性和实用性。

肿瘤被免疫***识别后肿瘤细胞可以通过对T细胞诱导的细胞凋亡或免疫调节分子和细胞因子的局部表达产生抗性来逃避消除免疫监视。此外，免疫***的抑制和逃避可能早在癌症的发展和进程中的恶变前事件中就发生。外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)是免疫***抵抗癌症的第一道防线，由单核细胞，T细胞，B细胞和自然杀伤细胞组成。一旦产生癌症免疫原性或免疫逃避，PBMC中某些分子的表达就会出现差异，而这种变化可以早于肿瘤前病变。已有研究表明在多种类型的早期肿瘤患者中发现了PBMC的差异分子表达，而这种差异变化不依赖于实质性的肿瘤负荷，可以避免当前某些胞外生物标志物的缺点，它们的表达参与免疫***对癌症的识别和肿瘤细胞逃避免疫***的过程，而且免疫***识别癌症和肿瘤细胞的免疫逃避都发生于肿瘤早期，因此，它们的差异表达可以反映出肿瘤早期发生的状态，确定PBMC的分子变化可能会成为癌症发展状态的替代窗口。此外，PBMC中的生物标志物的分析可以克服基于体液检测的一些障碍，因为它是基于细胞且易于实施的检测方法。PBMC可以产生大量高质量的RNA，通过qRT-PCR就可以可靠地测定基因的表达因此，PBMC中差异分子表达作为分子标志物理论上可能具有更高的诊断价值，PBMC中的RNA差异表达谱可以提供新的生物标志物用于早期发现恶性肿瘤。

因此，PBMC可以作为血液中筛选肺癌早期诊断分子标记物的理想模型。

发明内容

本发明一个目的是提供检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质、检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质和检测所述待检者的吸烟量情况的物质的用途。

本发明提供了检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质、检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质和检测所述待检者的吸烟量情况的物质在制备具有1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；

2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；

3)区分或辅助区分待检者是非小细胞肺癌还是肺部良性结节患者；

所述吸烟量情况为每年吸烟量是否大于40包。

本发明另一个目的是提供检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质和检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质的用途。

本发明提供了检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质和检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质在制备具有1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；

2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；

本发明还提供了检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质、检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质、检测所述待检者的吸烟量情况的物质和记载公式2的可读载体B在制备具有1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；

2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；

所述公式2：P＝exp(U)/[1+exp(U)]，其中U＝4.1047+2.6575×n+3.6105×log(CD226)-1.7212×log(CD247)；

其中，P为待检者的检测值，log(CD226)为待检者PBMC中CD226基因表达量(具体为相对表达量)的log值；log(CD247)为待检者PBMC中CD247基因表达量(具体为相对表达量)的log值；

exp(U)为U的exp值；

n为1或0，若待检者吸烟量每年大于40包，则n为1；若待检者吸烟量每年小于等于40包，则n为0；

本发明还提供了检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质、检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质和记载公式1的可读载体A在制备具有1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；

2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；

所述公式1为P＝exp(U)/[1+exp(U)]，其中U＝4.1198+2.8282×log(CD226)–1.2212×log(CD247)；

P为待检者的检测值，log(CD226)为待检者PBMC中CD226基因表达量(具体为相对表达量)的log值；log(CD247)为待检者PBMC中CD247基因表达量(具体为相对表达量)的log值；

exp(U)为U的exp值。

上述应用中，所述检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质包括扩增CD226基因的引物对；

所述检测待检者PBMC中的CD247基因表达量的物质包括扩增CD247基因的引物对。

本发明最后一个目的是提供一种产品。

上述产品，包括检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质和检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质；

所述产品具有如下1)-3)至少一种功能：1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；3)区分或辅助区分待检者是非小细胞肺癌还是肺部良性结节患者。

