CN108239663A - 一种酶法水解高熔点油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶法水解高熔点油脂的方法。具体而言，本发明提供一种12‑羟基硬脂酸的制备方法，所述方法包括在第一有机溶剂、第二有机溶剂和水的存在下使用脂肪酶水解氢化蓖麻油的步骤，其中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶、源自根毛霉菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种，所述第一有机溶剂的极性在4～6之间，所述第二极性溶剂的极性小于等于1。采用本发明方法能在低温下利用普通的脂肪酶即可进行水解反应，能够明显提高最终水解率，而且得到的产物羟基值未降低。
Description
技术领域
本发明属于油脂加工工艺领域，具体涉及一种酶法水解高熔点油脂的方法。
背景技术
12-羟基硬脂酸是一种在12位含有羟基的18碳脂肪酸，分子式为CH3(CH2)5CH(OH)(CH2)10COOH，在室温下呈片状或针状结晶，熔点在82-93℃。由于12-羟基硬脂酸既含有羟基又含有羧基，使其具有特使的化学性质，因此其是重要的化学工业原料，可用作塑料生产的中间产物或作为化妆品的原料。
12-羟基硬脂酸的主要制备方法有两种，一种是将蓖麻油在高温高压下进行水解，水解得到的蓖麻油酸再进行氢化制备12-羟基硬脂酸，该方法在蓖麻油水解过程中容易使得蓖麻油酸中的羟基和羧基发生酯化反应而聚合，会降低12-羟基硬脂酸的得率，因此该方法一般很少采用。第二种方法是先将蓖麻油进行全氢化，得到氢化蓖麻油之后再通过强碱皂化、强酸酸化而得到12-羟基硬脂酸。该方法虽然可以能够保护羟基不受破坏，但是该方法使用过多的强碱、强酸会产生大量的废水，从而造成环境污染。因此利用酶法进行氢化蓖麻油的水解是以后的发展方向。
关于通过酶法制备12-羟基硬脂酸国内外也有一些报道，主要如下：
CN 201510313095.7公开了一种水解氢化蓖麻油的方法，该方法采用氢化蓖麻油与去离子水按一定比例在生物水解酶存在下，经过三次水解，反应得到12-羟基硬脂酸。每次水解按质量比氢化蓖麻油:水:水解酶＝100:60-100:0.3-0.5配料，混合均匀后，在搅拌条件下进行三次水解，得到12-羟基硬脂酸；水解反应的温度为80-85℃；时间为120-180min。该方法反应温度在80℃以上，而大部分水解脂肪酶的温度都是在50℃左右，因此该方法排除了大部分低温的脂肪酶类，只将脂肪酶限定为种类很少的高温脂肪酶，而高温脂肪酶价格昂贵，对后期生产操作意义一般。
JP 61139396公开的制备12-羟基硬脂酸的方法同样采用脂肪酶进行水解氢化蓖麻油，反应温度为75℃，同时还会在反应过程中加入一种溶剂进行溶解。该方法与CN201510313095.7有同样的缺点，即排除了大部分的水解脂肪酶。
CN 1473199A公开的制备12-羟基硬脂酸的方法主要为先将蓖麻油在15-50℃下用一种或多种脂肪酶催化水解而形成蓖麻酸，水解产物再氢化制备12-羟基硬脂酸。该方法虽然在水解过程中操作温度低，但是该方法在后期的氢化过程中会造成羟基的损失和酸价降低，存在一定的不足。
上述文献通过各种工艺研究如何在各种工艺条件下制备12羟基硬脂酸。但存在以下缺点：
1、在使用氢化蓖麻油作为底物时，水解过程中普遍存在水解温度高，只能利用高温脂肪酶做为催化剂的情况；
2、在使用蓖麻油做为底物时，虽然水解温度低，但是在后期的氢化过程中会造成羟基的损失，使产品不达标。
因此，本领域仍然需要一种以高熔点氢化蓖麻油做为底物制备12-羟基硬脂酸的方法，该方法能在低温下利用普通的脂肪酶即可进行水解反应，能够明显提高最终水解率，而且得到的产物羟基值不会降低。
发明内容
本发明第一方面提供一种12-羟基硬脂酸的制备方法，所述方法包括在第一有机溶剂、第二有机溶剂和水的存在下使用脂肪酶水解氢化蓖麻油的步骤，其中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶、源自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂的极性在4～6之间，第二极性溶剂的极性小于等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂选自丙酮、氯仿或其混合物。
在一个或多个实施方案中，第二有机溶剂选自环己烷、正己烷或其混合物。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂与第二有机溶剂的体积比为40～60：60～40。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂与第二有机溶剂的体积比小于或等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂是丙酮，第二有机溶剂是正己烷或环己烷，丙酮与正己烷或环己烷的体积比为40～60：60～40。
在一个或多个实施方案中，丙酮与正己烷或环己烷的体积比小于或等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂是氯仿，第二有机溶剂是正己烷，氯仿与正己烷的体积比为40～60：60～40。
在一个或多个实施方案中，以毫升计的所述有机溶剂的总添加量与以克计的氢化蓖麻油质量的数值之比为1～8。
在一个或多个实施方案中，氢化蓖麻油与水的重量比为1：2～6，优选1：2～4。
在一个或多个实施方案中，偏甘油酯脂肪酶是源自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium sp.)或马拉色霉菌属(Malassezia)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，源自青霉属(Penicillium sp.)的脂肪酶是源自沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，源自青霉属(Penicillium sp.)的脂肪酶是脂肪酶G50，即商品酶Lipase G"Amano"50。
在一个或多个实施方案中，偏甘油酯脂肪酶的用量为氢化蓖麻油重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是源自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是Lipozyme TL IM。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是源自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是Lipozyme RM IM。
