CN111494431A

CN111494431A - 益生菌在制备治疗肝脏疾病制剂中的应用

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Publication number: CN111494431A
Application number: CN202010350791.6A
Authority: CN
Inventors: 龙乔明; 龙光宇
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-04-28
Also published as: CN111494431B

Abstract

本发明涉及益生菌组合物在制备治疗肝脏疾病制剂中的应用，益生菌组合物包括短双歧杆菌和植物乳杆菌。本发明公开了益生菌组合物的新用途，为开发新的治疗肝脏疾病的制剂提供了方向。

Description

益生菌在制备治疗肝脏疾病制剂中的应用

技术领域

本发明涉及肝脏疾病治疗制剂领域，尤其涉及一种益生菌在制备治疗肝脏疾病制剂中的应用。

背景技术

肝脏是人体重要的代谢器官，其主要功能包括葡萄糖原的合成和分解、血浆蛋白的合成、血红细胞的裂解、胆汁的合成和分泌及多种代谢中间产物的降解。由于遗传或外界因素(营养过量、酒精或药物中毒、病毒感染)的诱导，肝脏可发生多种疾病，包括酒精性肝损伤、非酒精脂肪肝、肝纤维化、肝衰竭、肝硬化与肝癌。肝病的诱因复杂、发病人数多且致死率高。然而，目前临床上对肝病的干预和治疗措施十分有限。

内质网是真核细胞中重要的细胞器，细胞内约三分之一的分泌蛋白和跨膜蛋白在这里合成、修饰及转运，同时内质网还负责细胞内的脂质合成以及钙离子的储存。为了维持蛋白质稳态，内质网必须要保证蛋白质折叠和成熟的保真度。然而在某些生理或者病理条件下，在内质网中合成的蛋白质不能被正确折叠而滞留在内质网中就会引起内质网应激。适度的内质网应激对于清除未折叠蛋白、恢复内质网稳态是有利的，但是持续的内质网应激就会诱导细胞凋亡。研究表明内质网应激至少与60多种疾病有关，包括帕金森症、糖尿病、癌症。

很多肝脏疾病都与内质网应激有着紧密的联系，例如非酒精性脂肪肝(NAFLD)、酒精性脂肪肝甚至肝细胞癌(HCC)。但是目前对于肝脏性内质网应激疾病仍然缺乏有效的治疗方法，因此寻求一种新型的、行之有效的方法用于治疗肝脏性内质网应激疾病具有重要的意义。

益生菌是与人体共生并且对健康有益的微生物的总称。近年来，随着人们对益生菌的研究进一步深入，益生菌对人类健康的诸多益处被公之于众，益生菌也因此受到人们的认可和重视。临床研究证明，益生菌对胃肠道疾病、过敏性疾病、肥胖、胰岛素抵抗等具有积极的治疗作用。另外益生菌还具有抗支气管感染、提高人体免疫力甚至抗癌的作用。

如CN200910194740.2、CN201210005581.9、CN201510467958.6、CN201811112858.1、CN201910515604.2、CN201910930726.8公开了一些用于治疗化学性肝损伤或酒精性肝损伤的制剂或组合物。CN201480012892.5公开了一种包含作为活性成分的菌株的组合物，并公开了其在抗炎性疾病中的应用。CN201580045802.7公开了一种青春双歧杆菌的新型分离菌株，同时还公开了新型菌株用于预防、减轻症状、以及治疗具有潜在受损的肠道屏障功能和粘膜的促炎激活的疾病或病状的用途。CN201880031802.5公开了用于降低病原体毒力的益生菌分子，可用于预防和/或治疗受试者的非肠道感染。

但是，益生菌对人类健康的有益效果取决于益生菌的种类、使用的剂量以及疾病的类型，不同种类不同功能的益生菌细胞壁成分也有所不同，因此合理地使用益生菌才能让益生菌更好的造福于人类。因此，开发基于益生菌的疾病治疗制剂，甚至是对肝脏内质网应激疾病具有治疗效果的制剂十分必要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种益生菌在制备治疗肝脏疾病制剂中的应用，本发明公开了益生菌组合物的新用途，为开发新的治疗肝脏疾病的制剂提供了方向。