上述产品还包括检测所述待检者的吸烟量情况的物质；

所述吸烟量情况为每年吸烟量是否大于40包。

上述产品还包括记载所述公式2的可读载体B或记载所述公式1的可读载体A；

所述可读载体B上还记载判断标准B：

若所述待检者的P值大于等于0.8886，则待检者患有或候选患有非小细胞肺癌；或所述待检者为或候选为非小细胞肺癌而不是肺部良性结节；

若所述待检者的P值小于0.8886，则所述待检者不患有或候选不患有非小细胞肺癌；或所述待检者为或候选为肺部良性结节而不是非小细胞肺癌；

或，

所述可读载体A上还记载判断标准A：若所述待检者的P值大于等于0.9043，则所述待检者患有或候选患有非小细胞肺癌，或所述待检者为或候选为非小细胞肺癌而不是肺部良性结节。

若所述待检者的P值小于0.9043，则所述待检者不患有或候选不患有非小细胞肺癌；或所述待检者为或候选为肺部良性结节而不是非小细胞肺癌。

上述诊断为早期诊断。

本发明通过qRT-PCR技术检测了CD86、CD226、CD247和ICAM-1四个与免疫调节相关基因的差异表达：检测实验组病人(非小细胞肺癌105例和肺部良性结节病人20例)血液PBMC中基因的表达量，结果显示：CD86(P＝0.0037)、CD226(P＝0.0033)、CD247(P＝0.0004)和ICAM-1(P＝0.0026)在非小细胞肺癌病人PBMC中的表达量均显著高于对照组良性结节病人的表达量；检测验证组病人(非小细胞肺癌101例和肺部良性结节病人21例)四个基因的表达量，结果显示与实验组一致，在非小细胞肺癌PBMC中的表达量均高于对照组的表达量CD86(P＝0.0085)、CD226(P＝0.0107)、CD247(P＝0.0028)和ICAM-1(P＝0.0008)。随后整合上述结果，通过逐步logistic回归分析，发现CD226、CD247以及患者的吸烟量(大于40包/年)组成的诊断组合对非小细胞肺癌的临床诊断价值最高，AUC值可达0.9079，灵敏度为0.7579，特异性为0.9。说明该组合能够有效判别非小细胞肺癌患者和肺部良性结节病人，有望成为非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物。

附图说明

图1为实验组qRT-PCR检测结果；注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

图2为实验组差异表达基因的ROC曲线。

图3为验证组qRT-PCR检测结果；注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

图4为验证组差异表达基因的ROC曲线。

图5为最佳诊断组合的ROC曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用材料与方法部分如下：

1、样本的收集

1.1、血液标本来源

本课题组与中国人民解放军总医院胸外科合作，选取入院接受治疗的所有肺癌患者与肺部良性结节病人为研究对象，病人入院接受治疗前均获得充分知情并签署知情同意书。随后采集病人术前血液标本，并将血液标本分离成血浆、PBMC和RBC三部分，分装至无RNase的EP管中冷冻储存。标本收集的同时记录和保留了病人详细的病历资料，包括性别、年龄、是否吸烟、吸烟量、吸烟年限、是否传染性病毒感染和有无既往癌症病史等信息。

1.2、样品入选标准及分组依据

根据患者的临床资料，剔除所有含既往癌症病史或传染性病毒感染(如传染性肝炎、梅毒和HIV等)病人的血液标本。将未进行过任何手术、放疗、化疗和药物治疗的非小细胞肺腺癌、非小细胞肺鳞癌病人的PBMC标本以及肺部良性结节病人(包括肺泡上皮增生、慢性肉芽肿、纤维组织增生及息肉等)的PBMC标本作为实验对象，并将其随机分成两组：实验组和验证组。进行差异表达基因以及蛋白质的检测与验证。

2、PBMC中qRT-PCR检测方法

2.1单核淋巴细胞(PBMC)的分离

1)分离血浆后的血液标本加PBS补齐至原体积，混匀；

2)将混匀后的血液沿管壁缓慢加入到事先准备好的装有等体积淋巴细胞分离液的15mL离心管中；

3)室温400g离心15分钟；

4)离心结束后，管内溶液清晰的分成三层。上层是PBS溶液，中间是淋巴细胞分离液，管底是红细胞层。上层与中间层之间是一层薄且较致密的白膜，即为PBMC层。小心吸取白膜层细胞至15mL离心管中，加PBS补至15mL刻度处，反复颠倒混匀；