在一个或多个实施方案中，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如1.0～4.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、2.0～5.0％等。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶。在这些实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％，偏甘油酯脂肪酶的用量为油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和源自根毛霉菌属的脂肪酶。在这些实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自根毛霉菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶。在这些实施方案中，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％；偏甘油酯脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，水解在35～55℃的温度下进行，例如在40～50℃的温度下进行。
本发明第二方面提供一种水解高熔点油脂的方法，所述方法包括在第一有机溶剂、第二有机溶剂和和水的存在下使用脂肪酶水解所述高熔点油脂的步骤，其中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶、源自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂的极性在4～6之间，所述第二有机溶剂的极性小于等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂选自丙酮、氯仿或其混合物。
在一个或多个实施方案中，第二有机溶剂选自环己烷、正己烷或其混合物。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂与第二有机溶剂的体积比为40～60：60～40，优选地40:60～50:50。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂与第二有机溶剂的体积比小于或等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂是丙酮，第二有机溶剂是正己烷或环己烷，丙酮与正己烷或环己烷的体积比为40～60：60～40，优选地40:60～50:50。
在一个或多个实施方案中，丙酮与正己烷或环己烷的体积比小于或等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂是氯仿，第二有机溶剂是正己烷，氯仿与正己烷的体积比为40～60：60～40，优选地40:60～50:50。
在一个或多个实施方案中，以毫升计的所述有机溶剂的总添加量与以克计的高熔点油脂质量的数值之比为1～8。
在一个或多个实施方案中，高熔点油脂与水的重量比为1：2～6，优选1：2～4。
在一个或多个实施方案中，所述偏甘油酯脂肪酶是源自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium sp.)或马拉色霉菌属(Malassezia)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自青霉属(Penicillium sp.)的脂肪酶是源自沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自青霉属(Penicillium sp.)的脂肪酶是脂肪酶G50，即商品酶Lipase G"Amano"50。
在一个或多个实施方案中，所述偏甘油酯脂肪酶的用量为氢化蓖麻油重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是源自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是Lipozyme TL IM。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是源自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是Lipozyme RM IM。
在一个或多个实施方案中，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如1.0～4.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、2.0～5.0％等。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶。在这些实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％，偏甘油酯脂肪酶的用量为油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和源自根毛霉菌属的脂肪酶。在这些实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自根毛霉菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶。在这些实施方案中，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％；偏甘油酯脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，水解在35～55℃的温度下进行，例如在40～50℃的温度下进行。
本发明第三方面提供偏甘油酯脂肪酶和/或源自嗜热真菌属的脂肪酶和/或源自根毛霉菌属的脂肪酶在水解高熔点油脂中的应用，在以氢化蓖麻油为底物制备12-羟基硬脂酸中的应用，以及在制备用于水解高熔点油脂、或用于以氢化蓖麻油为底物制备12-羟基硬脂酸的脂肪酶组合物中的应用。
本发明第三方面还提供一种反应混合物，所述反应混合物含有：高熔点油脂、第一有机溶剂、第二有机溶剂、水和脂肪酶；其中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属(Thermomycessp.)的脂肪酶、源自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂的极性在4～6之间，第二溶剂的极性小于等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂选自丙酮、氯仿或其混合物。
在一个或多个实施方案中，第二有机溶剂选自环己烷、正己烷或其混合物。
在一个或多个实施方案中，反应混合物中，第一有机溶剂与第二有机溶剂的体积比为40～60：60～40，优选地40:60～50:50。
在一个或多个实施方案中，反应混合物中，第一有机溶剂与第二有机溶剂的体积比小于或等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂是丙酮，第二有机溶剂是正己烷或环己烷，丙酮与正己烷或环己烷的体积比为40～60：60～40，优选地40:60～50:50。
在一个或多个实施方案中，丙酮与正己烷或环己烷的体积比小于或等于1。
在一个或多个实施方案中，第一有机溶剂是氯仿，第二有机溶剂是正己烷，氯仿与正己烷的体积比为40～60：60～40，优选地40:60～50:50。
在一个或多个实施方案中，反应混合物中，以毫升计的有机溶剂的总量与以克计的高熔点油脂质量的数值之比为1～8。
在一个或多个实施方案中，所述反应混合物还含有12-羟基硬脂酸。
在一个或多个实施方案中，所述混合物中，高熔点油脂与水的重量比为1：2～6，优选1：2～4。
