CN111485007A - 通过脂肪酶水解具有高熔点的油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于油加工领域，具体地，本发明涉及通过脂肪酶水解具有高熔点的油如氢化蓖麻油(HCO)的方法。在本发明的一个实施方案中，提供了水解具有较高熔点的油以获得水解产物的方法，所述方法包括：将水、有机溶剂和脂肪酶与所述油混合以形成混合物的步骤，以及水解所述混合物中的所述油的步骤，其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶，并且所述有机溶剂是选自空间位阻醇、非极性有机溶剂、以及水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的混合物中的任何一种。
Description
技术领域
本发明属于油加工领域，具体地，本发明涉及通过脂肪酶水解具有高熔点的油、例如氢化蓖麻油(HCO)的方法。
背景技术
12-羟基硬脂酸(12-HSA)是在12位具有羟基基团的18-碳脂肪酸，其分子式为CH3(CH2)5CH(OH)(CH2)10COOH。其在室温下呈白色至奶油色薄片或针状晶体的形式，熔点为72℃至77℃。由于12-HSA含有羟基基团和羧基基团二者，所以12-HSA具有特定的化学性质，使其成为化学工业的重要原料。还将12-HSA用作塑料生产中的中间产物或化妆品生产的原料。
主要有两种方式来制备12-HSA。一种是在高温和高压下水解蓖麻油，先得到蓖麻油酸，然后将蓖麻油酸氢化成12-HSA。在氢化过程中，蓖麻油酸中的羟基基团和羧基基团可能发生酯化反应，并导致聚合，这降低了12-HSA的产率。另一种方式是首先进行蓖麻油的氢化以得到氢化蓖麻油(HCO)，然后通过强碱水解，接着用强酸酸化以制备12-HSA。虽然该方式可以保护羟基基团免受破坏，但这种方法产生大量废水，从而造成环境污染。
通过HCO酶法水解制备12-HSA的新进展报道如下。
CN104946692A公开了在生物水解酶存在下水解HCO的方法，其中将HCO和去离子水按一定比例混合，进行三次水解以得到12-HSA。每次水解在“HCO:水:水解酶＝100:60～100:0.3～0.5”的质量比下进行。用于水解的温度为80℃至85℃，水解持续120分钟至180分钟。这种方法的反应温度高于80℃。由于大多数脂肪酶在高于50℃的温度下会失去或降低其酶活性，因此该方法排除了大多数脂肪酶，而只有几种通常昂贵的热稳定脂肪酶可适用。
JP61139396也公开了在75℃的温度下制备12-HSA的方法。其利用有机溶剂与水来溶解HCO，并且水解是由衍生自微生物的脂肪酶催化的，所述微生物属于色杆菌属(Chromobacterium)、根霉菌属(Rhizopus)、毛霉菌属(Mucor)或假单胞菌属(Pseudomonas)。该方法具有与在高温下进行的反应相同的缺点。
CN1473199A也报道了用于制备12-HSA的方法：主要是首先在15℃至50℃下通过一种或多种脂肪酶将蓖麻油转化为蓖麻油酸，然后将水解产物转化为12-HSA。尽管该方法在酶水解过程中具有低操作温度，但该方法导致羟基基团的损失和最终产物酸值的降低。
CN108239663A公开了在第一有机溶剂、第二有机溶剂和水的存在下在低温酶法水解HCO的方法。水解在35℃至55℃、优选在45℃至50℃进行。将来自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶、来自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶与单酰基甘油脂肪酶的任意两种组合使用以实现86.21％的最大水解率。该方法大量使用脂肪酶组合，导致了该方法的高成本，并且最终水解率仍然小于90％。
上述现有技术示出了通过多种方法制备12-HSA，其具有多种缺点，如羟基基团的损失、水解温度高、适用的脂肪酶的选择有限、需要使用多种脂肪酶或成本高等。
因此，需要以廉价且高效的方式来制备12-HSA，如通过使用常用的脂肪酶在低温下酶法水解HCO，并实现高水解率。
发明内容
本发明的第一方面提供了用于水解具有高熔点的油的方法。所述方法包括将水、有机溶剂和脂肪酶与所述油混合以形成混合物的步骤，以及水解混合物中的油以获得水解产物的步骤，其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述具有较高熔点的油的熔点为40℃或更高，优选为45℃或更高，或者50℃或更高。术语“较高熔点”可以用“高熔点”代替。
在一个或多个实施方案中，所述具有较高熔点的油是氢化蓖麻油，并且水解产物是12-HSA。
在一个或多个实施方案中，所述方法用于制备12-HSA，其包括将水、有机溶剂和脂肪酶与氢化蓖麻油(HCO)混合以形成混合物的步骤，以及水解混合物中的HCO以获得水解产物的步骤，其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶衍生自棉毛状嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)。在一个或多个实施方案中，所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶选自Eversa Transform 2.0(Eversa)、脂肪酶LKT400XL、TLL-SH、其衍生物及其混合物。
在一个或多个实施方案中，在所述混合步骤之前，首先将所述具有较高熔点的油研磨成粉末形式，或者首先熔化。
在一个或多个实施方案中，所述粉末形式的直径长达3mm，优选长达0.5mm。
在一个或多个实施方案中，所添加的液体脂肪酶的体积(以mL计)与HCO的重量(以克计)的比值不小于0.2％，优选不小于0.3％，更优选为0.3％至2％，甚至更优选为0.3％至1％。通过使用液体脂肪酶溶液中的脂肪酶浓度或液体脂肪酶产品说明书中提供的脂肪酶活性单位，能够计算所使用的脂肪酶的重量或活性单位。因此，当脂肪酶以固体形式提供和添加时，能够估算脂肪酶与HCO的重量比，例如，重量比不小于50ppm，或不小于57ppm，或不小于75ppm，或不小于156ppm。
在一个或多个实施方案中，所述有机溶剂是选自空间位阻醇、非极性有机溶剂、以及水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的混合物中的任何一种。
在一个或多个实施方案中，所述非极性有机溶剂选自醚和含有5个至12个碳的饱和烃或其混合物。
在一个或多个实施方案中，所述饱和烃是含有5个至12个碳的短链至中链烷烃和环烷烃。
在一个或多个实施方案中，所述非极性有机溶剂选自异辛烷、正庚烷、环己烷、正己烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二***、正戊烷、环戊烷、石油醚和/或其混合物。
在一个或多个实施方案中，所述非极性有机溶剂选自异辛烷、正己烷或其混合物。
在一个或多个实施方案中，所述空间位阻醇是叔丁醇(t-BuOH)。
在一个或多个实施方案中，在水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的混合物中，所述水混溶性有机溶剂选自丙酮、叔丁醇等，和/或所述非极性有机溶剂选自正己烷、异辛烷、正庚烷、环己烷等。
在一个或多个实施方案中，水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的体积比小于50:50，优选为20:80至50:50，更优选为25:75至35:65，或30:70至40:60，最优选为30:70。
在一个或多个实施方案中，所述有机溶剂的体积(以mL计)与HCO的重量(以克计)的比值(V/W)大于75％，优选在100％至500％之间，更优选在200％至500％之间，甚至更优选在200％至300％之间，或者在300％至400％之间。
在一个或多个实施方案中，所添加的水量与所述HCO的重量比为15％至300％，更优选为30％至250％或100％至300％，甚至更优选为50％至250％，如150％至250％。
在一个或多个实施方案中，水解在35℃至60℃的温度下进行，例如在37℃至55℃、或40℃至55℃、更优选45℃至55℃、甚至更优选45℃至50℃并且最优选50℃的温度下进行。
在一个或多个实施方案中，存在在水解油的步骤期间产生的甘油。
在一个或多个实施方案中，在水解油的步骤之后，任选地存在移除水、甘油和有机溶剂的步骤。
在一个或多个实施方案中，在移除水、甘油和有机溶剂之后，水解过程的产物、即所述水解产物的酸值(mgKOH/g)高于160，优选高于165，更优选高于170，最优选高于175。
本发明的第二方面提供了通过水解具有高熔点的油的方法获得的产物，所述方法包括将水、有机溶剂和脂肪酶与所述油混合以形成混合物的步骤，以及水解所述混合物中的所述油以获得水解产物的步骤，其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶；优选地，所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶是衍生自棉毛状嗜热霉的脂肪酶，更优选选自Eversa、脂肪酶LKT400XL、TLL-SH、其衍生物及其混合物。
本发明的第三方面提供了脂肪酶在水解具有较高熔点的油中的用途，或在从HCO制备12-HSA中的用途，其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶；优选地，衍生自嗜热真菌属的脂肪酶是衍生自棉毛状嗜热霉的脂肪酶，更优选选自Eversa、脂肪酶LKT400XL、TLL-SH、其衍生物及其混合物。