5)室温400g离心5分钟；

6)离心后的PBMC沉于管底，弃上清，加入1mL的红细胞裂解液重悬细胞并移至1.5mL离心管中；

7)室温，2000rpm，离心5分钟；

8)弃上清，加1mL PBS再次重悬细胞；

9)室温，2000rpm，离心5分钟；

10)弃上清，白色沉淀即为PBMC，-80℃冷冻储存备用；

2.2PBMC中总RNA的提取和纯化

1)取解冻后的PBMC样品，加入1mL的Trizol试剂，吹打混匀直至管内无明显细胞团块；

2)室温静置5分钟；

3)加入0.2mL氯仿，旋涡振荡混匀15秒；

4)室温静置2-3分钟；

5)放入低温高速离心机中4℃，12000×g离心15分钟；

6)离心后管内混合液分成明显的三层，上层为含有RNA的无色透明水相、中间为白色的蛋白质层、下层为红色有机相。小心吸取约400μL上层水相至1.5mL离心管中；

7)加入等体积的无水乙醇，吹打混匀；

8)反复颠倒直至加入乙醇后可能产生的沉淀充分溶解；

9)取400μL上层水相加至带有收集管的纯化柱中；

10)室温12000×g离心15秒，弃去收集管中的滤液，将纯化柱重新放入收集管中；

11)重复以上两步骤一次；

12)加350μL Wash Buffer I于纯化柱薄膜上，室温12000×g离心15秒，弃滤液及收集管，更换新的收集管；

13)加80μL PureLinkDNase Mixture(表1)于纯化柱薄膜上，室温孵育15分钟；

表1为PureLinkDNase Mixture成分表

14)加350μL Wash Buffer I于薄膜上，室温12000×g离心15秒，弃液体及收集管，更换新的收集管；

15)加500μL含乙醇的Wash Buffer II于离心柱内；

16)室温12000×g,离心15秒，弃去收集管中的液体；

17)重复以上两步骤一次；

18)室温12000×g离心1分钟，使其上RNA干燥，弃收集管更换回收管；

19)小心加入30μL RNase-Free-Water于纯化柱薄膜中央；

20)室温静置1分钟；

21)室温12000×g,离心1分钟收集RNA。

2.3PBMC RNA样品的反转录

1)将提取后的PBMC RNA样品统一稀释成合适的浓度；

2)配制2×反转录混合液(表2)，冰上待用；

表2为反转录反应体系

3)配制好反转录混合液后分别加入8联管内，再分别加入15μL RNA样品，配制成30μL的反应体系。轻微吹打混匀，盖紧，短暂离心；

4)放入96孔PCR仪中，设置反应条件如下(表3)：

表3为反转录PCR条件

2.4qRT-PCR

2.4.1引物设计

根据CD86、CD226、CD247、ICAM-1和GAPDH的基因序列设计引物用于实时荧光定量PCR反应，具体引物名称及序列如表4：

表4为PCR反应使用的引物序列信息

上表中第2列从上到下的序列依次为序列1-序列10。

2.4.2qRT-PCR反应体系与条件

根据引物合成说明书加入适量的RNase-free-water配制浓度为10μM的引物溶液，使用TOYOBO的THUNDERBIRD^TM SYBR qPCR Mix Without ROX试剂盒，根据说明书配制反应体系如下(表5)：

表5为qRT-PCR反应体系

将配制好的qPCR反应混合液加入96孔PCR板中，每个反应孔加18μL的混合液，再加入2μLcDNA配制成20μL的反应体系，放入实时荧光定量PCR仪中进行反应，PCR反应条件如下(表6)：

表6为qRT-PCR反应条件

每个样品设置3个复孔，以GAPDH作为内参基因。qPCR反应结束后，每个样品中目的基因三个复孔的平均Ct值作为最终结果。

各目的基因的相对表达量计算公式为2^-△Ct，其中△Ct＝Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。