在一个或多个实施方案中，所述偏甘油酯脂肪酶是源自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium sp.)或马拉色霉菌属(Malassezia)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自青霉属(Penicillium sp.)的脂肪酶是源自沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自青霉属(Penicillium sp.)的脂肪酶是脂肪酶G50，即商品酶Lipase G"Amano"50。
在一个或多个实施方案中，所述偏甘油酯脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是源自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是Lipozyme TL IM。
在一个或多个实施方案中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是源自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶。
在一个或多个实施方案中，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是Lipozyme RM IM。
在一个或多个实施方案中，源自根毛霉菌属的脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的1.0～5.0％，例如1.0～4.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、2.0～5.0％等。
在一个或多个实施方案中，所述高熔点油脂是熔点在40℃以上的油脂，优选为氢化蓖麻油、棕榈油硬脂或猪油。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶。在这些实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％，偏甘油酯脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和源自根毛霉菌属的脂肪酶。在这些实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的1.0～5.0％，源自根毛霉菌属的脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的1.0～5.0％。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪酶为源自根毛霉菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶。在这些实施方案中，源自根毛霉菌属的脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％；偏甘油酯脂肪酶的含量为高熔点油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％。
具体实施方式
本发明旨在水解反应过程中提高高熔点油脂(例如氢化蓖麻油、棕榈油硬脂或猪油)的水解率，缩短反应时间。本方法在利用高熔点油脂做为底物时，在低温下利用普通的脂肪酶即可进行水解反应，能够明显提高最终水解率。本发明中，“高熔点”指熔点在40℃以上，优选45℃以上或50℃以上。
具体而言，本发明涉及使用源自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶、源自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种脂肪酶水解氢化蓖麻油。
本文中，“偏甘油酯脂肪酶”是指对甘油三酯没有催化水解活力，优先对甘油二酯和/或甘油单酯具有催化水解活力的脂肪酶。偏甘油酯脂肪酶主要有两类：甘油单酯-甘油二酯脂肪酶和甘油单酯脂肪酶。本发明优选使用对甘油单酯和/或甘油二酯具有催化水解活力的偏甘油酯脂肪酶。可使用本领域周知的偏甘油酯脂肪酶，例如，可使用来自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)和马拉色霉菌属(Malassezia)的偏甘油酯脂肪酶。
在某些实施方案中，适用于本发明的偏甘油酯脂肪酶包括但不限于例如CN201410182887.0所公开的偏甘油酯脂肪酶，市售的偏甘油酯脂肪酶如脂肪酶G50(LipaseG"Amano"50)，以及脂肪酶GH1(Huang J,Yang Z,Guan F等，A novel mono-anddiacylglycerol lipase highly expressed in Pichia pastoris,and its applicationfor food emulsifier preparation，Process Biochemistry，2013，48(12):1899-1904)、Lipase SMG1(Xu T,Lu L,Hou S等，Crystal structure of a mono-and diacylglycerollipase from Malassezia globosa,reveals a novel lid conformation and insightsinto the substrate specificity，Journal of Structural Biology，2012，178(3):363-9)和脂肪酶rePcMdl(Tan Z B,Li J F,Li X T等，A unique mono-and diacylglycerollipase from Penicillium cyclopium:heterologous expression,biochemicalcharacterization and molecular basis for its substrate selectivity，Plos One，2014，9(7):e102040)等。
用于本发明的方法或用途中时，偏甘油酯脂肪酶的用量通常为油脂重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％。
在某些实施方案中，本发明使用来自青霉属(Penicillium sp.)的偏甘油酯脂肪酶，尤其是来自沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)的偏甘油酯脂肪酶。例如，来自青霉属(Penicillium sp.)的偏甘油酯脂肪酶可以是脂肪酶G50，即Lipase G"Amano"50。
本发明中，源自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶可以是源自疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces languginosus)的脂肪酶，例如所述源自嗜热真菌属(Thermomycessp.)的脂肪酶是Lipozyme TL IM或与Lipozyme TL IM具有类似酶学性质的来源于嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶。
用于本发明的方法或用途中时，源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量可以为油脂重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％。