本发明的第四方面提供了反应混合物，其包含具有高熔点的油、有机溶剂、水和脂肪酶，其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶；优选地，所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶是衍生自棉毛状嗜热霉的脂肪酶，更优选选自Eversa、脂肪酶LKT400XL、TLL-SH、其衍生物及其混合物。
具体实施方式
以下详细描述涉及可以实施本发明的具体细节和实施方案。足够详细地描述了这些实施方案，以使本领域技术人员能够实施本发明。在不脱离本发明的范围的情况下，可以采用其它实施方案，并且可以进行多种改变。
在多种实施方案的上下文中，应用于数值的术语“约”或“大约”涵盖精确值和合理的方差。
在多种实施方案的上下文中，除非另有说明，否则由“从A到B”或“A和B之间”表示的范围包括两个端点值。
如本文所用，术语“和/或”包括相关列出项目中的一个或多个的任意和全部组合。
本发明的目的是提高具有高熔点的油的酶水解率，增加最终产物的酸值，并缩短达到类似酸值的反应时间。具有高熔点的油的水解是通过使用脂肪酶在低温下进行的，并且最终水解率能够得到显著提高，其甚至可以直接满足最终产品规格。在目前的工业实践中，来自水解具有高熔点的油如HCO的酶水解产物通常不满足最终产品规格，需要进一步的水解步骤。
在本发明中，“高熔点”可以用“较高熔点”代替。“高熔点”或“较高熔点”意指40℃或更高、优选45℃或更高、或者50℃或更高的熔点。在本发明中，“具有高熔点的油”例如为HCO、棕榈硬脂、猪油等。在本发明中，“油底物”意指“具有高熔点的油”。
特别地，本发明涉及水解HCO以制备12-HSA。使用脂肪酶来进行水解，所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，衍生自嗜热真菌属的脂肪酶可以衍生自棉毛状嗜热霉、嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)、Thermomyces stellatus、Thermomycesibadanesis等。
在一个或多个实施方案中，衍生自嗜热真菌属的脂肪酶是衍生自棉毛状嗜热霉的脂肪酶，例如衍生自棉毛状嗜热霉并在米曲霉(Aspergillus oryzae)中产生的脂肪酶Eversa Transform 2.0(Eversa)，或衍生自嗜热真菌属并且具有与Eversa相似的酶特性的其它脂肪酶，如诺维信公司(Novozymes)的Callera
L、诺维信公司的
TL100L或
诺维信公司的Lipase NS-40116、绿微康公司(Leveking)(深圳)的脂肪酶LKT400XL。
在一个或多个实施方案中，所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶选自Eversa、脂肪酶LKT400XL、TLL-SH、其衍生物及其混合物。
脂肪酶LKT400XL是市售产品，其脂肪酶与Callera
L中的脂肪酶具有大于99％的同一性，Callera
L是由诺维信公司提供的棉毛状嗜热霉脂肪酶的液体制剂。TLL-SH是通过在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达来自棉毛状嗜热霉的野生脂肪酶序列获得的脂肪酶。
如本文所用，术语“衍生物”意指通过在酶的氨基酸序列中替换、缺失或添加一个或多个氨基酸、同时保持多肽的脂肪酶活性而产生的酶。本文的“多个”意指小于20个，优选小于10个，更优选小于8个，并且甚至更优选小于5个。术语“衍生自”意指酶是来自特定物种的野生型多肽或野生型多肽的天然或人工衍生物。
当在本发明的方法中使用时，衍生自嗜热真菌属的脂肪酶可以一次性添加或分批添加。脂肪酶也可以在所述方法中再循环和再使用，例如，可以收集反应混合物的水性层并在移除一些反应副产物之后再添加到混合物中。当以液体形式或溶液形式在商业上提供脂肪酶时，所述脂肪酶以液体形式添加。以液体形式添加的所述脂肪酶的量不小于油底物的0.2％体积与重量比(V/W，mL/g)，例如不小于0.3％如0.3％至2％，优选0.3％至1％，或0.5％至1％，或0.75％至1％，或0.8％至1％，或0.3％至0.5％，或0.3％。通过使用相应产品说明书中提供的脂肪酶浓度或脂肪酶活性单位，能够计算所用脂肪酶的重量或活性单位。因此，当以固体形式提供和添加脂肪酶时，能够估计脂肪酶与HCO的重量比，例如，脂肪酶与油底物的重量比可以不小于50ppm或不小于57ppm，不小于75ppm，不小于125ppm，不小于156ppm，不小于250ppm。优选地，以固体形式使用的脂肪酶在选自以下的范围内：57ppm至380ppm、95ppm至380ppm、152ppm至380ppm、142.5ppm至190ppm、152ppm至190ppm、50ppm至500ppm、75ppm至500ppm、75ppm至250ppm、或250ppm至500ppm、156ppm至1040ppm、260ppm至1040ppm、260ppm至520ppm，或这些范围的任意组合。
任选地，在混合步骤之前，首先将具有高熔点的油研磨成粉末形式。在一个或多个实施方案中，粉末形式的直径尺寸小于0.5毫米。粉末形式的尺寸可以通过使用光学显微镜或筛分方法来测量。通过添加粉末形式的油底物，增加了油底物的表面积并且改善了油与酶之间的相互作用，因此需要更少的酶。
油的研磨可以以常见方式进行，如手动地使用研钵和研杵、机械地使用研磨机或家用搅拌机等。
任选地，在混合步骤之前，具有高熔点的油先被熔化。
水解在有机溶剂的存在下进行。水解过程中可以添加一种或多种有机溶剂。可用于本发明方法的有机溶剂选自非极性有机溶剂、空间位阻醇、其混合物、以及水混溶性有机溶剂与非极性溶剂的混合物。
极性溶剂是具有大偶极矩(即部分电荷)的溶剂，因此包含在具有非常不同的电负性的原子如氧和氢之间的键。
在一个或多个实施方案中，空间位阻醇是叔丁醇(t-BuOH)。
在一个或多个实施方案中，非极性有机溶剂是醚和含有5至12个碳的饱和烃或其混合物。
在一个或多个实施方案中，所述饱和烃是含有5至12个碳的短链至中链烷烃和环烷烃。
在一个或多个实施方案中，所述非极性有机溶剂选自异辛烷、正庚烷、环己烷、正己烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二***、正戊烷、环戊烷、石油醚和/或其混合物。
优选地，所述有机溶剂是正己烷或异辛烷或其混合物。在一个或多个实施方案中，有机溶剂的体积(以mL计)与HCO的重量(以克计)的比值(V/W)大于75％，优选在100％至500％之间，更优选在200％至500％之间，甚至更优选在200％至300％之间，或者在300％至400％之间。
优选地，添加醚(如MTBE)作为有机溶剂。通过优化反应条件，能够获得酸值高于160或高于170的最终产物。
优选地，添加空间位阻醇(如t-BuOH)作为有机溶剂。
在一个或多个实施方案中，所述有机溶剂是水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的混合物。
水混溶性有机溶剂是能够与水以所有比例混合而形成均质溶液的那些溶剂。水混溶性有机溶剂在所述混合物中发挥的可能功能是促进有机相与水相之间的相互作用，从而促进油底物与脂肪酶之间的相互作用并加速水解。
所述水混溶性有机溶剂选自丙酮、t-BuOH等。
在一个或多个实施方案中，在有机溶剂的混合物中，水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的体积比小于50:50，优选为20:80至50:50，更优选为25:75至35:65，或30:70至40:60，最优选为30:70。
优选地，添加t-BuOH或丙酮与正己烷或异辛烷的混合物作为有机溶剂。通过优化反应条件，能够获得酸值高于160或高于170的最终产物。有机溶剂混合物的总体积(按mL计)与HCO的量(按克计)的比值为100％至300％，优选为150％至200％。
具有高熔点的油如HCO的水解是在水的存在下进行的。通常，水量可以根据酶的量和/或油底物的量和/或所添加的有机溶剂的类型/量来确定。当添加非极性有机溶剂时，通常水与油底物的重量比为15％至300％或30％至250％或50％至250％。当添加水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的混合物时，水与所述HCO的重量比为100％至300％，优选为150％至250％。为了最佳水解效果，本领域技术人员可以根据所用酶的量、反应温度、所用溶剂的类型/量、反应时间等来调节油与水之间的比例。
类似地，有机溶剂的合适量可以根据所用的其它试剂的量来调节。
为了进行本发明的水解过程，将油底物研磨成粉末形式，然后将粉末与水和有机溶剂混合，随后添加脂肪酶，并充分混合。混合可以通过涡旋、搅拌棒搅拌等进行，如在450rpm搅拌。如果以液体溶液形式添加脂肪酶，优选计算脂肪酶溶液中包含的水以从添加到混合物的水中扣除，使得水与油底物的重量比在上述范围内。
水解通常在35℃至60℃如37℃至55℃或40℃至55℃、更优选45℃至55℃、甚至更优选为45℃至50℃并且最优选50℃的温度下进行。当油底物与其它试剂混合时，混合物的温度逐渐升高到35℃至60℃范围内的温度以进行水解。通常，混合时温度会升高。可以在整个水解过程中继续进行搅拌。或者，可以先在略高于油底物熔点的温度下熔化油底物，然后通过搅拌或涡旋将熔化的油底物与水和有机溶剂缓慢地混合(如果油底物熔点非常高例如高于80℃，则将水和有机溶剂预冷)，以使***温度达到35℃至60℃。然后添加脂肪酶并进行水解。可以在整个水解过程中继续进行搅拌。