本发明公开了益生菌组合物在制备治疗肝脏疾病制剂中的应用，益生菌组合物包括短双歧杆菌和植物乳杆菌。

进一步地，肝脏疾病由肝细胞的内质网应激(ERS)导致。

进一步地，肝脏疾病包括非酒精性脂肪肝(NAFLD)和/或肝细胞癌(HCC)。

进一步地，短双歧杆菌选自短双歧杆菌(BNCC164835)。

进一步地，植物乳杆菌选自植物乳杆菌(BNCC174658)和/或植物乳杆菌(BNCC162960)。

优选地，益生菌组合物由短双歧杆菌(BNCC164835)、植物乳杆菌(BNCC174658)和植物乳杆菌(BNCC162960)组成。

进一步地，本发明的益生菌组合物可抑制肝病引起的体重下降；降低血清中ALT、AST、ALP水平；降低巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞水平；提高CD8+CD44+T细胞水平和CD8+CD44+CD62L+T细胞水平。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明公开了益生菌组合物对肝脏ERS具有干预效果，对于为肝脏ERS疾病寻找到一种新型的、安全、经济的治疗策略；本发明对本领域了解益生菌的功效以及指导益生菌使用方面都具有重要的意义。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

图1为不同实验组小鼠肝重比测试结果；

图2为不同实验组小鼠肝损伤指标测试结果；

图3为不同实验组小鼠巨噬细胞水平测试结果；

图4为不同实验组小鼠NK细胞水平测试结果；

图5为不同实验组小鼠NKT细胞水平测试结果；

图6为不同实验组小鼠CD4+T细胞水平测试结果；

图7为不同实验组小鼠CD8+T细胞水平测试结果；

图8为不同实验组小鼠CD4+T细胞与CD8+T细胞比值测试结果；

图9为不同实验组小鼠CD8+CD44+T细胞水平测试结果；

图10为不同实验组小鼠CD8+CD44+CD62L+T细胞水平测试结果；

图11为不同实验组小鼠CD8+CD44+CD62L-T细胞水平测试结果。

具体实施方式

本发明以下实施例中，使用的菌株包括短双歧杆菌BNCC164835(购买自北纳生物)、植物乳杆菌BNCC17465(购买自北纳生物)、植物乳杆菌BNCC162960(购买自北纳生物)；同时采用可通过商业途径获得的两种普通益生菌组合物作为对照，这两种商品分别为产地为苏州的复合益生菌颗粒固体饮料(以下简称苏州益生菌，其中包括乳双歧杆菌、长双歧杆菌BL21、青春双歧杆菌、两双歧杆菌、嗜酸乳杆菌LA85、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌Lp90、副干酪乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌)以及产地为美国的复合益生菌商品(以下简称美国益生菌，其中含有干燥乳酸菌族、干燥肠球菌、干燥嗜乳酸杆菌以及其他辅料)。

本发明中，培养上述益生菌所用的培养基如下：

(1)MRS液体培养基：用于植物乳杆菌2BNCC162960、植物乳杆菌BNCC17465、苏州益生菌及美国益生菌产品的培养。配方为：酪胨10.0g，牛肉粉8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g，蒸馏水1000mL。pH6.2±0.2。121℃灭菌15min。(MRS固体培养基每升添加15g琼脂)。

(2)双歧杆菌液体培养基：用于短双歧杆菌BNCC164835的培养。配方为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，酵母粉10.0g，葡萄糖10.0g，盐溶液40.0mL，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g(培养基煮沸后加入)，0.1％刃天青1.0mL，蒸馏水1.0L，pH7.0。以上液体培养基在接种前煮沸驱氧后接种，于厌氧罐中培养。其中，盐溶液配方为：CaCl₂ 0.2g，MgSO₄ 7H₂O0.48g，K₂HPO₄1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，NaHCO₃ 10.0g，NaCl 2.0g，混合CaCl₂和MgSO₄在300mL蒸馏水中直至溶解，加500mL蒸馏水，边搅拌边缓慢加入其他盐类，继续搅拌至全部溶解，加200mL蒸馏水混匀，保存于4℃下备用(双歧杆菌固体培养基每升添加15g琼脂)。

