CN111474140A - 一种双通道正交相位显微成像采样*** - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双通道正交相位显微成像采样***，包括五棱镜、激光发射装置、第一图像采集装置和第二图像采集装置，所述五棱镜内部设空心通道；第一光束射入五棱镜后水平射入空心通道内的样品，部分第一光束水平透射出去形成水平通道的物光，另一部分第一光束形成垂直通道的参考光；第二光束射入五棱镜后通过所述五棱镜的半透半反的棱镜面将部分第二光束水平透射出去形成水平通道的参考光，另一部分第二光束形成垂直通道的物光；所述第一图像采集装置用于采集水平通道的物光和参考光的干涉放大图像，所述第二图像采集装置用于采集垂直通道的物光和参考光的干涉放大图像。本发明实现了同质量的双光源，可提高通道之间的匹配性。
Description
技术领域
本发明涉及光学三维形态成像技术领域或者细胞三维形态显微成像领域，特别涉及一种双通道正交相位显微成像采样***。
背景技术
学科研究和工程应用中有许多微尺度的相位体(即是对可见光为透明体)需要进行3D形态显微成像，其中特别是细胞形态检测具有重要的科学研究和临床应用意义。由于细胞是相位体，并且尺度在微米量级，具有活性，所以特别依赖于相位显微成像技术的水平。例如：常见的白血病、局部贫血、视网膜病变等疾病可以从白细胞的形态分析结果得知；糖尿病、败血症、疟疾、动脉硬化、心肌梗塞、脑梗死、精神***症和锌缺乏症等可以根据红细胞的形态来判断。此外，在细胞动力学行为的研究中，细胞亚结构3D形态的精密、快速成像十分重要。由此可见，双通道相位显微成像技术在生物细胞亚结构形态的检测中具有极其重要的应用意义。
定量相位显微技术，是一种重要的无损光学显微技术，是对光与细胞这类相位物体相互作用而产生相移特性的应用，近年来发展迅速。自1997年，Yamaguchi等把相移技术引入到数字全息技术中，通过四步相移运算从四幅全息图像中获得了相位信息以来。德国明斯特大学Kemper等提出了分别基于非衍射重建再现方法和基于迈克尔逊光路的数字全息显微技术。美国伊利诺伊大学定量光学成像实验室Popescu课题组先后提出了傅里叶相位显微技术(FPM)、衍射相位显微技术(DPM)以及利用白光作为光源的一些延伸技术等，特别是，该课题组于2011年提出了与原子力显微镜分辨精度相当且处理速度超快的空间光干涉显微技术(SLIM)。美国杜克大学Wax课题组提出了双通道干涉以及微离轴干涉相位显微技术等等。然而由于相位是细胞折射率与物理厚度的乘积，所以相位信息只能反映出无内核、胞内介质均匀的细胞(如红细胞)的结构特征。对于胞内折射率分布不均匀的细胞(如有核细胞)，仅有相位信息尚无法反映细胞内部结构特征与性质。针对这一问题，发展出了一些相位显微拓展技术，如美国北卡罗来纳大学的Edward等结合剪切力反馈技术和相位显微技术，可同时获得细胞的物理厚度和相位信息，再经过计算处理可得到细胞内部结构的相对光学厚度。2012年日本学者Sugiyama等将全场定量相位显微(QPM)和干涉反射显微(IRM)相结合，提供了一种纳米级相位显微方法，该多重QPM-IRM成像***可以同时获得细胞粘附形态和光学厚度。尽管上述这些拓展技术有各自的优势，但是都需要多种仪器、多种方法的组合，很难满足低仪器成本下的细胞三维形态成像的要求。
层析技术是实现细胞3D成像的又一种光学方法。2007年，美国麻省理工学院Choi和Fang-Yen等借助移相激光干涉仪，并采用旋转照射光源角度的方法来实现层析相位显微。但是该方法具有一定的局限性，如不宜用于相对较厚的样品成像，因为该类样品的物理厚度和相移不能近似地认为存在线性关系。俄罗斯光物理测量研究学院的Vishnyakov和Levin将相位显微技术与计算机层析技术相结合，用于测量细胞等透明生物样品折射率的三维分布。2006年，Charrière和Marian等基于数字全息相位成像技术，通过旋转样品的方式间接地改变光源照射方向，得到多方向上的投影数据，并利用滤波反投影重建技术进行完全投影重建,获得细胞的三维折射率空间分布。