水解所需的时间没有严格限制。可以根据油底物的重量、脂肪酶的类型和所添加的脂肪酶的量确定水解时间。或者，可以随着水解过程取出样品并进行分析，例如，获得样品的酸值。当酸值或水解率达到一定值时，可以停止反应。
在一些实施方案中，反应时间少于80小时，优选不超过72小时，例如为48小时、36小时或24小时。
反应的直接产物的酸值，在移除水、甘油和有机溶剂之后通常高于160，优选在移除水、甘油和有机溶剂之后高于165，更优选在移除水、甘油和有机溶剂之后高于170、甚至更优选高于175、最优选高于180。反应的水解率可以通过使用反应开始时和反应结束时的酸值来计算。
在一个或多个实施方案中，脂肪酶LKT400XL用于在高于40℃如在45℃至55℃之间的温度，例如50℃，催化HCO的水解。通过添加含有5至12个碳的饱和烃例如正己烷或异辛烷作为有机溶剂，在移除水、甘油和溶剂之后最终产物的酸值高于165，对应于高于87.3％的水解率。优选地，溶剂体积(以mL计)与HCO重量(以克计)的比值在100％至500％的范围内。更优选地，所述饱和烃体积(以mL计)与HCO重量(以克计)的比值在200％至500％的范围内，如200％至300％，或200％，以达到高于170或甚至高于175，即在175至185之间的酸值。
在一个或多个实施方案中，添加醚(如MTBE)作为由脂肪酶LKT400XL催化的水解的有机溶剂。通过优化反应条件，获得了酸值高于165的最终产物。
在一个或多个实施方案中，添加空间位阻醇(如t-BuOH)作为由脂肪酶LKT400XL催化的水解的有机溶剂。通过优化反应条件，能够获得酸值高于160或高于170的最终产物。
在一个或多个实施方案中，添加t-BuOH或丙酮与正己烷或异辛烷的混合物作为由脂肪酶LKT400XL催化的水解的有机溶剂。通过优化反应条件，在移除水、甘油和溶剂之后的最终产物的酸值高于165。
在一个或多个实施方案中，当水量在50％至150％的范围内时，所获得的酸值基本上高于165。
在一个或多个实施方案中，添加商业提供的脂肪酶LKT400XL。在优化的反应条件下，当所用LKT400XL溶液的体积的量(以mL计)不小于HCO的重量(以克计)的0.3％(V/W)时(例如0.3％至2％，更优选为0.5％至2％，甚至更优选为0.8％至2％，并且甚至更优选为0.75％至1％或者0.8％至1％)，能够获得酸值高于175的反应产物。通过使用Bradford测定法，将脂肪酶LKT400XL中的蛋白质浓度测定为19mg/mL，因此如果以干固体形式添加脂肪酶，则可以估计所需的蛋白质或脂肪酶的量。当以固体形式添加时，所添加的脂肪酶的量不少于57百万分之一份(ppm，相对于HCO的重量)，可以实现高于175的酸值，如57ppm至380ppm，更优选95ppm至380ppm，甚至更优选152ppm至380ppm，并且甚至更优选142.5ppm至190ppm或152ppm至190ppm。
在一个或多个实施方案中，添加商业提供的脂肪酶Eversa，以在高于40℃如在45℃至55℃之间的温度催化HCO的水解。通过添加含有5至12个碳的饱和烃例如正己烷或异辛烷作为有机溶剂，在移除水、甘油和溶剂之后的最终产物的酸值高于160。优选地，溶剂体积(以mL计)与HCO重量(以克计)的比值在100％至500％的范围内。更优选地，C5-C12烷烃体积(以mL计)与HCO重量(以克计)的比值在200％至500％的范围内，如300％至400％，以实现高于170或甚至高于175即约180的酸值。
在一个或多个实施方案中，添加空间位阻醇(如t-BuOH)作为由Eversa催化的水解的有机溶剂。通过优化反应条件，能够获得酸值高于160或高于170的最终产物。优选的水量是HCO重量的100％，或300％至500％(V/W，mL/g)。
在一个或多个实施方案中，添加醚(如MTBE)作为有机溶剂。通过优化反应条件，能够获得酸值高于160或高于170的最终产物。例如，当应用200％(V/W，HCO的mL/g)的MTBE、1％(V/W，HCO的mL/g)的量的Eversa和高于100％的范围内的水量时，获得高于160的酸值。更具体地，当水量为100％至300％，优选为约200％时，获得高于171的酸值。
在一个或多个实施方案中，添加t-BuOH或丙酮与正己烷或异辛烷的混合物作为有机溶剂。通过优化反应条件，能够获得酸值高于160或高于170的最终产物。例如，所添加的水量为HCO重量的约250％(V/W，mL/g)。
在一个或多个实施方案中，所用的水量在50％至200％的范围内，并且所获得的酸值基本上高于165。优选地，水量在50％至100％、100％至150％、或100％至约200％、如75％至100％的范围内。
在一个或多个实施方案中，在优化的反应条件下，当所用的Eversa的量不小于0.2％，或不小于0.3％，或不小于0.5％，尤其是不小于1％时，能够获得酸值高于170、或高于175、或甚至接近180的反应产物。总体而言，1％的Eversa可以保证水解产物的酸值高于175或者高于180。所用Eversa溶液的量(以mL计)不小于HCO重量(以克计)的0.2％(V/W)，优选为0.2％至2％，更优选为0.3％至2％，甚至更优选为0.3％至1％，或1％至2％。通过使用Bradford测定法，将Eversa中的蛋白质浓度测定为25mg/mL，因此如果以干固体形式添加脂肪酶，则可以估计所需的蛋白质或脂肪酶的量。如果以固体形式添加，当所添加的脂肪酶的量不小于50ppm，或不小于75ppm，或不小于125ppm，或不小于250ppm时，能够实现高于170、或高于175、或甚至接近180的酸值。所用固体脂肪酶的量不小于50ppm，优选为50ppm至500ppm，更优选为75ppm至500ppm，甚至更优选为75ppm至250ppm，或250ppm至500ppm。
在一个或多个实施方案中，将衍生自嗜热真菌属或衍生自棉毛状嗜热霉的其它脂肪酶如TLL-SH用于催化HCO的水解。TLL-SH是通过在巴斯德毕赤酵母中表达来自棉毛状嗜热霉的野生型脂肪酶序列获得的脂肪酶。通过优化比值和反应条件，使用1％剂量的TLL-SH能够容易地获得AV高于175的水解产物，并且使用0.5％剂量的TLL-SH能够获得AV高于170的水解产物。用于反应的温度在37℃至55℃之间，优选在40℃至55℃之间，更优选在45℃至55℃之间，最优选为50℃；有机溶剂是正己烷、异辛烷、MTBE、t-BuOH、或者t-BuOH或丙酮与正己烷或异辛烷的混合物。所用溶剂和水的量可以根据本领域的常用技术进行调节。所用TLL-SH溶液的量不小于HCO重量的0.3％，优选为0.3％至2％，更优选为0.5％至2％，甚至更优选为0.5％至1％。所用TLL-SH的重量可以通过使用由Bradford测定法测定的TLL-SH蛋白质浓度来计算。如果以固体形式添加TLL-SH，则所添加的量不少于156ppm，优选为156ppm至1040ppm，更优选为260ppm至1040ppm，甚至更优选为260ppm至520ppm。
在通过水解由HCO制备12-HSA中，可以通过真空蒸馏分离和纯化12-HSA。
本发明还提供了脂肪酶在以下的用途：水解具有高熔点的油，由HCO制备12-HSA，以及用于制备12-HSA的具有高熔点的油的水解或HCO的水解的反应混合物。在一些实施方案中，脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶；优选地，所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶是衍生自棉毛状嗜热霉的脂肪酶，更优选选自Eversa、脂肪酶LKT400XL、TLL-SH、其衍生物及其混合物。在一些实施方案中，以商业提供的液体形式添加脂肪酶，所用脂肪酶的量不小于油底物的0.3％体积与重量(V/W，mL/g)比(对于脂肪酶溶液)、或重量比，例如，所用量为0.3％至2％，优选0.3％至1％，或0.5％至1％，或0.75％至1％，或0.8％至1％，或0.3％至0.5％，或0.3％。通过使用在相应产品说明书中提供的脂肪酶浓度或脂肪酶活性单位，可以计算所用脂肪酶的重量或活性单位。因此，当以固体形式提供和添加脂肪酶时，可以估计脂肪酶与HCO的重量比，例如，脂肪酶与油底物的重量比可以不小于50ppm或不小于57ppm，不小于75ppm，不小于125ppm，不小于156ppm，不小于250ppm。优选地，以固体形式使用的脂肪酶在选自以下的范围内：57ppm至380ppm、95ppm至380ppm、152ppm至380ppm、142.5ppm至190ppm、152ppm至190ppm、50ppm至500ppm、75ppm至500ppm、75ppm至250ppm、或250ppm至500ppm、156ppm至1040ppm、260ppm至1040ppm、260ppm至520ppm或这些范围的任意组合。在一些实施方案中，如上所述添加有机溶剂的量、水的量和脂肪酶的量以及它们的比值。
本发明还提供了反应混合物，其中所述混合物包含具有高熔点的油、一或多种有机溶剂、水和脂肪酶；其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶；优选地，所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶是衍生自棉毛状嗜热霉的脂肪酶，更优选选自Eversa、脂肪酶LKT400XL、TLL-SH、其衍生物及其混合物。在一些实施方案中，如上所述添加油底物的量、有机溶剂的量、水的量和脂肪酶的量以及它们的比值。在一些实施方案中，反应混合物用于制备12-HSA。在一些实施方案中，所述反应混合物是在用于制备12-HSA的本发明过程中的混合物，其中所述反应混合物可以包含12-HSA。