本发明中，对于短双歧杆菌BNCC164835、植物乳杆菌BNCC17465、植物乳杆菌BNCC162960的培养方法如下：

1.在超净工作台将冻存于-80℃冰箱的短双歧杆菌BNCC164835、植物乳杆菌BNCC17465、植物乳杆菌BNCC162960菌种接种于15mL液体培养基。

2.将接种好的液体培养基置于30℃恒温培养箱静置过夜培养，待菌长出后再传一代。

3.待传代后的菌液生长到OD600＝1.2左右时取出。

4.将菌液4℃4000g离心10分钟，在超净工作台弃去上清，用无菌PBS洗两次，放于4度冰箱待用。

对于苏州益生菌、美国益生菌产品所含益生菌的培养方法如下：

1.在超净工作台将苏州、美国益生菌产品溶于50mL MRS液体培养基，放置于30℃恒温培养箱静置培养。

2.将过夜培养的两种益生菌产品各取100微升稀释10⁵倍。再各取稀释后的两种益生菌产品100微升涂布于MRS固体培养基，一式两份。一份放置于30℃恒温培养箱过夜静置培养，一份放置于厌氧培养袋中在置于30℃恒温培养箱中过夜静置培养，以保证益生菌产品中的厌氧菌与好氧菌都能生长。

3.从固体培养基上挑取长出来的菌落，接种到15mL液体MRS培养基，放置于30℃恒温培养箱静置培养。

4.待菌液生长到OD 600＝1.2左右时取出。

5.将菌液4℃下4000g离心10分钟，在超净工作台弃去上清，用无菌PBS洗两次，放于4℃冰箱待用。

为了研究益生菌对肝脏ERS的影响，本发明使用Cre/lox***将小鼠肝脏细胞ERAD重要组分SEL1L特异敲除。缺少了SEL1L的肝细胞不能将未折叠蛋白运输到细胞质交由蛋白酶体降解，从而积累在内质网中引发小鼠肝脏内质网应激。然后利用上述不同的益生菌对肝脏ERS小鼠进行长期干预，从肝损伤程度、免疫***等多方面分析益生菌对肝脏ERS小鼠的干预效果。

本发明以下实施例的数据处理过程中，使用SPSS 22.0对实验数据进行差异显著性分析，各实验组间采用LSD检验均数比较，与KO PBS组相比，p<0.05标注*，p<0.01标注**，p<0.001标注***。

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一、菌株预处理

1.在超净工作台将短双歧杆菌BNCC164835、植物乳杆菌BNCC17465、植物乳杆菌BNCC162960接种于各自对应的液体培养基。

2.将苏州、美国益生菌产品溶解于10mL MRS培养基，分装冻存(500微升50％甘油+500微升菌悬液)。每次培养取一管冻存菌株接种至50mL MRS液体培养基。

3.将接种好的培养基放置于30℃恒温培养箱，静置培养。

4.待菌液生长到OD600＝1.2时取出，在4℃、5000g的条件下，离心20分钟。

5.在超净工作台弃去上清，沉淀用无菌PBS重悬，4℃、5000g再次离心20分钟。

6.弃上清沉淀用30mL无菌PBS重悬。

7.利用平板计数法计算各菌悬液的活菌数，在计数完成后将各菌悬液用无菌PBS稀释到1×10⁹CFU/mL置于4℃备用，菌液每两周重新培养一次。

二、动物饲养和分组

本发明中，对照组小鼠为129sv小鼠，实验组是在129sv小鼠的基础上，肝脏SEL1L特异性敲除的内质网应激小鼠。其中，实验动物被分为5组，每组7只小鼠，具体分组情况见表1。动物自由摄食、饮水，饲养环境温度为20～26℃，湿度40％～70％，光照为12h光暗交替。每周更换2次垫料。每次每只小鼠灌胃的菌浓度为1×10⁹CFU/mL，灌胃体积为0.2mL，即每只小鼠每天的灌胃菌量为2×10⁸CFU。

表1实验动物分组情况

实施例2

按照实施例1的方法，在实验开始前记录一次各组小鼠体重，实验开始后每周记录一次小鼠体重，直到第十六周实验结束，以测试小鼠体重、进食量变化情况。

自小鼠二月龄开始对肝脏ERS小鼠实施益生菌干预，持续四个月，小鼠体重变化如表2所示。在小鼠二月龄时，与WT PBS组比较，KO PBS组小鼠体重显著降低(P<0.05)，使用不同组益生菌干预后，小鼠在体重上均未出现显著变化(P>0.05)；在小鼠六月龄时，与WT PBS组比较，KO PBS组小鼠体重极显著降低(P<0.01)，使用不同组益生菌干预后，小鼠在体重上均未出现显著变化(P>0.05)；在体重增加量上，与WT PBS组比较，KO PBS组小鼠体重增加量极显著减少(P<0.01)，使用不同组益生菌干预后，小鼠在体重增加量上均未出现显著变化(P>0.05)。