2007年，日本Kagawa大学的Yasokawa和Ishimaru等将光镊(Optical Tweezers)技术和具有移相功能的马赫-曾德干涉仪相结合搭建了实验装置，该方法最大的优势在于突破了传统光学计算机层析***观测视角受显微物镜数值孔径限制的局限性，实现了细胞360度全立体角范围内的测量，避免了因投影数据不足而可能在后期重建中产生的误差。Popescu课题组将层析思想用于相位显微中，在2007年提出了层析相位显微(TPM)，该技术的分辨率可达到1-15μm，即从参考光相对样品光频移引起的时变干涉图像中获取定量相位图像，再利用多角度照明时获得的相位图像来重建样品折射率的三维层析图像。这类多角度照射方法无外乎是通过旋转样品或是旋转照射光这两种方法来实现。可是旋转样品的方法难以保证样品在中心位置上，不易定位且系数偏差不确定，采样频率低。而旋转照射光的方法仅能在有限角度范围内移动反射镜，导致转动范围小，采样幅数少且转动偏差大。2010年，韩国Choi等应用全场光学相干层析技术，基于单个细胞内部折射率的分布，获得了层析图像。2011年，霍华德·休斯医学院研究所开发了贝塞尔光束平面照明显微镜，可获得单个活细胞的高分辨率3D亚细胞影像。这类层析技术虽然可以得到3D图像，但是都需要扫描、重构，数值处理量大，耗时长，在细胞的动态研究方面存在很大局限性，且不能够观察批量细胞。
为了实现细胞3D形态成像，国内为出现了一些专利应用技术，专利公开了利用两个全反镜可快速实现双角度的相位成像，具有高度的稳定性，该方法通过旋转两个全反镜来改变照射样品的角度，其采集角度有限且时空采集效率低；专利“公开了基于马赫-曾德尔干涉原理，利用光纤耦合器和准直器实现双波长同轴相移干涉显微成像，通过PZT改变参考光的相移值，可获得5个双波长同轴相移干涉图。其采样速度快，但光纤耦合效率影响干涉成像的质量。这些专利技术存在着光路复杂，稳定性不高的缺点，由此而开发的仪器成本高，维修复杂。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种双通道正交相位显微成像采样***，解决了传统双光路正交相位显微成像光路的三个不足，其一是双光源由于器件的不均衡，从而会在正交两个通道中产生不同的***误差，从而影响形态重建的精准度；其二是传统的成像往往是静态玻片载样，在此采用了流式通道的方法，并且保证了双光束均对采样通道的正入射，从而可有效提高成像采样速度，其三是传统正交双通道相位显微成像光路结构复杂，器件繁多，维修成本高，以五棱镜为光路调制下的光路结构将有效解决这样的问题。
本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
一种双通道正交相位显微成像采样***，包括五棱镜、激光发射装置、第一图像采集装置和第二图像采集装置，所述五棱镜内部设空心通道，用于放置样品；所述激光发射装置用于产生平行的光束；第一光束射入五棱镜后水平射入空心通道内的样品，所述第一光束通过所述五棱镜的半透半反的棱镜面将部分第一光束水平透射出去，用于形成水平通道的物光，另一部分第一光束经过两次反射、一次折射后垂直从五棱镜中射出，用于形成垂直通道的参考光；第二光束射入五棱镜后通过所述五棱镜的半透半反的棱镜面将部分第二光束水平透射出去，用于形成水平通道的参考光，另一部分第二光束经过两次反射后垂直射入空心通道内的样品，且另一部分第二光束垂直从五棱镜中射出，用于形成垂直通道的物光；所述第一图像采集装置用于采集水平通道的物光和参考光的干涉图像，所述第二图像采集装置用于采集垂直通道的物光和参考光的干涉图像。
进一步，所述五棱镜的第一棱镜面、第二棱镜面和第四棱镜面为透射面，所述五棱镜的第三棱镜面为半透半反面，所述五棱镜的第五棱镜面为全反面；