通过利用本发明的过程和反应混合物，在移除水、甘油和有机溶剂之后，能够获得酸值大于160mgKOH/g的最终产物；更优选地，在移除水、甘油和有机溶剂之后，能够获得酸值大于175mgKOH/g的最终产物。反应的水解率可以通过使用反应开始时和反应结束时的酸值来计算。通过使用本发明的过程和本发明的反应混合物，至少能够获得大于60％的水解率。更优选地，能够实现大于70％的水解率，如大于75％的水解率。更优选地，能够实现大于80％的水解率，如大于85％的水解率。甚至更优选地，能够实现大于90％的水解率，如大于95％的水解率。最优选地，实现了大于97％或大于98％的水解率。
实施例
在下文中，通过以下非限制性实施例进一步详细地说明本发明。以下实施例中所使用的HCO购自中国威尔玛油脂化工有限公司(Wilmar Oleochemicals Co.,Ltd,China)，其熔点为82℃至88℃。HCO的细粉形式是通过用家用搅拌机研磨HCO薄片或用研钵和研杵手工研磨获得的。分析试剂级的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、MTBE、二***和叔丁醇购自新加坡西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich Singapore)；分析试剂级的正庚烷购自舍德尔科(Schedelco)；分析试剂级的环己烷和异辛烷购自新加坡费舍尔公司(Fisher Singapore)；HPLC级的乙腈购自新加坡费舍尔公司；工业级的正己烷购自新加坡爱克莫油漆化工私人有限公司(Aik Moh Paints&Chemicals Pte Ltd Singapore)。
脂肪酶：南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CalB，#L3170，≥5,000LU/g)，南极假丝酵母脂肪酶A(CalA，#L3420，≥6,000LU/g)，来自棉毛状嗜热霉的脂肪酶(TLL，#L0777，≥100,000U/g，诺维信的Lipolase)和来自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶(RML，#L4277，≥20,000U/g)均购自新加坡西格玛-奥德里奇公司并以溶液形式提供。来自爪哇毛霉菌(Mucor javanicus)的Amano Lipases(AL)M(#534803，≥10,000U/g)，来自荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的AL AK(#534730，≥20,000U/g)，来自沙门柏干酪青霉菌(Penicillium camemberti)的AL G(#534838，≥50,000U/g)，来自黑曲霉(Aspergillus niger)的AL A(#534781，≥12,000U/g)，以及来自洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkhoderia cepacia)的AL PS(#534641，≥30,000U/g)购自新加坡西格玛-奥德里奇公司并以粉末形式提供；ResinaseHT溶液(≥50KLU/g)来自诺维信；Eversa是从诺维信以液体形式获得的，浓度为25mg/mL(通过Bradford测定法测定)并且活性≥100LCLU/g；脂肪酶LKT400XL来自中国深圳绿微康(Leveking，Shenzhen，China)，以液体形式，浓度为19mg/mL(通过Bradford测定法测定)并且活性为500,000U/mL。脂肪酶LKT400XL与脂肪酶Callera
L的同一性超过99％，其中脂肪酶Callera
L是由诺维信公司提供的棉毛状嗜热霉脂肪酶的液体制剂。
TLL-SH和G50-SH的制备方法在实施例11中示出。TLL-SH溶液的蛋白质浓度为52mg/mL，G50-SH的蛋白质浓度为19.5mg/mL。蛋白质浓度由Bradford测定法测定。
如果没有具体说明，则脂肪酶以液体形式添加，添加到水解反应中的脂肪酶的量按照体积(以mL计)比油底物的重量(以克计)计算；如果脂肪酶以固体粉末形式在商业上提供，则添加到水解反应中的脂肪酶的量按照相对于油底物的重量百分比计算。如果没有另外说明，则本说明书中的百分比是重量百分比。
在实施例中，水解率根据以下公式计算：
其中，AV0是油底物的酸值，对于本申请中使用的HCO，AV0测定为1.04mgKOH/g；AVt是时间t时水解产物的酸值；SV是指水解后的产物/水解产物12-HSA的皂化值，在本申请中通过使用AOCS Cd 3-25方法测定SV为188.93mgKOH/g。
水解产物的酸值(AV，mgKOH/g)如下测定：用旋转蒸发器完全蒸发有机溶剂，在90℃至95℃用水洗涤熔化残渣以移除甘油，然后用标准KOH溶液使用AOCS Da 14-48法滴定所述完全干燥的水洗后的水解产物。
实施例1.用于水解HCO的脂肪酶的比较
将5克细粉形式的HCO放入反应器中，然后添加去离子水至油重量的25％的量(包括酶溶液中的水)，并将25mL异辛烷作为有机溶剂(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为500％)添加到反应器中。然后将100μL酶溶液(如果以溶液形式提供)或100mg酶粉末(如果以粉末形式商业提供)添加到所述混合物中，如下表1所示。搅拌速率为450rpm，加热混合物到37℃的反应温度。在整个反应过程中继续搅拌，反应时间为24小时或72小时。在反应完成之后，测定酸值(AV)并在下表1中示出。
表1.用于水解HCO的脂肪酶
表1示出了TLL、Eversa、RML和AL PS、LKT400XL和TLL-SH能够在24小时后获得酸值大于50的水解产物。Eversa和LKT400XL非常高效，它们的水解产物在24小时的反应之后达到107.8的酸值，并且TLL-SH在72小时的反应之后能够达到175.66的酸值。
实施例2-通过脂肪酶LKT400XL水解HCO
2.1正己烷量对通过脂肪酶LKT400XL催化的水解的影响
将5克细粉形式的HCO放入反应器中，然后添加去离子水至油重量的50％(V/W)的量(包括酶溶液中存在的水)，并将5mL、10mL、15mL或25mL的正己烷(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为100％、200％、300％或500％)添加到反应器中。然后将100μL脂肪酶LKT400XL(HCO的2％(V/W))添加到混合物中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到45℃的反应温度。在整个反应过程中继续搅拌，反应持续72小时。在反应完成之后，测定酸值并在下表2中示出。
表2.不同量的正己烷用于通过LKT400XL的HCO水解
通过使用正己烷作为有机溶剂，最终产物的酸值可以高于165。当正己烷体积(以mL计)与HCO重量(以克计)的比值在100％至500％的范围时，达到了高于165的酸值，对应于高于87.3％的水解率；并且当所述比值在200％至500％的范围时，达到了高于170的酸值，对应于高于88.95％的水解率；甚至达到了高于175的酸值，这直接符合12-HSA产品规格中的AV，即175至185之间。
2.2水量对以正己烷为有机溶剂通过脂肪酶LKT400XL催化的水解的影响
如2.1中所述进行实验18至21，不同之处在于将不同量的去离子水添加至油重量的15％、25％、150％、200％的量(包括酶溶液中存在的水)，并添加10mL正己烷(“有机溶剂体积(以mL计)与油重量(以克计)”的比值(V/W)为200％)。在反应完成之后，测定酸值并在下表3中示出。
表3.不同量的水用于通过LKT400XL水解HCO
水量在HCO重量的大于25％且不超过200％的范围内有助于达到高于160的酸值。当水量在50％至150％的范围时，获得的酸值基本上高于165，对应于高于87.3％的水解率。
2.3温度对以正己烷为有机溶剂通过脂肪酶LKT400XL催化的水解的影响
如2.1中所述进行实验22至26，不同之处在于将去离子水添加至油重量的150％的量(包括酶溶液中存在的水)，并添加10mL正己烷作为有机溶剂(“有机溶剂体积(以mL计)与油重量(以克计)”的比值(V/W)为200％)以及50μL脂肪酶LKT400XL(HCO的1％V/W)。水解反应在不同温度进行，同时在450rpm搅拌。在整个反应过程中继续搅拌，反应时间为72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率，在表4中示出。
表4.不同温度用于使用正己烷通过LKT400XL水解HCO
当在高于40℃的温度进行反应时，获得了具有较高酸值的最终产物。尤其是当温度在45℃至55℃之间时，获得了较高的酸值。
2.4酶剂量对以正己烷为有机溶剂通过脂肪酶LKT400XL催化的水解的影响
如2.3所述进行实验27至30，不同之处在于反应温度为50℃，并且将不同量的脂肪酶LKT400XL(100μL、37.5μL、25μL或15μL，对应于HCO的2％、0.75％、0.5％或0.3％(V/W))添加到混合物中。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率，如表5中示出的。
表5.不同剂量的酶用于使用正己烷通过LKT400XL水解HCO
当所用的酶量大于HCO的0.5％(V/W)、尤其是不小于0.75％时，可获得酸值高于175的水解产物。
2.5异辛烷量对通过脂肪酶LKT400XL催化的水解的影响