2.5统计学分析方法

qRT-PCR数据的统计分析使用SAS***完成，用于统计分析的各样品目的基因相对表达量取三次生物学重复实验的平均值。符合正态分布的，采用双尾t检验；不符合正态分布的，采用Kruskal-Wallis非参数检验，若P＜0.05，则可以认为组间差异具有统计学意义。Pearson相关性分析用于评估非小细胞肺癌患者和肺部良性结节病人血浆中目的基因表达量与人口统计学和临床特征之间的关系，AUC用于评估目的基因作为肺癌诊断标志物的敏感度和特异性，逐步logistic回归分析用于构建最佳诊断组合模型。

实施例1、非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物的发现

1、实验组病人PBMC中CD86、CD226、CD247和ICAM-1表达量的检测

1)实验组研究对象的临床资料

本次实验组研究包含非小细胞肺癌患者105例(NSCLC组)和肺部良性结节病人20例(BENIGN组)。NSCLC组(I期91.4％、II期4.8％、III期2.9％、IV期0、未知0.9％)包括腺癌87人(82.9％)，鳞癌18人(17.1％)。具体临床信息见表7，可以看出NSCLC组和BENIGN组样本在年龄、性别和吸烟量方面没有差别(P值均大于0.05)。

表7为实验组研究对象的临床资料一览表

注：P值由分类变量的卡方检验或Fisher精确检验和连续变量的T检验或Wilcoxon秩和检验计算得出。

2)qRT-PCR检测基因表达量结果

采用qRT-PCR技术(方法与引物见前面所述)检测了CD86、CD226、CD247和ICAM-1四个基因在实验组105个非小细胞肺癌患者和20个肺部良性结节病人血液PBMC中的相对表达量(2^-△Ct)，并进行两独立样本的t检验。

结果如图1所示，经检验CD86(P＝0.0037)、CD226(P＝0.0033)、CD247(P＝0.0004)和ICAM-1(P＝0.0026)在非小细胞肺癌患者组中的表达均高于肺部良性结节病人组。

3)差异表达基因的ROC分析

根据上述2)得到的四个基因的相对表达量在GraphPad Prim 6中绘制了各自的ROC曲线，并通过AUC值(曲线下面积)评估了这四个PBMC基因作为非小细胞肺癌诊断分子标志物的可能性，AUC值越大，该基因作为非小细胞肺癌诊断分子标志物的灵敏度和特异性越高。

结果如图2所示，CD86、CD226、CD247和ICAM-1这四个基因的AUC值分别为0.72、0.61、0.81和0.71。

2、验证组病人PBMC中CD86、CD226、CD247和ICAM-1表达量的检测结果

为了验证CD86、CD226、CD247和ICAM-1作为肺癌分子标志物的诊断灵敏度和特异性，在另一验证组病人PBMC样本中，也利用qRT-PCR检测了CD86、CD226、CD247和ICAM-1四个基因的表达量。

1)验证组研究对象的临床资料

本次验证组研究包含非小细胞肺癌患者组的患者101例(NSCLC组)和肺部良性结节病人21例(BENIGN组)。其中NSCLC组(I期90.1％、II期6.9％、III期1.0％、IV期2.0％、未知0％)包括腺癌80人(79.2％)，鳞癌21人(20.8％)。具体临床信息见表8，可以看出实验组和对照组样本在年龄、性别和吸烟量方面没有差别(P值均大于0.05)。

表8为验证组研究对象的临床资料一览表

2)qRT-PCR检测结果

采用qRT-PCR技术检测了CD86、CD226、CD247和ICAM-1四个基因在验证组101个非小细胞肺癌患者和21个肺部良性结节病人血液PBMC中的相对表达量(2^-△Ct)，并进行两独立样本的t检验。

结果如图3所述，显示CD86(P＝0.0085)、CD226(P＝0.0107)、CD247(P＝0.0028)和ICAM-1(P＝0.0008)在验证组非小细胞肺癌患者中的表达也显著高于肺部良性结节病人组。

3)非小细胞肺癌患者差异表达基因的ROC分析

根据四个基因在验证组中的相对表达量，利用GraphPad Prim 6软件绘制了各自的ROC曲线，并通过AUC值评估了这四个基因作为分子标志物诊断非小细胞肺癌的能力，AUC值越大，该基因作为分子标志物对非小细胞肺癌的诊断效能就越大。

