CN111499692B

CN111499692B - 靶向新型冠状病毒covid-19的多肽及其应用

Info

Publication number: CN111499692B
Application number: CN202010548504.2A
Authority: CN
Inventors: 王浩; 王磊; 杨培培; 安红维; 赵宇亮
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2040-06-16
Also published as: CN111499692A

Abstract

本发明提供了靶向新型冠状病毒COVID‑19的多肽及其应用，所述多肽包括如SEQ ID NO:1~28所示的氨基酸序列；或所述多肽为将SEQ ID NO:1~28在N端和/或C端添加1~20个氨基酸多肽序列和/或共轭连接碳链而获得的具有靶向冠状病毒COVID‑19的活性的分子。本发明采用一珠一化合物（one‑bead‑one‑compound，OBOC）的组合化学方法合成多肽库，利用多肽库与新型冠状病毒表面的S蛋白，筛选得到的多肽与冠状病毒COVID‑19的S蛋白具有强结合能力，为新型冠状病毒检测试剂和治疗药物的研发提供了依据。

Description

靶向新型冠状病毒COVID-19的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及靶向新型冠状病毒COVID-19的多肽及其应用。

背景技术

病毒（virus）是形态最微小、结构最简单的一类微生物，属于非细胞型微生物，没有典型的细胞结构和产生能量的酶***，只能寄生在活细胞内生长繁殖。病毒在医学微生物中占有十分重要的地位，在微生物引起的各种疾病中，病毒性疾病的占比高达75%。病毒性疾病不仅传染性强、流行范围广，而且有效药少。近年来发生的大型冠状病毒传染性肺炎，引起了社会各界的广泛关注。而新型冠状病毒肺炎更是成为关注和讨论的焦点，然而尚未研发出针对新型冠状病毒的特效药，因此，迫切需要开发一种非传统的抗病毒策略。

S蛋白是冠状病毒入侵细胞的武器，具有非常明确的目标特异性，在介导病毒与宿主细胞表面的受体结合以及膜融合的过程中起着关键作用；由于冠状病毒是单链RNA结构，且基因组庞大，具有极强的突变性，使得冠状病毒极易逃避宿主免疫***的清除作用。冠状病毒的目标特异性和高度突变性，使得对于冠状病毒的有效治疗相当棘手。

因此，有必要研究与S蛋白具有特异性结合作用的多肽的特征，为进一步研发抗病毒药物提供依据。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了靶向新型冠状病毒COVID-19的多肽及其应用，所述多肽能够特异性结合新型冠状病毒表面的S蛋白，在新型冠状病毒的药物研发等方面具有重要意义。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种靶向冠状病毒COVID-19的多肽，所述多肽包括如SEQID NO: 1~28所示的氨基酸序列；