将5克细粉形式的HCO放入反应器中，然后添加2.5mL去离子水至油重量的50％的量(包括酶溶液中的水)，并将5mL、10mL、15mL或25mL异辛烷作为有机溶剂(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为100％、200％、300％或500％)添加到反应器中。然后将100μL脂肪酶LKT400XL(HCO的2％(V/W))添加到混合物中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到45℃的反应温度。在整个反应过程中继续搅拌，反应时间为72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率，如表6中示出的。
表6.不同量的异辛烷用于通过LKT400XL的水解
当异辛烷体积(以mL计)与HCO重量(以克计)的比值大于100％时，达到了高于160的酸值。尤其是，当所述比值在200％至500％之间时，获得了高于175的酸值，对应于高于92.59％的水解率。
2.6水量对以异辛烷作为有机溶剂通过脂肪酶LKT400XL催化的水解的影响
如2.5中所述进行实验35至39，不同之处在于添加不同量的去离子水(对应于油重量的25％、75％、100％、150％和200％的量(包括酶溶液中存在的水))，并添加10mL异辛烷作为有机溶剂(“有机溶剂体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为200％)。在反应完成之后，计算酸值和水解率，如表7中所示。
表7.不同量的水用于使用异辛烷通过LKT400XL的水解
当异辛烷体积(以mL计)与HCO重量(以g计)的比值为200％并且所添加的LKT400XL的量为2％时，不同量的水所得最终产物的酸值均高于175。优选地，使用在HCO重量的20％至200％范围内的水量。
2.7温度对以异辛烷作为有机溶剂通过脂肪酶LKT400XL催化的水解的影响
如2.5中所述进行实验40至43，不同之处在于添加5mL去离子水和10mL异辛烷。水解反应在不同温度(37℃、40℃、50℃和55℃)下进行。在反应完成之后，计算酸值和水解率，如表8中所示。
表8.不同温度用于使用异辛烷通过LKT400XL水解HCO
可以在37℃至55℃之间进行反应。当在高于40℃的温度下进行反应时，获得了具有较高酸值的最终产物。尤其是当温度在45℃至55℃之间时，获得了约180的酸值。
2.8酶剂量对以异辛烷作为有机溶剂通过脂肪酶LKT400XL催化的水解的影响
如2.7所述进行实验44至50，不同之处在于添加不同量的脂肪酶LKT400XL(50μL、40μL、25μL或15μL，对应于HCO的1％、0.8％、0.5％或0.3％)并且在45℃或50℃的温度进行反应。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率，在表9和表10中示出。
表9.不同剂量的LKT400XL用于在45℃使用异辛烷进行的水解
表10.不同剂量的LKT400XL用于在50℃使用异辛烷进行的水解
当所用的酶量不小于1％时，可以获得酸值高于170的反应产物。LKT400XL在50℃下有更好的催化活性，用0.8％的酶能够获得酸值高于170的反应产物。
实施例3–Eversa催化的HCO水解
3.1不同有机溶剂对水解的影响
将5克细粉形式的HCO放入反应器中，然后添加5mL(包括酶溶液中存在的水)去离子水(油重量的100％)，并将25mL有机溶剂(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为500％)添加到反应器中。然后将100μL Eversa(HCO的2％(V/W))添加到混合物中。将混合物加热至37℃的反应温度，同时在450rpm搅拌。在整个反应过程中继续搅拌，24小时之后停止反应进行分析。测定水解产物的酸值并计算水解率，在表11中示出。
表11.不同有机溶剂用于HCO水解的比较
非极性溶剂通常对获得具有较高酸值的最终产物有更好的效果。t-BuOH优于其它极性溶剂。通过优化反应条件，单独使用或相互混合使用的空间醇如叔丁醇、非极性溶剂等可能会达到高酸值。
3.2MTBE作为溶剂用于Eversa催化的HCO水解
3.2.1MTBE量对通过Eversa催化的水解的影响
将5克细粉形式的HCO放入反应器中，然后向反应器中添加5mL去离子水至油重量的100％的量(包括酶溶液中存在的水)，并将不同体积(5mL、10mL、15mL或25mL)的MTBE作为有机溶剂(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为100％、200％、300％或500％)添加到反应器中。然后将50μL Eversa(HCO的1％(V/W))添加到混合物中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到45℃的反应温度。在整个反应过程中继续搅拌，并在48h监测水解反应。反应完成之后，测定酸值并计算水解率，在下表12中示出。
表12.不同量的MTBE用于通过Eversa水解HCO
当使用100％至300％的MTBE时，在48h反应之后，反应产物的酸值高于160。
3.2.2水量对以MTBE作为有机溶剂通过Eversa催化的水解的影响
如3.2.1中所述进行实验65至71，不同之处在于添加不同量的去离子水，并添加10mL MTBE(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为200％)。反应温度为50℃。在72h反应完成之后，测定酸值并计算水解率，如表13中所示。类似地进行实验72至75，但是在45℃的温度下进行48h，并使用10mL(HCO的200％(V/W))MTBE。AV和水解率在表14中示出。
表13.不同量的去离子水用于以MTBE作为有机溶剂通过Eversa水解HCO
表14.不同量的去离子水用于以MTBE作为有机溶剂通过Eversa水解HCO
当将200％的MTBE用于通过Eversa水解HCO时，通过调节水量，能够在50℃下，使用大范围的水量容易地达到高于165的酸值。
当在45℃下将200％的MTBE用于通过Eversa水解HCO时，通过使用不低于100％范围的水量，能够达到高于160的酸值。尤其是，当水量在约200％的范围时，获得了高于170的酸值。
3.3正己烷作为溶剂用于Eversa催化的HCO水解
3.3.1水量对以正己烷作为有机溶剂通过Eversa催化的水解的影响
将10克细粉形式的HCO放入反应器中，然后向反应器中添加去离子水至油重量的15％、25％、50％、75％、100％、150％、200％的量(包括酶溶液中存在的水)，并将30mL正己烷作为有机溶剂(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为300％)添加到反应器中。然后将50μL Eversa(HCO的0.5％(V/W))添加到混合物中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在整个反应过程中继续搅拌。在72h之后，测定酸值并计算水解率。详情见表15。
表15.不同水量对以正己烷作为有机溶剂通过Eversa的水解的影响
当水量高于25％且低于150％时，所得水解产物的酸值较高。尤其是，当水量在50％至100％的范围时，酸值高于170，对应于高于89.92％的水解率。
然而，如果将Eversa的量增加到1％(实验编号83)，那么即使在15％的水量和200％的正己烷量下，也获得了高于175的酸值。
3.3.2正己烷量对通过Eversa催化的水解的影响
如3.3.1中所述进行实验84至87，不同之处在于添加7.5mL去离子水，并添加10mL、20mL、40mL或50mL正己烷作为唯一的有机溶剂(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为100％、200％、400％或500％)。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率，结果在表16中示出。
表16.不同的正己烷量对通过Eversa水解HCO的影响
当使用的水量为HCO重量的75％时，最终产物的酸值能够容易地达到高于165。表中的数据示出，正己烷量在HCO的200％至500％(V/W)范围内，能够有助于达到高于170或甚至约180的酸值，尤其是当正己烷量在300％至400％的范围时。
3.3.3Eversa剂量对以正己烷作为有机溶剂通过Eversa催化的水解的影响
如3.3.1所述进行实验88至94，不同之处在于添加7.5mL去离子水，10mL、20mL或30mL正己烷作为唯一的有机溶剂，以及不同量的Eversa(100μL、50μL或30μL，对应于HCO的1％、0.5％或0.3％(V/W))。结果在表17中示出。
表17.不同剂量的Eversa对以正己烷作为溶剂水解HCO的影响
当使用100％的正己烷和75％的水时，通过以0.3％至1％的量使用Eversa，酸值可以容易地达到170或更高。当使用200％的正己烷时，酸值很容易地达到高于165。当添加300％的正己烷时，>0.5％的较高量的Eversa可以有助于达到约180的酸值。总体而言，1％的Eversa能够保证水解产物的酸值为约180。即使在温和的反应条件下使用<1％的量Eversa，也可以达到高于170或接近180的酸值。
3.3.4温度对以正己烷作为有机溶剂通过Eversa催化的水解的影响