本发明中，源自根毛霉菌属的脂肪酶可以是源自米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的脂肪酶。在某些实施方案中，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是Lipozyme RM IM或与Lipozyme RM IM具有类似的酶学性质的来源于根毛霉菌属的脂肪酶。
用于本发明的方法或用途中时，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如1.0～4.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、2.0～5.0％等。
可使用上述所列的任意两种脂肪酶用量范围的任意组合来实施本发明。举例而言，偏甘油酯脂肪酶的用量可以是油脂重量的0.2～3.0％，如0.2～2.0％，与之配合使用的源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量可以为油脂重量的0.2～3.0％，例如0.2～2％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％或1.5～3.0％等；同样地，源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量可以为油脂重量的0.15～3.0％，例如0.2～2％，而与之配合使用的偏甘油酯脂肪酶的用量可以是油脂重量的0.15～3.0％，例如0.2～2％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％或1.5～3.0％等。
水解在有机溶剂的存在下进行。适用于本发明水解的有机溶剂包括第一有机溶剂和第二有机溶剂。通常，第一有机溶剂的极性在4～6之间，第二有机溶剂的极性小于等于1。在某些实施方案中，第一有机溶剂选自丙酮、氯仿或其混合物；第二有机溶剂选自环己烷、正己烷或其混合物。
通常，第一有机溶剂与第二有机溶剂的体积比为40～60：60～40。在某些实施方案中，第一有机溶剂与第二有机溶剂的体积比小于或等于1，例如40：60～50：50(体积比)。
在某些实施方案中，第一有机溶剂是丙酮，第二有机溶剂是正己烷或环己烷，丙酮与正己烷或环己烷的体积比为40～60：60～40。在某些实施方案中，丙酮与正己烷或环己烷的体积比小于或等于1。
在某些实施方案中，第一有机溶剂是氯仿，第二有机溶剂是正己烷，氯仿与正己烷的体积比为40～60：60～40，优选地40:60～50:50。
溶剂的极性测定可以根据溶剂介电常数进行。文献报道的测定方法有：KatritzkyA R,Dan C F,Yang H,et al.Quantitative Measures of Solvent Polarity[J].ChemInform,2004,104(14):175-98。
极性小于1的常见溶剂选自：异戊烷、正戊烷、石油醚、正己烷、环己烷、异辛烷、三甲基戊烷、环戊烷、庚烷等或其一种或多种的组合。
极性大于4小于6的常见溶剂选自：乙酸丁酯、丙醇、甲基异丁酮、四氢呋喃、乙醇、乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、甲基乙基酮、吡啶、丙酮等或其一种或多种的组合。
优选是丙酮和正己烷的混合物。在某些实施方案中，丙酮和正己烷的用量配比为40～60：60～40(体积比)。在某些实施方案中，丙酮的用量不高于正己烷的用量，即丙酮与正己烷的体积比小于等于1。因此，在这些实施方案中，丙酮与正己烷的用量配备为40：60～50：50(体积比)。另外，有机溶剂的总添加量(以毫升计)与油脂重量(以克计)的数值之比通常为1-8，例如1-6。
水解还在水的存在下进行。通常，可根据酶的用量等情况，将适量的水添加到油脂中。通常，油脂与水的重量比为1：2～6，例如1：2～5，1：2～5，1：3～5等。为取得最佳的水解效果，本领域技术人员可根据具体使用的酶的用量、反应的温度、溶剂用量、反应时间等因素确定和调整油脂与水的质量比。
同样地，有机溶剂的用量也根据实际的反应条件予以调整。
水解时，可现将水和有机溶剂加到油脂中，然后加入本文所述的脂肪酶。所述脂肪酶可分别添加到油脂中，也可以混合物的形式添加。添加后，使油脂、脂肪酶和水混合均匀。例如，可将混合物搅拌均匀。若脂肪酶以水溶液的方式添加到油脂中，优选的是，确保脂肪酸水溶液中的水与前文所述的额外添加的水的总量与油脂的质量比在上述范围之内。
水解反应通常可在35～55℃的温度下进行，例如可在40～50℃的温度下进行。因此，在将油脂、脂肪酶和水混匀后，将所得混合物的温度逐渐升温到35～55℃的范围内进行反应。通常，边搅拌边升温。反应过程中可持续搅拌。
对水解反应的时间并无特殊限制，可根据进行水解的油脂的量、所用的脂肪酶的种类及其用量等因素进行调整。或者，可在水解反应过程中取样分析样品酸价并计算水解率，当达到预期的水解率后，即可停止反应。
当水解氢化蓖麻油时，制备得到的12-羟基硬脂酸可采用减压蒸馏的方法分离纯化。
在某些实施方案中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶。在这些实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％，偏甘油酯脂肪酶的用量为油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％。在某些优选的实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶的用量比为大于等于1。
在某些优选实施方案中，油脂与水的重量比为1：4～5；丙酮与正己烷的体积比为40：60；有机溶剂的体积是油脂的重量的2～8倍；源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％，偏甘油酯脂肪酶的用量为油脂重量的0.2～5.0％，例如1.0～3.0％，优选地源自嗜热真菌属的脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶的用量比为大于等于1；优选地，水解在45～50℃的温度下进行。
在某些实施方案中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和源自根毛霉菌属的脂肪酶。在这些实施方案中，源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，如2.0～5.0％；源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，如2.0～5.0％。
在某些优选实施方案中，油脂与水的重量比为1：4～5；丙酮与正己烷的体积比为40：60；有机溶剂的体积是油脂的重量的2～8倍；源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的2.0～5.0％，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的2.0～5.0％。