或所述多肽为将SEQ ID NO: 1~28在N端和/或C端添加1~20个氨基酸多肽序列和/或共轭连接碳链而获得的具有靶向冠状病毒COVID-19的活性的分子；

SEQ ID NO: 1：NFRHTHR；

SEQ ID NO: 2：FNRHTHR；

SEQ ID NO: 3：IGVRGGW；

SEQ ID NO: 4：KWPYKKS；

SEQ ID NO: 5：KTYHTHR；

SEQ ID NO: 6：IRQFFKK；

SEQ ID NO: 7：FYIKINH；

SEQ ID NO: 8：KSPPYHK；

SEQ ID NO: 9：WVHFYHF；

SEQ ID NO: 10：KPYIWKS；

SEQ ID NO: 11：KWPFKKS；

SEQ ID NO: 12：IGHVPGT；

SEQ ID NO: 13：WIGVRNW；

SEQ ID NO: 14：QGTHTAH；

SEQ ID NO: 15：NSGGSVH；

SEQ ID NO: 16：AAARFST；

SEQ ID NO: 17：PIGVPHT；

SEQ ID NO: 18：QVAVLYQ；

SEQ ID NO: 19：FLGVYYH；

SEQ ID NO: 20：ALTGIAV；

SEQ ID NO: 21：FVFLVLL；

SEQ ID NO: 22：VVIGIVN；

SEQ ID NO: 23：NFTISVTT；

SEQ ID NO: 24：RVVVLSFE；

SEQ ID NO: 25：AAYYVGYL；

SEQ ID NO: 26：SIIAYTMSLG；

SEQ ID NO: 27：GVVFLHVTYV；

SEQ ID NO: 28：FTGCVIAWNR。

本发明中，采用一珠一化合物（one-bead-one-compound，OBOC）的组合化学方法合成多肽库，利用多肽库与新型冠状病毒表面的S蛋白，筛选得到如SEQ ID NO: 1~28所示的具有靶向冠状病毒COVID-19的活性的多肽。

优选地，所述多肽靶向冠状病毒COVID-19的S蛋白。

本发明筛选的多肽中，如SEQ ID NO: 1~28所示的氨基酸序列的中间若干氨基酸为主要功能结构域，用于靶向新型冠状病毒表面的S蛋白，在SEQ ID NO: 1~28的N端和/或C端基础上，连接含有n个氨基酸的多肽，其中n为1~20之间的整数，和/或共轭连接碳链CH₃（CH₂）_nCOOH，n为6~18之间的整数，将不会影响活性多肽的空间构象、仍然保持对S蛋白的靶向性功能（参考文献：H. Wei et al., A tumour-selective cascade activatableselfdetained system for drug delivery and cancer imaging, NatureCommunication (2019) 10:4861）。

第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的多肽的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

（1）利用一珠一化合物法合成多肽库；

（2）向步骤（1）的多肽库中加入S蛋白进行孵育，筛选得到具有特异性结合S蛋白作用的多肽。

根据本发明，一珠一化合物（one-bead-one-compound，OBOC）法是一种组合化学方法，基于OBOC方法建立的多肽库主要用于筛选具有蛋白靶向功能的多肽，具有通量高、筛选效率高等优势；本发明利用多肽库与新型冠状病毒表面的S蛋白进行筛选，最终得到能够与S蛋白特异性结合的多肽树脂，经过测序得到多肽的氨基酸序列；本发明的方法建立了蛋白与多肽之间的联系，为发现与新型冠状病毒结合的多肽提供了简便易行的方法，为进一步研发抗病毒类药物提供了依据。

优选地，步骤（1）所述多肽库的合成方法包括：

（1’）在树脂微珠上首先合成前导序列；

（2’）将树脂微珠均分后，将一个Fmoc保护的氨基酸进行活化并加入树脂微珠中，与脱保护的前一个氨基酸进行缩合反应；

（3’）将树脂微珠混合，进行Fmoc脱保护，重复步骤（2’）和（3’），直至最后一个氨基酸合成完成，得到所述多肽库。

本发明中，在固相合成过程中，通过对树脂微珠的多次混合与均分，使每个树脂微珠上带有唯一一种随机多肽序列，构建得到多肽库。

优选地，步骤（1’）所述前导序列的长度为2~4 aa。

优选地，所述前导序列包括甲硫氨酸（M）。

本发明中，首先在树脂微珠上合成含有甲硫氨酸的前导序列，主要作用是CNBr₃乙醇溶液将甲硫氨酸裂解生成高丝氨酸，使得功能性多肽从树脂微珠上裂解下来。

根据本发明，前导序列中还含有其他19种氨基酸中的任意一种或多种，优选为含有甘氨酸（G），用于将树脂微珠与功能性多肽相间隔。

优选地，步骤（2’）所述活化的试剂包括N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、N-甲基吗啉、N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）或1-羟基苯并***（HOBT）中的任意一种或至少两种的组合，优选为N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）和1-羟基苯并***（HOBT）的混合液。

优选地，步骤（3’）所述脱保护的试剂包括含有六氢吡啶的DMF溶液或含有哌嗪和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的DMF溶液，优选为含有20%六氢吡啶的DMF溶液，或含有5%哌嗪和2% 1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的DMF溶液。