如3.3.1中所述进行实验95至98，不同之处在于添加7.5mL去离子水和30mL正己烷作为有机溶剂。在不同温度(37℃、40℃、45℃和55℃)下进行水解反应，同时在450rpm搅拌。反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表18中示出。
表18.温度对以正己烷作为溶剂通过Eversa的水解的影响
当在40℃至55℃之间的温度下进行水解时，获得了较高的酸值。在50℃的温度水解似乎是最优的。
3.4异辛烷作为溶剂用于Eversa催化的HCO水解
3.4.1水量对以异辛烷作为溶剂通过Eversa催化的水解的影响
将10克细粉形式的HCO放入反应器中，然后将去离子水以油重量的25％、50％、100％、150％、200％的量(包括酶溶液中存在的水)添加到反应器中，并将30mL异辛烷作为有机溶剂(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为300％)添加到反应器中。然后将100μL Eversa(HCO的1％(V/W))添加到混合物中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，并在72h监测水解反应。反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表19中示出。
表19.不同量的水用于使用异辛烷通过Eversa的水解
当将异辛烷用作有机溶剂时，高于25％的范围的水量可以有助于达到高于160的酸值，优选50％至200％的水量可以有助于达到高于165的酸值，水量更优选为50％至200％，甚至更优选为100％至200％，最优选为100％至150％。
3.4.2异辛烷量对通过Eversa催化的水解的影响
如3.4.1中所述进行实验104至106，不同之处在于添加15mL去离子水，以及不同量的异辛烷(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为100％、200％或500％)。在反应完成后，测定酸值并计算水解率。结果示于表20。
表20.不同量的异辛烷用于通过Eversa的水解
不同量的异辛烷能够容易地帮助反应产物的酸值达到高于175，尤其是当使用100％至500％的异辛烷时。最优选地，使用500％的异辛烷获得约185的酸值。
3.4.3Eversa剂量对以异辛烷作为有机溶剂的水解的影响
如3.4.1所述进行实验107至109，不同之处在于添加15mL去离子水、30mL异辛烷以及不同量的Eversa(50μL、30μL或20μL，对应于HCO的0.5％、0.3％或0.2％(V/W))。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表21中示出。
表21.不同剂量的Eversa对使用异辛烷的HCO水解的影响
Eversa剂量高于0.3％能够有助于获得酸值高于160的反应产物，尤其是Eversa剂量为0.5％至1％能够使酸值高于175。较高量的Eversa剂量将有助于获得不低于实验102和实验107的酸值。
3.5叔丁醇作为溶剂用于Eversa催化的HCO水解
3.5.1水量对以t-BuOH作为有机溶剂通过Eversa催化的水解的影响
将5克细粉形式的HCO放入反应器中，然后添加不同量的去离子水至油重量的25％至500％(V/W)的量(包括酶溶液中存在的水)，并将5mL t-BuOH(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为100％)添加到反应器中。然后将50μL Eversa(HCO的1％(V/W))添加到混合物中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，反应持续72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在下表22中示出。
表22.不同量的水用于使用t-BuOH通过Eversa的水解
3.5.2t-BuOH量对通过Eversa催化的水解的影响
如3.5.1中所述进行实验119至121，不同之处在于添加5mL去离子水，以及不同量的t-BuOH(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为200％、300％或500％)。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果示于表23。
表23.不同量的t-BuOH用于通过Eversa的水解
3.6有机溶剂的混合物用于Eversa催化的HCO水解
3.6.1丙酮/正己烷混合物作为有机溶剂用于通过Eversa催化的水解
将10克细粉形式的HCO放入反应器中，然后添加25mL去离子水。如表24所示添加15mL的不同比值的丙酮和正己烷混合物。然后将30μL Eversa(HCO的0.3％(V/W))或50μLEversa(HCO的0.5％(V/W))添加到反应器中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，反应持续72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表24中示出。
表24.丙酮/正己烷混合物用于通过Eversa的水解
表24示出，通过添加丙酮/正己烷的混合物作为有机溶剂，使用0.3％-0.5％的Eversa获得的最大AV接近170，并且在优化的反应条件下，AV能够容易地达到160和165。3.6.2t-BuOH/正己烷混合物作为有机溶剂用于通过Eversa催化的水解
3.6.2.1混合比和溶剂量对使用t-BuOH/正己烷通过Eversa催化的水解的影响
将10克细粉形式的HCO放入反应器中，然后将15mL不同体积与体积比的t-BuOH/正己烷混合物(t-BuOH:正己烷为25:75、30:70或35:65)添加到反应器中。然后添加15mL去离子水(HCO重量的150％)。添加30μL Eversa(HCO的0.3％(V/W))。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，将反应在50℃进行66小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表25中示出。
表25.不同比值的t-BuOH/正己烷混合物用于通过Eversa的水解
通过优化混合比，可以将t-BuOH/正己烷混合物用作有机溶剂，从而在通过0.3％的Eversa催化的HCO水解中，达到高于165的AV。
3.6.2.2水量对以t-BuOH/正己烷为有机溶剂的Eversa催化的水解的影响
如3.6.2.1所述进行实验131至135，不同之处在于将15mL体积与体积比为30:70的t-BuOH/正己烷混合物添加到反应器中，然后添加不同量的去离子水(7.5mL、10mL、20mL、25mL或30mL，分别对应于HCO重量的75％、100％、200％、250％或300％)。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表26中示出。
表26.不同量的水用于使用t-BuOH/正己烷混合物通过Eversa的水解
当将t-BuOH/正己烷混合物用作有机溶剂时，在大于100％并小于500％的范围的水量可以有助于达到高于160的酸值；在150％至300％的范围的水量可以有助于达到高于165的酸值。在优化的条件下，酸值可以达到高于170。
3.6.2.3Eversa剂量对t-BuOH/正己烷(3:7)混合物作为有机溶剂的HCO水解的影响。
如3.6.2.2中所述进行实验136至138，不同之处在于添加10mL去离子水和不同Eversa剂量，如表27所示。在72h反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表27中示出。
表27.用于使用t-BuOH/正己烷混合物的水解的Eversa剂量
3.6.2.4温度对t-BuOH/正己烷(3:7)混合物作为有机溶剂的Eversa水解HCO的影响
如3.6.2.2中所述进行实验139至142，不同之处在于添加10mL去离子水，并在不同温度下进行反应，如表28所示。在72h反应完成之后，测定酸值并计算水解率。
表28.不同温度用于使用t-BuOH/正己烷混合物通过Eversa的水解
3.6.3t-BuOH/异辛烷混合物作为有机溶剂用于通过Eversa催化的水解
3.6.3.1用于Eversa催化的HCO水解的t-BuOH/异辛烷(3:7)混合物的量
将10克细粉形式的HCO放入反应器中，然后将不同体积的V/V比值为3:7的t-BuOH/正己烷混合物添加到反应器中。然后添加25mL去离子水(HCO重量的150％)。添加30μLEversa(HCO的0.3％(V/W))。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，将反应在50℃进行72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表29中示出。
表29.不同量的t-BuOH/异辛烷混合物(3:7)用于通过Eversa的水解
3.6.3.2用于t-BuOH/异辛烷(3:7)混合物作为有机溶剂的Eversa催化的HCO水解的水量。
如3.6.3.1所述进行实验148至150，不同之处在于将15mL t-BuOH/异辛烷混合物(3:7)添加到反应器中，然后添加不同量的去离子水(15mL、20mL或30mL，分别对应于HCO重量的150％、200％或300％(V/W))，如下表30所示。在72h反应完成之后，测定酸值并计算水解率。