表2益生菌对肝脏ERS小鼠体重的影响

实施例3

按照实施例1的方法，在实验进行十六周以后，进行小鼠样品的收集。

1.血清获取：添加10微升1mg/mL的肝素钠于1.5mL离心管，使收集小鼠新鲜血液于上述离心管中。在4℃、12000g条件下离心10分钟，用小量程移液枪小心吸取上层液体即为血清。冻存于-80备用。

2.组织获取：小鼠脊椎脱臼处死，解剖取小鼠肝脏、脾脏、外周淋巴、肠道淋巴。

小鼠的肝重比往往用来作为判断肝损伤的一个重要指标。对肝脏ERS小鼠进行益生菌干预并收集样品后，称取小鼠肝重、最终体重，计算肝重比，其中，肝重比＝小鼠肝重/小鼠体重。结果如图1所示，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组肝重比上明显高于正常的WT PBS组小鼠(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在肝重比上较KO PBS组极显著下降(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间肝重比无显著差异(P>0.05)。以上结果表明肝脏ERS会引起严重的肝脏病变，使用益生菌干预后，起到了延缓肝脏病变的积极作用。

谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)正常情况下主要存在于肝细胞浆内，当肝细胞发生损伤或坏死，会释放进血液中，会使血清中的这些指标含量升高，是反映肝细胞受损程度最灵敏的指标。取小鼠血清30微升，稀释三倍，使用全自动生化分析仪检测小鼠血清中肝损伤指标ALT、AST、ALP水平。

益生菌对肝脏ERS小鼠血清ALT水平的影响如图2a所示，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组血清ALT水平极其显著上升(P<0.001)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在血清ALT水平上较KO PBS组极显著下降(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间血清ALT水平无显著差异(P>0.05)。

益生菌对肝脏ERS小鼠血清AST水平的影响如图2b所示，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组血清AST水平极其显著上升(P<0.001)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在血清AST水平上较KO PBS组极显著下降(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间血清AST水平无显著差异(P>0.05)。

益生菌对肝脏ERS小鼠血清ALP水平的影响如图2c所示，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组血清ALP水平极其显著上升(P<0.001)；KO EG组在ALP水平上极显著低于KOPBS组(P<0.01)；KO SUZHOU组、KO MEIGUO与KO PBS组相比较在ALP水平上显著降低(P<0.05)。KO EG组下调ALP的水平比KO SUZHOU组、KO MEIGUO组更为显著(P<0.05)。

以上结果表明，使用益生菌干预后，小鼠(KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组)ALT、AST、ALP水平均显著降低，且KO EG组降低ALP的趋势较KO SUZHOU组与KO MEIGUO组更为显著。这表明益生菌能显著降低肝脏ERS小鼠肝细胞损伤程度，并且本发明所用的三种益生菌组合物相对于普通益生菌在降低ALP水平上有更好的疗效。由于ALP除了用于诊断肝损伤，同时也是原发性和继发性肝癌的诊断标准。因此，本发明的三种益生菌组合物相对于普通菌株也许具有更好的抗肝癌效果。

实施例4

按照实施例1的方法，在实验进行十六周以后，对小鼠进行免疫分析，方法如下：

(1)准备小鼠脾脏、肠系***、旁系***细胞

1.分离小鼠脾脏，放置在适量1640完全培养基中(10％胎牛血清+1％青链霉素)。

2.在培养皿中使用玻璃片研磨脾脏，并用巴氏吸管将研磨好的细胞悬液转移至15mL离心管中，注意避开块状组织，1600rpm离心5分钟，弃上清。

3.向沉淀中加入2mL红细胞裂解液(RBC)，充分混匀，室温孵育五分钟。

4.加入4-5mL 1640完全培养基终止RBC裂解液，1600rpm离心5分钟，弃上清。

5.加入4mL 1640完全培养基使细胞重悬，置于冰盒中。

(2)配置抗体

在FASC Buffer中稀释抗体(配置成抗体Mix)，针对不同细胞群体的抗体Mix配方如下：

(a)巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞

细胞表面分子标记	抗体
		Live	eFluor 506
CD3	Alexa Fluor 700
		CD19	PerCP-Cy5.5
NK1.1	PE-Cy7
		F4-80	APC
CD11b	Qdot 700