优选地，步骤（1）所述多肽库中多肽的长度为7~10 aa。

本发明中，合成长度为7~10 aa的多肽构建多肽库，不仅丰富了多肽的序列多样性，提高了多肽库中的多肽数量，理论上多肽库中含有19⁷~19¹⁰种多肽（合成的多肽中不含有甲硫氨酸），而且保证了筛选功能性多肽的效率，有助于高效筛选得到具有结合S蛋白功能的多肽；同时，多肽的长度较短，分子量小，具有免疫原性弱、活性高等优点，在体内外抗病毒方面具有广阔的应用前景。

优选地，步骤（2）所述S蛋白包括如SEQ ID NO: 29所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO: 29：

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT。

优选地，步骤（2）所述S蛋白标记有荧光基团。

优选地，步骤（2）所述孵育的时间为2~4 h，例如可以是2 h、3 h或4 h，优选为2 h。

优选地，步骤（2）所述筛选为根据荧光信号进行筛选。

作为优选技术方案，本发明提供了一种第一方面所述的多肽的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

（1）在树脂微珠上首先合成含有甲硫氨酸的长度为2~4 aa的前导序列；

（2）将树脂微珠均分后，将一个Fmoc保护的氨基酸进行活化并加入树脂微珠中，与脱保护的前一个氨基酸进行缩合反应；

（3）将树脂微珠混合，采用含有六氢吡啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，重复步骤（2）和（3），直至最后一个氨基酸合成完成，得到所述多肽库，所述多肽库中多肽的长度为7~10aa；

（4）向多肽库中加入如SEQ ID NO: 29所示的荧光标记S蛋白，孵育2~4 h，根据荧光信号筛选得到具有特异性结合S蛋白作用的树脂；

（5）将树脂经过裂解去除侧链保护基团，获得脱离树脂的多肽，进一步测序确认多肽包括如SEQ ID NO: 1~28所示的氨基酸序列。

第三方面，本发明提供了一种冠状病毒COVID-19检测试剂盒，所述试剂盒包括包被多肽，所述包被多肽为第一方面所述的多肽。

优选地，所述包被多肽直接和/或间接包被在固相载体上。

优选地，所述固相载体包括酶标板、磁珠、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述试剂盒还包括S蛋白的特异性抗体。

优选地，所述S蛋白的特异性抗体上标记有信号基团。

优选地，所述试剂盒还包括显色液和/终止液。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的多肽和/或第三方面所述的试剂盒在制备冠状病毒COVID-19检测试剂和/或治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明采用OBOC法合成多肽库，利用多肽库与新型冠状病毒表面的S蛋白，筛选得到如SEQ ID NO: 1~28所示的具有靶向冠状病毒COVID-19的活性的多肽；

（2）采用本发明筛选的多肽与S蛋白结合能力强、特异性好、分子量小、免疫原性弱、活性高，构建了冠状病毒COVID-19的免疫检测试剂盒，为疑似患者的快速确诊提供了技术支持；

（3）本发明的多肽筛选方法具有通量高、筛选效率高等优势，建立了蛋白与多肽之间的联系，为发现与新型冠状病毒结合的多肽提供了简便易行的方法，为进一步研发抗病毒类药物提供了依据。

附图说明

图1为结合有FITC标记S蛋白的OBOC多肽库的荧光显微镜图；

图2（A）为多肽序列NFRHTHR的二级质谱图，图2（B）为多肽序列KTYHTHR的二级质谱图，图2（C）为多肽序列KPYIWKS的二级质谱图，图2（D）为多肽序列KWPFKKS的二级质谱图；

图3为酶联免疫实验对多肽的二次筛选分析；

图4（A）为KWPFKKS与S蛋白的结合力分析，图4（B）为PIGVPHT与S蛋白的结合力分析，图4（C）为NSGGSVH与S蛋白的结合力分析；

图5（A）为KWPFKKS的抗病毒研究结果，图5（B）为PIGVPHT的抗病毒研究结果，图5（C）为NSGGSVH的抗病毒研究结果；

图6（A）为在PIGVPHT的N端添加多肽序列KGAG后得到的新肽的质谱图，图6（B）为在PIGVPHT的C端添加多肽序列KGAG后得到的新肽的质谱图，图6（C）为在PIGVPHT的N端添加月桂酸（C12）后得到的新肽的质谱图；