在某些实施方案中，所述脂肪酶为源自根毛霉菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶。在这些实施方案中，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％；偏甘油酯脂肪酶的用量为油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％。
在某些优选实施方案中，油脂与水的重量比为1：4～5；丙酮与正己烷的体积比为40：60；有机溶剂的体积是油脂的重量的4～8倍；源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的2.0～5.0％，源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为油脂重量的2.0～5.0％。
本发明还提供偏甘油酯脂肪酶和/或源自嗜热真菌属的脂肪酶和/或源自根毛霉菌属的脂肪酶在水解高熔点油脂中的应用，在以氢化蓖麻油为底物制备12-羟基硬脂酸中的应用，以及在制备用于水解高熔点油脂、或用于以氢化蓖麻油为底物制备12-羟基硬脂酸的脂肪酶组合物中的应用。
本发明还提供一种反应混合物，所述反应混合物含有：高熔点油脂、第一有机溶剂、第二有机溶剂、水和脂肪酶；其中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶、源自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种。在某些实施方案中，所述反应混合物中高熔点油脂、第一有机溶剂、第二有机溶剂、水和脂肪酶的用量、配比如本发明前文所述。在某些实施方案中，所述反应混合物是本发明用于制备12-羟基硬脂酸的反应混合物。在某些实施方案中，所述反应混合物是本发明制备12-羟基硬脂酸过程中获得的反应混合物，其还含有12-羟基硬脂酸。
采用本发明的方法和反应混合物，可获得酸价在100mgKOH/g以上的反应产物(除去有机溶剂和水后)，优选在120mgKOH/g以上的反应产物(除去有机溶剂和水后)。采用本发明的方法和反应混合物，可获得至少50％的水解率，例如至少60％的水解率，更优选至少70％的水解率，更优选至少75％的水解率，更优选至少80％的水解率。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用脂肪酶Lipozyme TL IM均为诺维信(中国)投资有限公司产品，脂肪酶G50为Lipase G"Amano"50，是天野酶制品株式会社(Amano EnzymeInc.)产品。实施例中所用氢化蓖麻油是购自丰益精细化学(连云港)有限公司，熔点为80-82℃；其它常规化学品均购自国药化学试剂有限公司，为分析纯级。实施例中的百分比为重量百分比。脂肪酶TL是以水溶液形式添加，先将Lipozyme TL IM溶解于水中形成常规浓度的水溶液。其他脂肪酶均以粉末形式添加。
实施例中，水解率按以下式子计算：
其中，AV0指油脂原料酸价，对于蓖麻油，其为1.70mgKOH/g；AVt指某时间间隔t取样酸价；SV指油脂原料皂化值，对于蓖麻油，其为182.01mgKOH/g。
对比实施例1(石油醚60-90)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、40ml石油醚(60-90)(400％)，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为4.68mgKOH/g，计算水解率为2.53％。
对比实施例2(异丙醇)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、40ml异丙醇(400％)，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为3.22mgKOH/g，计算水解率为1.74％。
对比实施例3(乙醇)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、40ml乙醇(400％)，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为3.76mgKOH/g，计算水解率为2.03％。
对比实施例4(正己烷)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、40ml正己烷(400％)，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为69.88mgKOH/g，计算水解率为37.81％。
对比实施例5(丙酮)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、40ml丙酮(400％)，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为25.81mgKOH/g，计算水解率为13.37％。
实施例1(丙酮：正己烷＝20:80)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、8ml丙酮、32ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为83.55mgKOH/g，计算水解率为45.39％。
实施例2(丙酮：正己烷＝40:60)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为157.14mgKOH/g，计算水解率为86.21％。
实施例3(丙酮：正己烷＝50:50)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、20ml丙酮、20ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为147.13mgKOH/g，计算水解率为79.61％。
实施例4(丙酮：正己烷＝60:40)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、24ml丙酮、16ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL IM(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为95.22mgKOH/g，计算水解率为51.52％。
实施例5(丙酮：正己烷＝40:60)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.15g液体脂肪酶TL IM(1.5％)、0.15g脂肪酶G50(1.5％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为137.00mgKOH/g，计算水解率为75.04％。
实施例6(丙酮：正己烷＝40:60，溶剂总体积300％)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、12ml丙酮、18ml正己烷，然后加入0.02g液体脂肪酶TL IM(0.2％)、0.02g脂肪酶G50(0.2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为131.41mgKOH/g，计算水解率为71.94％。