表30.不同量的水用于使用t-BuOH/异辛烷混合物的通过Eversa的水解
3.6.3.3Eversa剂量对t-BuOH/异辛烷(3:7)混合物为有机溶剂的HCO水解的影响
如3.6.3.2中所述进行实验151和152，不同之处在于添加25mL去离子水和不同剂量的Eversa，如表31所示。在72h反应完成之后，测定酸值并计算水解率。
表31.用于使用t-BuOH/异辛烷混合物的水解的Eversa剂量
实施例4–TLL-SH催化的HCO水解
4.1水量对以正己烷作为有机溶剂的TLL-SH催化的HCO水解的影响
将10克细粉形式的HCO放入反应器中，然后向反应器中添加30mL正己烷。然后，添加不同量的去离子水(2.5mL、5mL、7.5mL、10mL、15mL、20mL、30mL或40mL，分别对应于HCO重量的25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％或400％)。添加100μL(HCO的1％(V/W))TLL-SH。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，将反应在50℃进行72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。结果在表32中示出。
表32.不同量的水用于使用正己烷的通过TLL-SH的水解
通过优化比值和反应条件，可以容易地以1％的TLL-SH剂量获得AV高于175的水解产物。
4.2TLL-SH剂量对HCO水解的影响
将5克细粉形式的HCO放入反应器中，然后向单独的反应器中添加如表中所示的不同量的正己烷。然后添加如表中所示的不同量的去离子水。添加100μL、50μL或25μL(HCO的2％、1％或0.5％(V/W))TLL-SH。搅拌速率为450rpm，加热混合物到37℃或50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，将反应在相同温度进行72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。
表33.用于使用正己烷的HCO水解的TLL-SH剂量
实施例5–双酶和双有机溶剂体系的比较实验
将10克薄片形式的HCO放入反应器中，然后添加40mL去离子水(HCO重量的400％(V/W))，并根据表34将40mL有机溶剂或有机溶剂混合物(“有机溶剂的体积(以mL计)与油的重量(以克计)”的比值(V/W)为400％)添加到反应器中。然后根据下表34将不同量的酶添加到混合物中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到45℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，反应时间为24小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。
表34.比较实验
实施例6–熔化HCO并在不同温度下进行水解
将2.5mL去离子水和15mL异辛烷添加到反应器中。将混合物冷却到4℃。将HCO在95℃熔化并在搅拌的同时将其缓慢添加到冷却的混合物中。在450rpm搅拌的同时，使反应混合物达到期望的反应温度(表35)。然后将15μL Eversa添加到反应器中并在反应过程中继续搅拌。反应时间为72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率。
表35.通过添加熔化的HCO底物在不同温度下的水解
实施例7–添加薄片形式与粉末形式的HCO
通过使用家用搅拌机将HCO薄片破碎成直径尺寸小于0.5毫米的细粉来制备HCO粉末。通过使用光学显微镜和筛分方法检查HCO粉末的尺寸。根据下表36，将薄片或粉末形式的HCO分别添加到具有水、正己烷和Eversa的反应器中。在反应过程中继续搅拌，在40℃的反应时间为72小时。然后测定酸值并计算水解率。结果在表36中示出。
表36.添加薄片形式与粉末形式的HCO
与使用较高酶剂量的薄片形式相比，当使用HCO细粉形式作为底物时，即使用较低的酶剂量也可以获得较高酸值的水解产物。结果表明，当使用细粉形式的HCO时，水解更高效。
实施例8-分批添加酶
实验编号176：将100g细粉形式的HCO放入反应器中，然后添加50mL去离子水，并将200mL异辛烷添加到反应器中。然后将300μL Eversa(HCO的0.3％(V/W))添加到混合物中。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，反应时间为70小时。在反应完成之后，测定出酸值为154.88。如果添加另外0.1％的Eversa，并使水解进行另外24小时，则达到了175.68的酸值。
实施例9–棕榈硬脂(IV15，熔点56℃-61℃；IV35，熔点47℃-55℃；IV38，熔点32℃-49℃)
研究了具有三种不同碘值(IV15、IV35和IV38)的棕榈硬脂的水解。如下表37和表38所示设定实验。将10克棕榈硬脂与30mL正己烷和7.5mL去离子水(包括酶中存在的水)混合。根据表添加不同量的Eversa。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，反应时间为72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率，如表37和表38所示。
表37.通过不同剂量Eversa水解棕榈硬脂
表38.通过高剂量Eversa水解棕榈油硬脂
实施例10–猪油(熔点28℃-44℃)
研究了猪油的水解。如下表所示设定实验。将10克猪油与30mL正己烷和7.5mL去离子水(包括酶中存在的水)混合。根据表添加不同量的Eversa(50μL或100μL，对应于猪油的0.5％或1％(V/W))。搅拌速率为450rpm，加热混合物到50℃的反应温度。在反应过程中继续搅拌，反应时间为72小时。在反应完成之后，测定酸值并计算水解率，在下表中示出。
表39.通过不同剂量的Eversa水解猪油
实施例11–制备TLL-SH和G50-SH
11.1表达载体构建
将棉毛状嗜热霉脂肪酶(TLL-SH)和沙门柏干酪青霉菌脂肪酶(G50-SH)根据巴斯德毕赤酵母偏好进行密码子优化并由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.)合成，其中每个基因的3’端具有EcoRI限制性酶位点(GAATTC)。两种脂肪酶基因的序列在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中列出，其在编码成熟肽的核酸之前包含带下划线的α-因子信号肽序列。
通过重叠聚合酶链反应(PCR)分别将脂肪酶基因片段连接到来自商业质粒pAO815中的巴斯德毕赤酵母AOX1启动子之后。将重叠PCR产物和pAO815质粒通过AatII和EcoRI进行双重消化以构建重组载体pAO-TLL-SH和pAO-G50-SH。
11.2重组巴斯德毕赤酵母菌株构建与表达
将巴斯德毕赤酵母GS115宿主(Invitrogen，C181-00)用于重组载体pAO-TLL-SH和pAO-G50-SH的转化。然后，活性显示板(MYO板：对于TLL-SH，1％酵母氮源碱(Yeastnitrogen base)、1％甲醇、3％橄榄油、0.37％聚(乙烯醇)、10μg/mL罗丹明B指示剂、2％琼脂；MYP：对于G50-SH，1％酵母氮源碱、1％甲醇、1％聚山梨酯80、10μg/mL罗丹明B指示剂、2％琼脂)用于筛选阳性转化子。选择具有最大水解圈的重组菌落来生产酶。如CN106884009A中所述进行发酵和酶回收过程。
SEQ ID NO：1棉毛状嗜热霉脂肪酶序列(TLL-SH)
SEQ ID NO:2沙门柏干酪青霉菌脂肪酶序列(G50-SH)
序列表
<110> 丰益国际有限公司
<120> 通过脂肪酶水解具有高熔点的油的方法
<130> NTD159791
<150> SG10201900696Y
<151> 2019-01-25
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1083
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Thermomyces lanuginosus lipase sequence (TLL-SH)
<400> 1
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctcttgaga aaagagaggc tgaagctgaa gtctctcaag acttgttcaa ccagttcaac 300
ttgttcgctc aatactctgc cgctgcctac tgtggtaaga acaatgatgc tccagctggt 360
actaacatta cctgtactgg taacgcttgt ccagaagttg agaaggctga tgctaccttc 420
ctgtactcct tcgaagactc tggagttgga gatgttactg gtttcctggc cttggataac 480
actaacaagt tgatcgttct gtccttcaga ggttccagat ccatcgagaa ctggattggt 540
aacttgaact ttgacttgaa ggagatcaac gacatctgtt ctggatgtcg tggtcacgat 600
ggatttacct cctcttggag atctgttgct gataccttga gacagaaggt cgaagatgct 660