(b)T细胞

细胞表面分子标记	抗体
		Live	eFluor 506
CD4	eVolve 605
		CD8	BV711
CD44	APC-Cy7
		CD62L	Pacific Blue

(3)细胞表面染色

1、向96孔板中加入100微升细胞悬液，再加入100微升FASC Buffer/孔，1600rpm离心5分钟，弃上清。

2、向细胞沉淀中加入50微升配置好的抗体Mix/孔，并设置一个空白对照(向细胞沉淀中加入50微升FASC Buffer/孔)。放置于4度冰盒避光染色25分钟-30分钟。

3、染色过后加入150微升FASC Buffer/孔，洗涤1-2遍，1600rpm离心5分钟，弃去上清。

4、加入150微升FASC Buffer/孔，将细胞均匀重悬，再将细胞悬液转移到标好名字的1.5mL离心管中，在离心管中补加150微升FASC Buffer，利用流式细胞仪对细胞进行检测。

5、流式细胞仪对细胞进行检测后的结果使用FlowJo_V10软件进行分析。

巨噬细胞(Macrophages)是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，细胞表面分子标记为CD11b+F-80+。巨噬细胞是吞噬细胞的一种，属于非特异性免疫应答的细胞成分。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行吞噬及消化，并激活淋巴球或其他免疫细胞，令其对病原体做出反应。利用流式细胞仪对小鼠的脾脏、外周***、肠系***中的巨噬细胞进行分析，结果如图3所示。

在小鼠脾脏中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组巨噬细胞水平极显著上升(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在巨噬细胞水平上显著低于KO PBS组(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)，但KO EG组降低肝脏ERS小鼠脾脏巨噬细胞的水平更为明显。

在小鼠外周***中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组巨噬细胞水平显著上升(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在巨噬细胞水平上显著低于KO PBS组(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)。

在小鼠肠系***中，巨噬细胞的变化趋势与在小鼠脾脏中相同。

研究表明巨噬细胞的升高与机体的免疫活化紧密相关，细胞凋亡或坏死产生的细胞碎片增多，或者病原体入侵都会导致巨噬细胞数量的增加。因此，肝脏ERS小鼠(KO PBS组)中巨噬细胞的增多很大程度上是由于小鼠体内损伤或凋亡细胞增多导致的。益生菌干预后，巨噬细胞水平显著下降，说明体内细胞碎片等“异物”减少，机体免疫环境明显好转。

NK细胞属于非特异性免疫的细胞成分，一般认为来自于骨髓淋巴样干细胞，细胞表面分子标记为CD3-NK1.1+。NK细胞在未经抗原预先致敏和没有特异性抗体或补体参与的条件下，就可以对多种肿瘤和病毒感染的靶细胞产生杀伤作用，在机体早期抗肿瘤与病毒感染的免疫防御中具有重要作用。利用流式细胞仪对小鼠的脾脏、外周***、肠系***中的NK细胞进行分析，结果如图4所示。

在小鼠脾脏中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组NK细胞水平极显著上升(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在NK细胞水平上显著低于KO PBS组(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)，但KO EG组降低肝脏ERS小鼠脾脏NK细胞的水平更为明显。

在小鼠外周***中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组NK细胞水平显著上升(P<0.05)。KO PBS组、KO EG组、KO SUZHOU组与KO MEIGUO组之间在NK细胞水平上未出现显著性差异(P>0.05)，但KO EG组、KO SUZHOU组与KO MEIGUO组较KO PBS组在NK细胞水平上有明显下降的趋势。

在小鼠肠系***中，NK细胞的变化趋势与在小鼠外周***中相同。

NKT细胞是一群细胞表面既有T细胞受体，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。由CD4+CD8+双阳性细胞偏离于主流的T细胞分化途径而分化产生，细胞表面分子标记为CD3+NK1.1+。NKT细胞主要发挥免疫调节和细胞毒作用，NKT细胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4，IFN-γ，GM-CSF，IL-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用；活化后的NKT细胞具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为穿孔素，Fas配体以及IFN-γ。利用流式细胞仪对小鼠的脾脏、外周***、肠系***中的NKT细胞进行分析，结果如图5所示。

在小鼠脾脏中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组NKT细胞水平极显著上升(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在NK细胞水平上显著低于KO PBS组(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)，但KO EG组降低肝脏ERS小鼠脾脏NKT细胞的水平更为明显。