实施例7(丙酮：正己烷＝40:60，溶剂总体积500％)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、20ml丙酮、30ml正己烷，然后加入0.02g液体脂肪酶TL IM(0.2％)、0.02g脂肪酶G50(0.2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为138.96mgKOH/g，计算水解率为76.12％。
实施例8
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.3g液体脂肪酶TL(3％)、0.3g脂肪酶G50(3％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为137.84mgKOH/g，计算水解率为76.50％。
实施例9
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.1g液体脂肪酶TL(1％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为114.67mgKOH/g，计算水解率为63.50％。
实施例10
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.1g脂肪酶G50(1％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为135.55mgKOH/g，计算水解率为75.25％。
实施例11(丙酮：正己烷＝40:60，溶剂总体积100％)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、4ml丙酮、6ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为122.59mgKOH/g，计算水解率为67.96％。
实施例12(丙酮：正己烷＝40:60，溶剂总体积200％)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、8ml丙酮、12ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为144.39mgKOH/g，计算水解率为80.22％。
实施例13(丙酮：正己烷＝40:60，溶剂总体积800％)
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、32ml丙酮、48ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为141.96mgKOH/g，计算水解率为78.85％。
实施例14
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml环己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为137.89mgKOH/g，计算水解率为76.61％。
实施例15
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml氯仿、24ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为131.60mgKOH/g，计算水解率为73.12％。
实施例16
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为40℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为121.78mgKOH/g，计算水解率为67.65％。
实施例17
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶G50(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为50℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为143.56mgKOH/g，计算水解率为79.76％。
实施例18
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.05g液体脂肪酶TL(0.5％)、0.05g脂肪酶RM(0.5％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为55.99mgKOH/g，计算水解率为30.49％。
实施例19
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.1g液体脂肪酶TL(1％)、0.1g脂肪酶RM(1％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为108.82mgKOH/g，计算水解率为60.21％。
实施例20
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入20g去离子水(200％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为103.90mgKOH/g，计算水解率为57.44％。
实施例21
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、8ml丙酮、12ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为127.11mgKOH/g，计算水解率为70.50％。
实施例22
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、32ml丙酮、48ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为133.71mgKOH/g，计算水解率为74.28％。
实施例23
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.5g液体脂肪酶TL(5％)、0.5g脂肪酶RM(5％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为125.68mgKOH/g，计算水解率为69.70％。
实施例24
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入20g去离子水(200％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶G50(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为113.71mgKOH/g，计算水解率为63.17％。
实施例25
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、8ml丙酮、12ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶G50(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为114.80mgKOH/g，计算水解率为63.78％。
实施例26
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、32ml丙酮、48ml正己烷，然后加入0.2g液体脂肪酶G50(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为129.90mgKOH/g，计算水解率为72.17％。