图7为新肽与S蛋白结合的酶联免疫结果，其中，1’-KGAGPIGVPHT、2’-PIGVPHTKGAG、3’-C12-PIGVPHT、4’-KAAGGKWPFKKS、5’-C12-KWPFKKS、6’-NSGGSVHKNSG、7’-GGAANSGGSVH；

图8（A）为KGAGPIGVPHT与S蛋白的结合力分析，图8（B）为PIGVPHTKGAG与S蛋白的结合力分析，图8（C）为C12-PIGVPHT与S蛋白的结合力分析，图8（D）为KAAGGKWPFKKS与S蛋白的结合力分析，图8（E）为C12-KWPFKKS与S蛋白的结合力分析，图8（F）为NSGGSVHKNSG与S蛋白的结合力分析，图8（G）为GGAANSGGSVH与S蛋白的结合力分析；

图9为KWPFKKS及经过衍生后的新肽二级结构变化图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 S蛋白的生物素或FITC标记

本实施例首先对S蛋白（SEQ ID NO: 29）进行生物素或FITC标记，步骤如下：

将0.15 mol/L NaCl溶液和0.15 mol/L pH=9.0的NaHCO₃-Na₂CO₃缓冲液按摩尔比为9:1混合，向混合液加入S蛋白进行蛋白溶解，使S蛋白的终浓度为10 mg/mL；

向S蛋白溶液中加入生物素或FITC，进行冰浴，避光条件下磁力搅拌过夜；

第二天，将混合液置于截留分子量为200的透析袋中，在去离子水条件下透析两天，并多次换水；

最后收集透析后的溶液，冷冻干燥机冻干，得到生物素或FITC标记的S蛋白。

实施例2 OBOC多肽库的建立

本实施例利用OBOC法在树脂微珠（beads）上合成多肽库，步骤如下：

（1）取1.8 g树脂beads置于合成管中，加入一定量的DMF浸没树脂进行树脂溶胀，浸泡2 h以上；

（2）向合成管中加入Fmoc保护的甲硫氨酸（M），并加入HOBT（1-羟基苯并***）和DIC（N,N'-二异丙基碳二亚胺）的混合液，摇床反应2 h以上；用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将beads吹起；之后对beads进行茚三酮沸水浴检验，beads显色为无色；

（3）加入脱保护剂（20%六氢吡啶+80%DMF）进行Fmoc脱保护10 min，用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将beads吹起；之后对beads进行茚三酮沸水浴检验，beads显色为深蓝紫色；

（4）向合成管中加入Fmoc保护的甘氨酸（G），重复步骤（2）和（3）；

（5）将合成管中的树脂平均分为19份，向每一支合成管中加入相应剂量的Fmoc保护的氨基酸（除甲硫氨酸之外的19种天然氨基酸）和HOBT（1-羟基苯并***）/DIC（N, N'-二异丙基碳二亚胺）混合液，摇床反应合成6 h以上；

（6）用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将beads吹起，确保充分混合冲洗；

（7）抽检其中3种多肽的合成效率，取出beads用乙醇浸泡后进行茚三酮沸水浴检验，重复步骤（5）-（7），直至beads变为无色，将所有合成管中的树脂混合，进行Fmoc脱保护；

（8）重复步骤（5）-（8），直至最后一个氨基酸合成完成；

（9）用脱保护剂（20%六氢吡啶+80%DMF）脱去侧链Fmoc保护基后，依次用DMF、甲醇、DMF冲洗三次，室温下避光干抽15 min，得到较为干燥的树脂；将干燥的树脂转移至小反应瓶（提前烘干）中，加入磁子，用酸性脱保护剂（TFA 82.5%、苯酚5%、水10%、TRIS2.5%）脱去所有的酸响应侧链保护基，室温反应4小时，构建得到多肽库。