在小鼠外周***中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组NKT细胞水平显著上升(P<0.05)。KO PBS组、KO EG组、KO SUZHOU组与KO MEIGUO组之间在NKT细胞水平上未出现显著性差异(P>0.05)，但KO EG组、KO SUZHOU组与KO MEIGUO组较KO PBS组在NKT细胞水平上有明显下降的趋势。

在小鼠肠系***中，变化趋势与在小鼠外周***中相同。

对小鼠免疫器官中NK细胞、NKT细胞进行分析(图4-5)，结果表明肝脏ERS小鼠(KOPBS组)在不同免疫器官中的NK细胞、NKT细胞水平都显著高于正常小鼠(WT PBS组)，使用益生菌干预后的小鼠(KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组)脾脏中的NK细胞、NKT细胞水平都显著下降，在外周***和旁系***中的NK细胞、NKT细胞虽出现下降的趋势，但未出现显著性差异。说明在肝脏ERS小鼠体内早期肿瘤细胞或者异常细胞增多，益生菌干预后明显减少。至于在外周***和肠系***中未见到益生菌干预的肝脏ERS小鼠NK细胞、NKT细胞水平显著降低，可能是由于细胞数较少导致的。

CD4+T细胞一般为辅助性T淋巴细胞，能够分泌多种细胞因子调节或协助免疫反应。利用流式细胞仪对小鼠的脾脏、外周***、肠系***中的CD4+T细胞进行分析，结果如图6所示。

在小鼠脾脏中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组CD4+T细胞水平极显著下降(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在CD4+T细胞水平上显著高于KO PBS组(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)。

在小鼠外周***和肠系***中，CD4+T细胞的变化趋势与在小鼠脾脏中相同。

人体内的T细胞除了CD4+T细胞外，还有一类主要的T细胞群-CD8+T细胞。CD8+T细胞是体内的细胞毒性T细胞，可以特异性杀伤肿瘤细胞和异常的自身细胞。利用流式细胞仪对小鼠的脾脏、外周***、肠系***中的CD8+T细胞进行分析，结果如图7所示。不同组小鼠免疫器官中的CD8+T细胞水平未出现统计学差异(P>0.05)。

CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值对于判断机体内的免疫状态具有重要的意义。小鼠脾脏、外周***、肠系***中CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值如图8所示。

在小鼠脾脏中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组CD4+T细胞与CD8+T细胞比值显著下降(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在CD4+T细胞与CD8+T细胞比值上显著高于KO PBS组(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)。

在小鼠的外周***中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组CD4+T细胞与CD8+T细胞比值极显著下降(P<0.01)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组在CD4+T细胞与CD8+T细胞比值上显著高于KO PBS组(P<0.05)。KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)。

在小鼠肠系***中，CD4+T细胞与CD8+T细胞比值变化趋势与在小鼠外周***中相同。

通过对小鼠免疫器官中CD4+T细胞、CD8+T细胞以及CD4+T细胞/CD8+T细胞比值进行分析，发现肝脏ERS小鼠(KO PBS组)在不同免疫器官中CD4+T细胞水平较正常小鼠(WTPBS组)都极显著降低，使用益生菌干预后的小鼠(KO EG组、KO SUZHOU组、KO MEIGUO组)不同免疫器官中CD4+T细胞水平都显著回升(图6)；CD8+T细胞在各组小鼠之间未出现显著性差异(图7)；而CD4+T细胞/CD8+T细胞的比值变化(图8)同CD4+T细胞水平变化趋势一致。说明肝脏ERS小鼠体内细胞免疫严重失调，并且这主要是由于CD4+T细胞的减少导致的。使用益生菌干预后，CD4+T细胞数量增多，细胞免疫状态得到改善。体内CD8+T细胞在个组小鼠之间虽未出现显著差异，但是肝脏ERS小鼠较正常小鼠在CD8+T细胞水平上有上升的趋势，可能是由于小鼠肝细胞ERAD***被破坏，长期处于ERS状态，机体出于对自身肝脏的保护，始终保持低水平的细胞毒性T细胞。