实施例27
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.5g液体脂肪酶G50(5％)、0.5g脂肪酶RM(5％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为140.11mgKOH/g，计算水解率为77.84％。
实施例28
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入10g去离子水(100％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为62.78mgKOH/g，计算水解率为34.88％。
实施例29
取10g氢化蓖麻油于反应器中，加入60g去离子水(600％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为115.08mgKOH/g，计算水解率为63.93％。
实施例30
取10g棕榈油硬脂(熔点为52℃)于反应器中，加入40g去离子水(400％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为151.96mgKOH/g，计算水解率为77.92％。
实施例31
取10g猪油(熔点为40-50℃)于反应器中，加入10g去离子水(100％)、16ml丙酮、24ml正己烷，然后加入0.2g脂肪酶TL(2％)、0.2g脂肪酶RM(2％)，在400rpm搅拌状态下开始加热进行反应，反应温度为45℃，反应24h后停止反应。
取出反应物，去除溶剂和水分后检测酸价，酸价为148.06mgKOH/g，计算水解率为75.93％。
Claims (10)
1.一种12-羟基硬脂酸的制备方法，所述方法包括在第一有机溶剂、第二有机溶剂和水的存在下使用脂肪酶水解氢化蓖麻油的步骤；
其中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶、源自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种；
其中，所述第一有机溶剂的极性在4～6之间，和/或所述第二有机溶剂的极性小于等于1；
优选地，所述第一有机溶剂选自丙酮、氯仿或其混合物；和/或所述第二有机溶剂选自环己烷、正己烷或其混合物；和/或
优选地，所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的体积比为40～60：60～40；和/或优选地，所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的体积比小于或等于1；和/或
优选地，以毫升计的所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的总添加量与以克计的氢化蓖麻油质量的数值之比为1～8；和/或
优选地，氢化蓖麻油与水的重量比为1：1～6，如1：2～4或1：4～5。
2.一种水解高熔点油脂的方法，所述方法包括在第一有机溶剂、第二有机溶剂和水的存在下使用脂肪酶水解高熔点油脂的步骤；
其中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶、源自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种；
其中，所述第一有机溶剂的极性在4～6之间，和/或所述第二有机溶剂的极性小于等于1；
优选地，所述第一有机溶剂选自丙酮、氯仿或其混合物；和/或所述第二有机溶剂选自环己烷、正己烷或其混合物；
和/或
优选地，所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的体积比为40～60：60～40；和/或优选地，所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的体积比小于或等于1；和/或
优选地，以毫升计的所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的总添加量与以克计的氢化蓖麻油质量的数值之比为1～8；和/或
优选地，所述高熔点油脂与水的重量比为1：1～6，如1：2～4或1：4～5；和/或
优选地，所述高熔点油脂为熔点在40℃以上的油脂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
所述偏甘油酯脂肪酶是源自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium sp.)或马拉色霉菌属(Malassezia)的脂肪酶；优选地，所述偏甘油酯脂肪酶是源自沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)的脂肪酶；更优选地，所述偏甘油酯脂肪酶是脂肪酶G50；和/或
所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是源自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶；优选地，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是Lipozyme TL IM；和/或
所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是源自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶；优选地，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是Lipozyme RM IM。
4.如权利要求1－3中任一项所述的方法，其特征在于，
所述偏甘油酯脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0％、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％；和/或
所述源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的0.1～6.0％，例如0.1～5.0％、0.15～5.0、0.15～4.0％、0.15～3.0％、0.15～2.5％、0.15～2.0％、0.15～1.5％、0.15～1.0％、0.2～5.0％、0.2～3.0％、0.2～2.0％、0.2～1.5％、0.2～1.0％、1.0～5.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％、1.0～1.5％、1.5～5.0％、1.5～3.0％、1.5～2.0％、2.0～5.0％、2.0～3.0％或3.0～5.0％；和/或
所述源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的1.0～5.0％，例如1.0～4.0％、1.0～3.0％、1.0～2.0％或2.0～5.0％。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶；或所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和源自根毛霉菌属的脂肪酶；或所述脂肪酶为源自根毛霉菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶；和/或