实施例3 筛选靶向S蛋白的多肽

将FITC标记的S蛋白与多肽库在PBS缓冲液中培养2小时，荧光显微镜下观察发光情况（激发波长405 nm），将观察到的有明显绿色荧光的多肽树脂挑选出来。

如图1所示为FITC标记的S蛋白与OBOC多肽库作用后的荧光显微镜图片，结合有S蛋白的beads可观察到绿色荧光，根据荧光挑选出具有结合S蛋白作用的多肽。

挑选出的多肽树脂用超纯水洗涤数次并干燥，采用30%的CNBr₃乙醇溶液裂解过夜，离心处理取上清液，经过脱盐处理后进行多肽测序。

示例性地，如图2（A）、图2（B）、图2（C）和图2（D）所示为多肽序列的二级质谱图，通过二级质谱中显示的多肽碎片峰分析，多肽序列分别为NFRHTHR（SEQ ID NO: 1）、KTYHTHR（SEQ ID NO: 5）、KPYIWKS（SEQ ID NO: 10）和KWPFKKS（SEQ ID NO: 11）。通过二级质谱测序分析所有筛选得到的多肽，得到如SEQ ID NO: 1~28所示的具有靶向S蛋白功能的多肽。

实施例4 多肽与S蛋白的酶联免疫反应

将筛选的如SEQ ID NO: 1~28所示的多肽用1×PBS包被缓冲液稀释至浓度分别为1 μM、5 μM、10 μM或20 μM，随后加入到ELISA板中，加入量为100 μL/孔，4℃过夜包被；

去除包被液，加入300 μL含有0.05% Tween20的1×PBST洗涤缓冲液，静置20 s，洗板3次，拍板；加入封闭液100 μL/孔，室温封闭2 h，37℃孵育1 h；

封闭结束后去除封闭液，将ELISA板拍干；

向酶标板中加入生物素标记S蛋白100 μL/孔，调控浓度比例，设置重复对照，封板后37℃培养90 min，拍板洗涤数次；

加入100 μL酶结合物工作液至反应孔中，封板后37℃培养30 min，拍板洗涤数次；

加入100 μL显色底物至反应孔中，封板后37℃培养15 min；

加入50 μL终止液，即刻用酶标仪测量450 nm波长下的OD值。

如图3所示，采用ELISA方法定性考察多肽与S蛋白的结合能力，结果显示，28条多肽与S蛋白均具有结合能力，但是结合能力存在差异，比如相比于其他多肽，KWPFKKS（SEQID NO: 11）、PIGVPHT（SEQ ID NO: 17）、GVVFLHVTYV（SEQ ID NO: 27）、AAARFST（SEQ IDNO: 16）和FVFLVLL（SEQ ID NO: 21）与S蛋白具有更强的结合能力，因此通过ELISA的结果进一步可以筛选出结合力相对更强的多肽。

为定量考察多肽与蛋白的结合，通过SPRi的方法测试多肽与蛋白的结合常数Kd。示例性地，如图4（A）、图4（B）和图4（C）所示，多肽KWPFKKS（SEQ ID NO: 11）、PIGVPHT（SEQID NO: 17）、NSGGSVH（SEQ ID NO: 15）的Kd值在10^-7~10^-9，说明多肽与S蛋白能很好的结合，具有很好的靶向作用。

实施例5 多肽的抗病毒效果

本实施例考察多肽抗病毒效果。示例性地，如图5（A）、图5（B）和图5（C）所示分别为多肽KWPFKKS（SEQ ID NO: 11）、PIGVPHT（SEQ ID NO: 17）、NSGGSVH（SEQ ID NO: 15）的抗病毒效果，随着浓度的增高，多肽表现出明显的抗病毒效果。纵坐标为荧光强度，横坐标为浓度，荧光强度越高表明抗病毒效果越好。

实施例6

本实施例对多肽PIGVPHT（SEQ ID NO: 17）、KWPFKKS（SEQ ID NO: 11）和NSGGSVH（SEQ ID NO: 15）作为活性肽进行了扩充，以验证在SEQ ID NO: 1~28的N端和C端添加序列后，得到新肽仍然具有结合S蛋白的活性。