结果如图4所示，CD86、CD226、CD247和ICAM-1四个基因的AUC值分别为0.68、0.58、0.71和0.72。

3、非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物确定及方法的建立

1)CD226与CD247基因表达量作为非小细胞肺癌诊断标志物

对比实验组和验证组两个独立样本中上述四个基因的表达水平，发现CD86、CD226、CD247和ICAM-1在NSCLC中的表达量均高于肺部良性结节病人，两次实验结果一致，四个基因在NSCLC患者和良性结节病人PBMC中的表达差异具有统计学意义(P值均小于0.05)。随后将两组数据结合共同进行了逐步logistic回归分析，得到诊断灵敏度和特异性高的NSCLC早期诊断标记物组合。

将基因表达量进行对数转换，通过对分类变量的卡方检验和连续变量的T检验或Wilcoxon秩和检验，比较非小细胞肺癌患者和肺部良性结节病人的临床特征(年龄，性别和吸烟数等)。利用逐步logistic回归分析选择肺癌诊断的最佳标志物组合，在逐步logistic回归分析中考虑了上述所有实验对象的临床特征和仅以目的基因表达量作为单变量的logistic回归结果。

首先使用逐步logistic回归方法分析仅用基因表达量作为非小细胞肺癌诊断标志物时，最佳的诊断组合是CD226与CD247表达量的组合。AUC值可达0.8863(图5A)，95％置信区间为：0.8257—0.9469。

数学建模公式为：P＝exp(U)/[1+exp(U)]，其中U＝4.1198+2.8282×log(CD226)–1.2212×log(CD247) (公式1)。

上述公式中，P为待检者的检测值，log(CD226)为待检者PBMC中CD226基因相对表达量的log值；log(CD247)为待检者PBMC中CD247基因相对表达量的log值；

exp(U)为U的exp值；exp为自然常数额(2.71828)为底的指数函数；

其中，以约登指数(正确指数)为基准，计算出诊断阈值P＝0.9043。

检测一个病人PBMC中的CD226和CD247的表达量，如果此公式计算出的P值≥0.9043，那么就认为此病人可能患有非小细胞肺癌，此模型诊断的灵敏度为0.69474，特异性为1。

因此，可以通过待检者的PBMC中的CD226和CD247的相对表达量，代入上述公式1中，计算待检者的P值，按照如下标准A区分待检者是非小细胞肺癌还是肺部良性结节，或按照如下标准A判断待检者是否患有非小细胞肺癌；

判断标准A：

若待检者的P值大于等于0.9043，则待检者患有或候选患有非小细胞肺癌；或待检者为或候选为非小细胞肺癌而不是肺部良性结节。

若待检者的P值小于0.9043，则待检者为或候选为肺部良性结节而不是非小细胞肺癌。

2)CD226与CD247基因表达量与临床资料结合作为非小细胞肺癌诊断标志物

将CD226与CD247基因表达量与临床资料结合作为非小细胞肺癌诊断标志物时，发现最佳的诊断组合是CD226与CD247的表达量再结合吸烟量情况(通过是否大于40包/年，判断是否公式中使用2.6575)构成的诊断组合，其AUC值达到了0.9079(图5B)，95％置信区间为(0.8423，0.9735)。

数学建模公式为：P＝exp(U)/[1+exp(U)]，其中U＝4.1047+2.6575×n+3.6105×log(CD226)-1.7212×log(CD247) (公式2)。

公式2中，P为待检者的检测值，log(CD226)为待检者PBMC中CD226基因相对表达量的log值；log(CD247)为待检者PBMC中CD247基因相对表达量的log值；

exp(U)为U的exp值；exp为自然常数额(2.71828)为底的指数函数；

n为1或0，用于衡量公式中是否采用系数2.6575，若检者吸烟量吸烟量大于40包/年，则n为1；若检者吸烟量小于等于40包/年，则n为0；

以约登指数为基准，计算出此模型的诊断阈值P＝0.8886.