CD8+CD44+T细胞是记忆性细胞毒性T细胞，包括CD8+CD44+CD62L+(中央型记忆性细胞毒性T细胞)与CD8+CD44+CD62L-(效应型记忆性细胞毒性T细胞)两种。CD8+CD44+T细胞可以长期对机体产生保护效应。当体内再次出现相同的抗原时，CD8+CD44+T细胞能够迅速分化，产生更强烈的免疫应答，从而发挥有效的免疫防御功能。利用流式细胞仪对小鼠的脾脏、外周***、肠系***中的CD8+CD44+T细胞进行分析，结果如图9所示。

在小鼠脾脏中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组CD8+CD44+T细胞水平极显著上升(P<0.01)。KO EG组在CD8+CD44+T细胞水平上较KO PBS组极显著升高(P<0.01)，KOSUZHOU组与KO MEIGUO组在CD8+CD44+T细胞水平上较KO PBS组显著升高(P<0.05)。另外，KOEG组与KO SUZHOU组、KO MEIGUO组相比，CD8+CD44+T细胞水平显著增高(P<0.05)。KOSUZHOU组与KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)。

在小鼠外周***与肠系***中，CD8+CD44+T细胞的变化趋势与小鼠脾脏中相同。

以上结果说明肝脏ERS小鼠体内为了应对肝脏ERS显著提高了CD8+CD44+T细胞水平，增强了对异常细胞的处理能力。采用本发明的益生菌组合物干预后，肝脏ERS小鼠体内CD8+CD44+T细胞水平获得进一步提高，机体对异常细胞的处理能力更为强大。

CD8+CD44+CD62L+T细胞是体内的中央型记忆性细胞毒性T细胞，由于CD62L黏附分子的表达，使得CD8+CD44+CD62L+T细胞往往定居于外周免疫器官。并且CD8+CD44+CD62L+T细胞具有自我更新及复制能力，在体内存活时间长，当再次接受同种抗原刺激时，能迅速分化成CD8+CD44+CD62L-(效应型记忆性细胞毒性T细胞)对靶细胞执行杀伤作用。利用流式细胞仪对小鼠的脾脏、外周***、肠系***中的CD8+CD44+CD62L+T细胞进行分析，结果如图10所示。

在小鼠脾脏中，KO PBS组与WT PBS组相比较，KO PBS组CD8+CD44+CD62L+T细胞水平极显著上升(P<0.01)。KO EG组在CD8+CD44+CD62L+T细胞水平上较KO PBS组极显著升高(P<0.01)，KO SUZHOU组与KO MEIGUO组在CD8+CD44+CD62L+T细胞水平上较KO PBS组显著升高(P<0.05)。另外，KO EG组与KO SUZHOU组、KO MEIGUO组相比，CCD8+CD44+CD62L+T细胞水平显著增高(P<0.05)。KO SUZHOU组与KO MEIGUO组之间未出现显著性差异(P>0.05)。

在小鼠外周***与肠系***中，CD8+CD44+CD62L+T细胞水平的变化趋势与小鼠脾脏中相同。

T细胞是CD8+CD44+T细胞对靶细胞实行杀伤作用的执行者，利用流式细胞仪对小鼠的脾脏、外周***、肠系***中的CD8+CD44+CD62L-T细胞进行分析，结果如图11所示不同组小鼠免疫器官中的CD8+CD44+CD62L-T细胞水平未出现统计学差异(P>0.05)。

小鼠CD8+CD44+CD62L+T细胞水平的变化趋势与CD8+CD44+T细胞相一致(图10)，而小鼠CD8+CD44+CD62L-T细胞水平未见显著性差异(图11)，说明CD8+CD44+T细胞的变化主要是由CD8+CD44+CD62L+T细胞引起的。因此，肝脏ERS小鼠主要通过增加CD8+CD44+CD62L+T细胞水平来应对肝细胞ERS，使用本发明的益生菌组合物EG干预后，CD8+CD44+CD62L+T细胞水平进一步升高，机体对异常细胞的监控能力、处理能力进一步加强。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.益生菌组合物在制备治疗肝脏疾病制剂中的应用，所述益生菌组合物包括短双歧杆菌和植物乳杆菌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：肝脏疾病由肝细胞的内质网应激导致。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：肝脏疾病包括非酒精性脂肪肝和/或肝细胞癌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述短双歧杆菌选自短双歧杆菌(BNCC164835)。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物乳杆菌选自植物乳杆菌(BNCC174658)和/或植物乳杆菌(BNCC162960)。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述益生菌组合物由短双歧杆菌(BNCC164835)、植物乳杆菌(BNCC174658)和植物乳杆菌(BNCC162960)组成。