gtcagagaac atccagacta tagagttgtc ttcactggtc actccttggg aggtgccttg 720
gctactgttg ctggtgctga cttgcgtggt aatggttatg acattgatgt cttctcctac 780
ggtgctccaa gagttggtaa tcgtgccttc gctgagtttc tgaccgtcca aactggaggt 840
actttgtaca gaattaccca tactaacgac attgttccaa gattgccacc acgtgagttc 900
ggatactctc attcctctcc agagtactgg atcaagtctg gaaccttggt tccagtcact 960
cgtaacgaca tcgtcaagat tgaaggtatt gatgccactg gaggtaacaa tcaaccaaac 1020
attccagaca ttccagctca cttgtggtac tttggtctga ttggtacttg cttgtaagaa 1080
ttc 1083
<210> 2
<211> 1113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Penicillium camemberti lipase sequence (G50-SH)
<400> 2
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctcttgaga aaagagaggc tgaagctgat gtctccactt ccgaactgga ccagttcgag 300
ttctgggttc aatacgcagc cgcctcttac tacgaggctg attacaccgc acaggttggt 360
gataagctgt cctgctctaa gggtaactgc ccagaagttg aagcaaccgg tgcaactgtg 420
tcttacgact tctccgattc cacgatcact gacaccgcag gttacatcgc agttgatcac 480
accaactccg cagtggtact ggcattccgt ggttcttact ccgtacgtaa ctgggttgct 540
gatgctactt tcgtccatac caacccaggt ctgtgtgatg gttgtctggc tgagctgggt 600
ttctggtctt cctggaagct ggttcgtgat gatattatca aagaactgaa agaagtggtg 660
gcacagaacc caaactatga actggtggtc gtgggccact ccctgggtgc tgctgtggct 720
actctggctg ctaccgacct gcgtggtaaa ggttatccat ctgctaaact gtacgcttac 780
gcttcccctc gtgttggcaa cgcagccctg gccaaatata tcaccgccca gggcaacaac 840
ttccgtttca cccacaccaa tgacccagta cctaaactgc cactgctgtc tatgggctat 900
gtacatgttt ctcctgaata ttggatcacc tctcctaaca acgccactgt ttctacctct 960
gacatcaaag tcattgacgg cgacgtatct tttgacggca ataccggcac gggcctgcct 1020
ctgctgacgg actttgaagc ccacatttgg tactttgtac aggttgacgc cggcaaaggt 1080
cctggcctgc cattcaaacg tgtttaagaa ttc 1113
Claims (17)
1.一种水解具有较高熔点的油以获得水解产物的方法，所述方法包括：
将水、有机溶剂和脂肪酶与所述油混合以形成混合物的步骤，以及
水解所述混合物中的所述油的步骤，
其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶，并且所述有机溶剂是选自空间位阻醇、非极性有机溶剂以及水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的混合物中的任何一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶衍生自棉毛状嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶选自EversaTransform 2.0、脂肪酶LKT400XL、TLL-SH、其衍生物及其混合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中以固体形式或以液体溶液形式提供所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中一次性添加或分批添加所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述具有较高熔点的油的熔点为40℃或更高，优选为45℃或更高，更优选为50℃或更高。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述具有较高熔点的油是氢化蓖麻油，并且所述水解产物是12-羟基硬脂酸(12-HSA)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中任选地，在混合步骤之前，将所述油熔化或研磨成粉末形式。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述非极性有机溶剂是含有5至12个碳的饱和烃，优选为含有5至12个碳的烷烃或环烷烃；和/或
所述非极性有机溶剂选自异辛烷、正庚烷、环己烷、正己烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、二***、正戊烷、环戊烷、石油醚及其混合物；和/或
所述空间位阻醇是叔丁醇(t-BuOH)；和/或
所述水混溶性有机溶剂选自丙酮、叔丁醇及其混合物；和/或
在水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的所述混合物中，所述水混溶性有机溶剂与所述非极性有机溶剂的体积比为20:80至50:50。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述水解所述油的步骤在30℃至60℃的温度下进行。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在所述水解油的步骤期间生成甘油，并且任选地，在所述水解所述油的步骤之后，存在移除水、所述甘油和所述有机溶剂的步骤。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述水解产物的酸值高于160，优选高于165，更优选高于170，甚至更优选高于175。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中如果所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶以液体溶液形式提供，则以毫升计的所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶的体积与以克计的底物氢化蓖麻油的重量的比值不小于0.2％，优选不小于0.3％，更优选为0.3％至2％，甚至更优选为0.3％至1％；如果所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶以固体形式提供，则所述衍生自嗜热真菌属的脂肪酶与底物氢化蓖麻油的重量的重量比不小于所述氢化蓖麻油的50ppm，或不小于所述氢化蓖麻油的57ppm，或不小于所述氢化蓖麻油的75ppm，或不小于所述氢化蓖麻油的156ppm。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述水与氢化蓖麻油的重量比为15％至300％，更优选为30％至250％，或100％至300％；和/或
以毫升计的所述有机溶剂的体积与以克计的所述氢化蓖麻油的重量的比值大于75％，优选在100％至500％之间。
15.通过根据权利要求1至15中任一项所述的方法获得的产物，其中所述产物的酸值高于160。
16.一种反应混合物，其包含具有较高熔点的油、有机溶剂、水和脂肪酶；其中
所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶，并且所述有机溶剂是选自空间位阻醇、非极性有机溶剂以及水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的混合物中的任何一种。
17.脂肪酶在水解混合物中的具有较高熔点的油中的用途，所述混合物包含具有较高熔点的油、有机溶剂、水和脂肪酶；其中所述脂肪酶包括一种或多种衍生自嗜热真菌属的脂肪酶，但不包括任何单酰基甘油脂肪酶或任何衍生自根毛霉菌属的脂肪酶，并且所述有机溶剂是选自空间位阻醇、非极性有机溶剂、以及水混溶性有机溶剂与非极性有机溶剂的混合物中的任何一种。
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