给定一个病人PBMC中的CD226、CD247的表达量和吸烟量，如果此公式计算出的P值≥0.8886，那么就认为此病人可能患有非小细胞肺癌，此模型诊断的灵敏度为0.7579，特异性为0.9。

因此，可以通过待检者的PBMC中的CD226和CD247的相对表达量和待检者的吸烟量情况，代入上述公式2中，计算待检者的P值，按照如下标准B判断待检者是否患有非小细胞肺癌，或按照如下标准B区分待检者是非小细胞肺癌还是肺部良性结节；

判断标准B：

若待检者的P值大于等于0.8886，则待检者患有或候选患有非小细胞肺癌；或待检者为或候选为非小细胞肺癌而不是肺部良性结节；

若待检者的P值小于0.8886，则待检者不患有或候选不患有非小细胞肺癌；则待检者为或候选为肺部良性结节而不是非小细胞肺癌。

因此，判断待检者是否患有非小细胞肺癌的试剂盒可以包括：检测待检者的PBMC中的CD226和CD247的表达量的试剂；

或检测待检者的每年吸烟量情况的物质；

或记载如下公式1或公式2的可读载体；

所述可读载体上还记载上述判断标准A或B。

实施例2、CD226和CD247的表达量在检测待检者是否患有非小细胞肺癌中的应用

一、检测待检者PBMC中CD226和CD247的表达量

1、分离检测待检者的PBMC：32例非小细胞肺癌(病理学诊断处于I期)和17例肺部良性结节病人(已经临床确诊)作为待检者，方法与实施例1的一的2.1相同；

2、PBMC中总RNA的提取和纯化：方法与实施例1的一的2.2相同；

3、PBMC RNA样品的反转录：方法与实施例1的一的2.3相同；

4、qRT-PCR：

以上述3反转录的cDNA为模板，用以表4中的引物CD226-F/CD226-R和CD247-F/CD247-R分别进行qRT-PCR；以GAPDH作为内参基因。

得到CD226的相对表达量和CD247的相对表达量。

5、计算P值

将上述待检者的PBMC中的CD226和CD247相对表达量，代入下述公式1中，得到该待检者的P值。

exp(U)为U的exp值；exp为自然常数额(2.71828)为底的指数函数；

按照如下标准A判断待检者是否患有非小细胞肺癌，或按照如下标准A区分待检者是非小细胞肺癌还是肺部良性结节；

判断标准A：

结果如下表9：

表9为待检者检测结果

上表中，第1列为患者编号，第2列为患者年龄，第3列为患者性别，第4列为患者PBMC中CD247基因相对表达量，第5列为患者PBMC中CD226基因相对表达量，第6列为公式1中的U值，第7列为公式1中的P值，第8列为病例的病理诊断结果：NSCLC为非小细胞肺癌；第9列为本发明的P值判断的结果与细胞学诊断结果是否一致。

从表9中可以看出，

32例非小细胞肺癌中有28例本发明的方法诊断的结果与细胞系诊断结果一致，仅4例不一致，本发明方法对于非小细胞肺癌的阳性检出率为87.5％；

17例肺部良性结节病人中有8例本发明的方法诊断的结果与细胞系诊断结果一致，有9例本发明的方法诊断的结果与病理学诊断结果不一致，本发明对于肺部良性结节病人的阳性检出率为47％，这可能由于病理诊断结果为收集样本时的结果，应该对这些高风险的良性结节患者进行随访追踪研究，是否有良性患者转为非小细胞肺癌，可能存在病理学诊断假阳性。

实施例3、CD226和CD247的表达量和待检者吸烟量情况在检测待检者是否患有非小细胞肺癌中的应用

一、检测待检者的PBMC中CD226和CD247的表达量

1、分离检测待检者的PBMC：32例非小细胞肺癌(病理学诊断为I期)和17例肺部良性结节病人(已经临床确诊)作为待检者，方法与实施例1的一的2.1相同；

2、PBMC中总RNA的提取和纯化：方法与实施例1的一的2.2相同；

3、PBMC RNA样品的反转录：方法与实施例1的一的2.3相同；

4、qRT-PCR：

得到CD226的相对表达量和CD247的相对表达量。

5、统计待检者年吸烟量是否大于40包；

6、计算P值

将上述待检者的PBMC中的CD226和CD247的相对表达量，代入下述公式2中，得到该待检者的P值。

P＝exp(U)/[1+exp(U)]，其中U＝4.1047+2.6575×n+3.6105×log(CD226)–1.7212×log(CD247) (公式2)。