图6（A）为在PIGVPHT的N端添加KGAG后得到的新肽的质谱图，图6（B）为在PIGVPHT的C端添加KGAG后得到的新肽的质谱图，图6（C）为在PIGVPHT的N端添加C12后得到的新肽的质谱图。

如图7所示，KGAGPIGVPHT（1’）、PIGVPHTKGAG（2’）、C12-PIGVPHT（3’）、KAAGGKWPFKKS（4’）、C12-KWPFKKS（5’）、NSGGSVHKNSG（6’）和GGAANSGGSVH（7’）与S蛋白均具有结合能力，说明以筛选的多肽SEQ ID NO: 1~28为功能性序列、在N端和/或C端添加序列后并不影响原多肽的S蛋白结合活性，获得的新肽同样具有结合S蛋白的能力。

如图8（A）、图8（B）、图8（C）、图8（D）、图8（E）、图8（F）和图8（G）所示分别为新肽1’、2’、3’、4’、5’、6’和7’与蛋白的结合常数Kd，Kd值在10^-7~10^-9，说明新肽与S蛋白能很好的结合，具有很好的靶向作用。

如图9所示为多肽KWPFKKS（SEQ ID NO: 11）及经过衍生后的新肽二级结构变化图，说明新肽并没有影响活性多肽的二级结构的变化。

综上所述，本发明采用OBOC法合成多肽库，筛选得到靶向冠状病毒COVID-19的S蛋白的多肽，所述多肽与S蛋白结合能力强，由此构建的免疫检测试剂盒为快速诊断病人提供了支持；本发明的多肽筛选方法具有通量高、筛选效率高等优势，为发现与新型冠状病毒结合的多肽提供了简便易行的方法。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家纳米科学中心

<120> 靶向新型冠状病毒COVID-19的多肽及其应用

<130> 20200520

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Phe Arg His Thr His Arg

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Phe Asn Arg His Thr His Arg

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ile Gly Val Arg Gly Gly Trp

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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Lys Trp Pro Tyr Lys Lys Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys Thr Tyr His Thr His Arg

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ile Arg Gln Phe Phe Lys Lys

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Phe Tyr Ile Lys Ile Asn His

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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Lys Ser Pro Pro Tyr His Lys

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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Lys Pro Tyr Ile Trp Lys Ser

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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Lys Trp Pro Phe Lys Lys Ser

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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<211> 7

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<211> 7

<212> PRT

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<400> 14

Gln Gly Thr His Thr Ala His

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Asn Ser Gly Gly Ser Val His

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Ala Ala Ala Arg Phe Ser Thr

1 5

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Pro Ile Gly Val Pro His Thr

1 5

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln

1 5

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His

1 5

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Phe Val Phe Leu Val Leu Leu

1 5

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Val Val Ile Gly Ile Val Asn

1 5

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr

1 5

<210> 24

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu

1 5

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Arg

1 5 10

<210> 29

<211> 1273

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒

<400> 29

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

Claims

1.靶向冠状病毒COVID-19的多肽，其特征在于，所述多肽为如SEQ ID NO: 11、15或17所示的氨基酸序列。

2.靶向冠状病毒COVID-19的分子，其特征在于，所述分子为KGAGPIGVPHT、PIGVPHTKGAG、月桂酸-PIGVPHT、KAAGGKWPFKKS、月桂酸-KWPFKKS、NSGGSVHKNSG和GGAANSGGSVH。

3.一种冠状病毒COVID-19检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被多肽或包被分子；其中，

所述多肽为权利要求1所述的多肽，所述分子为权利要求2所述的分子。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述包被多肽或包被分子直接和/或间接包被在固相载体上。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括酶标板、磁珠、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括S蛋白的特异性抗体。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述S蛋白的特异性抗体上标记有信号基团。

8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括显色液和/或终止液。

9.一种如权利要求1所述的多肽和/或如权利要求2所述的分子在制备冠状病毒COVID-19检测试剂和/或治疗药物中的应用。