水解在35～55℃的温度下进行，例如在40～50℃或45～50℃的温度下进行。
6.如权利要求1－5中任一项所述的方法，其特征在于，
所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶；其中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的0.2～5.0％，所述偏甘油酯脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的0.2～5.0％；优选地，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶的用量比为大于等于1；或
所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和源自根毛霉菌属的脂肪酶；其中，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的1.0～5.0％，如2.0～5.0％；所述源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的1.0～5.0％，如2.0～5.0％；或
所述脂肪酶为源自根毛霉菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶；其中，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％；所述偏甘油酯脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的1.0～5.0％，例如2.0～5.0％。
7.如权利要求1－5中任一项所述的方法，其特征在于，
所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶与偏甘油酯脂肪酶；其中，所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂与水的重量比为1：4～5；丙酮与正己烷的体积比为40：60；丙酮与正己烷的总体积是所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂的重量的2～8倍；所述源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的0.2～5.0％，所述偏甘油酯脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的0.2～5.0％，优选地所述源自嗜热真菌属的脂肪酶与所述偏甘油酯脂肪酶的用量比为大于等于1；优选地，水解在45～50℃的温度下进行；或
所述脂肪酶为源自嗜热真菌属的脂肪酶和源自根毛霉菌属的脂肪酶；其中，所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂与水的重量比为1：4～5；丙酮与正己烷的体积比为40：60；丙酮与正己烷的总体积是所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂的重量的2～8倍；所述源自嗜热真菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的2.0～5.0％，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的2.0～5.0％；或
所述脂肪酶为源自根毛霉菌属的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶；其中，所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂与水的重量比为1：4～5；丙酮与正己烷的体积比为40：60；丙酮与正己烷的总体积是所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂的重量的4～8倍；所述源自根毛霉菌属的脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的2.0～5.0％，所述偏甘油酯脂肪酶的用量为所述氢化蓖麻油或所述高熔点油脂重量的2.0～5.0％。
8.一种反应混合物，其特征在于，所述反应混合物含有：高熔点油脂、第一有机溶剂、第二有机溶剂、水和脂肪酶；
其中，所述脂肪酶为源自嗜热真菌属(Thermomyces sp.)的脂肪酶、源自根毛霉菌属(Rhizomucor sp.)的脂肪酶和偏甘油酯脂肪酶中的至少两种；
其中，所述第一有机溶剂的极性在4～6之间，和/或所述第二有机溶剂的极性小于等于1；
优选地，所述第一有机溶剂选自丙酮、氯仿或其混合物；和/或所述第二有机溶剂选自环己烷、正己烷或其混合物；和/或
优选地，所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的体积比为40～60：60～40；和/或优选地，所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的体积比小于或等于1；和/或
优选地，以毫升计的所述第一有机溶剂与所述第二有机溶剂的总添加量与以克计的氢化蓖麻油质量的数值之比为1～8；和/或
优选地，所述反应混合物中，高熔点油脂与水的重量比为1：1～6，如1：2～4或1：4～5；和/或
优选地，所述高熔点油脂为熔点在40℃以上的油脂，如氢化蓖麻油；优选地，所述反应混合物还含有12-羟基硬脂酸。
9.偏甘油酯脂肪酶和/或源自嗜热真菌属的脂肪酶和/或源自根毛霉菌属的脂肪酶在水解高熔点油脂中的应用，在以氢化蓖麻油为底物制备12-羟基硬脂酸中的应用，以及在制备用于水解高熔点油脂、或用于以氢化蓖麻油为底物制备12-羟基硬脂酸的脂肪酶组合物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，
所述偏甘油酯脂肪酶是源自曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium sp.)或马拉色霉菌属(Malassezia)的脂肪酶；优选地，所述偏甘油酯脂肪酶是源自沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)的脂肪酶；更优选地，所述偏甘油酯脂肪酶是脂肪酶G50；和/或
所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是源自疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶；优选地，所述源自嗜热真菌属的脂肪酶是Lipozyme TL IM；和/或
所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是源自米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的脂肪酶；优选地，所述源自根毛霉菌属的脂肪酶是Lipozyme RM IM。
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