exp(U)为U的exp值；exp为自然常数额(2.71828)为底的指数函数；

按照如下标准B判断待检者是否患有非小细胞肺癌，或按照如下标准B区分待检者是非小细胞肺癌还是肺部良性结节；

判断标准B：

若待检者的P值小于0.8886，则待检者为或候选为肺部良性结节而不是非小细胞肺癌。

结果如下表10：

表10为待检者检测结果

上表中，第1列为患者编号，第2列为患者年龄，第3列为患者性别，第4列为吸烟量情况，第5列衡量吸烟量系数的n值，第6列为患者PBMC中CD247基因相对表达量，第7列为患者PBMC中CD226基因相对表达量，第8列为公式2中的U值，第9列为公式2中的P值，第10列为病理学诊断结果:NSCLC为非小细胞肺癌；第12列为本发明的p值判断的结果与病理学诊断结果是否一致。

从表10中可以看出，

32例非小细胞肺癌中有31例本发明的方法诊断的结果与细胞系诊断结果一致，仅1例不一致，本发明方法对于非小细胞肺癌的阳性检出率为96.7％；

17例肺部良性结节病人中有10例本发明的方法诊断的结果与细胞系诊断结果一致，有3例患者在阈值的临界值，有4例本发明的方法诊断的结果与细胞系诊断结果不一致，本发明对于肺部良性结节病人的阳性检出率为58.9％。

由于病理诊断结果为收集样本时的结果，应该对这些高风险的良性结节患者进行随访追踪研究，是否有良性患者转为非小细胞肺癌，可能存在病理学诊断假阳性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>外周血单核细胞中用于非小细胞肺癌早期诊断的分子标记物

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

cccaacacat gggacctata ac 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

tgtaatgacg cagcagtatc c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

aggagaagga gagagaagag 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gattggtagg ttgactggta gag 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cccaacacat gggacctata ac 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 6

<400> Artificial sequence

tgtaatgacg cagcagtatc c 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

ggccggccag cttatacac 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

tagacacttg agctcgggca 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

gaagatggtg atgggatttc 20

Claims

1.检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质、检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质和检测所述待检者的吸烟量情况的物质在制备具有1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；

2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；

所述吸烟量情况为每年吸烟量是否大于40包。

2.检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质和检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质在制备具有1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；

2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；

3)区分或辅助区分待检者是非小细胞肺癌还是肺部良性结节患者。

3.检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质、检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质、检测所述待检者的吸烟量情况的物质和记载公式2的可读载体B在制备具有1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；

2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；

其中，P为待检者的检测值，log(CD226)为待检者PBMC中CD226基因表达量的log值；log(CD247)为待检者PBMC中CD247基因表达量的log值；

exp(U)为U的exp值；

n为1或0，若待检者吸烟量每年大于40包，则n为1；若待检者吸烟量每年小于等于40包，则n为0。

4.检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质、检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质和记载公式1的可读载体A在制备具有1)-3)中至少一种功能的产品中的应用：

1)检测或辅助检测待检者是否患有非小细胞肺癌；

2)诊断或辅助诊断待检者是否患有非小细胞肺癌；

P为待检者的检测值，log(CD226)为待检者PBMC中CD226基因表达量的log值；log(CD247)为待检者PBMC中CD247基因表达量的log值；

exp(U)为U的exp值。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：

所述检测待检者的PBMC中的CD226基因表达量的物质包括扩增CD226基因的引物对；

所述检测待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质包括扩增CD247基因的引物对。

6.一种产品，包括检测待检者PBMC中的CD226基因表达量的物质和检测所述待检者的PBMC中的CD247基因表达量的物质；

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：所述产品还包括检测所述待检者的吸烟量情况的物质；

所述吸烟量情况为每年吸烟量是否大于40包。

8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于：

所述产品还包括记载所述公式2的可读载体B或记载所述公式1的可读载体A；

所述可读载体B上还记载判断标准B：

或，