射入第一棱镜面的所述第一光束和第二光束光平行经过空心通道从第三棱镜面射出，且所述第一光束透过所述空心通道照射样品；一部分所述第一光束和第二光束通过第三棱镜面透射进入第一图像采集装置，另一部分所述第一光束和第二光束依次通过第三棱镜面、第五棱镜面和第二棱镜面透射进入第二图像采集装置；另一部分所述第二光束透过所述空心通道照射样品；经过所述空心通道的第一光束和第二光束分别与另一部分所述第一光束和第二光束相互垂直。
进一步，从所述五棱镜射出的部分第二光束通过光栅滤波装置，形成水平通道的参考光；从所述五棱镜射出的另一部分第一光束通过光栅滤波装置，形成垂直通道的参考光。
进一步，所述光栅滤波装置包括光栅和滤波片；部分第二光束或另一部分第一光束依次通过光栅和滤波片，所述光栅用于使部分第二光束或另一部分第一光束产生衍射；所述滤波片用于筛选衍射后的部分第二光束或另一部分第一光束的零级光。
进一步，所述水平通道的物光和参考光通过合光放大装置射入所述第一图像采集装置，所述垂直通道的物光和参考光通过合光放大装置射入所述第二图像采集装置；所述合光放大装置用于将参考光与物光进行合光后放大。
进一步，所述合光放大装置包括合光镜和透镜组件；所述合光镜用于将参考光与物光相汇产生干涉光束，所述透镜组件用于放大干涉光束，所述干涉光束射入所述第一图像采集装置或第二图像采集装置。
进一步，还包括控制***，所述控制***根据第一图像采集装置和第二图像采集装置采集的图案通过最大熵层析重建方法进行样品三维形态重建，用于获取样品形态图像。
本发明的有益效果在于：
1.本发明所述双通道正交相位显微成像采样***，通过分光片，实现了同质量的双光源，可提高通道之间的匹配性。
2.本发明所述双通道正交相位显微成像采样***，利用五棱镜表面的透射和反射特征，实现了正交双光路的干涉成像，其光路和器件简单、成本低、实现干涉成像效率高。
3.本发明所述双通道正交相位显微成像采样***，在五棱镜体内设有正四方体采样通道，可实现流式采样，并且保证了正入射，可有效提高采样成像速度和计算效率。
4.本发明所述双通道正交相位显微成像采样***，采用后置放大的方法可利用远场成像有效解决五棱镜占空所带来的近场放大问题。
附图说明
图1为本发明实施例1所述双通道正交相位显微成像采样***原理图。
图2为本发明实施例2所述双通道正交相位显微成像采样***原理图。
图中：
1-激光器；2-分光镜；3-五棱镜；4-空心通道；5-第一光栅；6-第一滤波片；7-第一合光器；8-第一透镜；9-第二透镜；10-第一CCD相机；11-第二光栅；12-第二滤波片；13-第二合光镜；14-第三透镜；15-第四透镜；16-第二CCD相机。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
如图1所示，本发明所述双通道正交相位显微成像采样***，包括五棱镜3、激光发射装置、第一图像采集装置和第二图像采集装置，所述五棱镜3内部设空心通道4，用于放置样品；空心通道4为四方体，可以是正方形也可以是长方形。所述空心通道4为处于五棱镜3双光束正交处的正方空心通道，用于相位体样品的通过，实现了流式采样，且保证了水平与垂直方向的两光束都为正入射，避免产生二次折射，提高了采样成像速度和计算效率。
所述激光发射装置用于产生平行的光束；第一光束射入五棱镜3后水平射入空心通道4内的样品，所述第一光束通过所述五棱镜3的半透半反的棱镜面将部分第一光束水平透射出去，用于形成水平通道的物光，另一部分第一光束经过两次反射、一次折射后垂直从五棱镜3中射出，用于形成垂直通道的参考光；第二光束射入五棱镜3后通过所述五棱镜3的半透半反的棱镜面将部分第二光束水平透射出去，用于形成水平通道的参考光，另一部分第二光束经过两次反射后垂直射入空心通道4内的样品，且另一部分第二光束垂直从五棱镜3中射出，用于形成垂直通道的物光；从所述五棱镜3射出的部分第二光束通过光栅滤波装置，形成水平通道的参考光；从所述五棱镜3射出的另一部分第一光束通过光栅滤波装置，形成垂直通道的参考光。所述第一图像采集装置用于采集水平通道的物光和参考光的干涉图像，所述第二图像采集装置用于采集垂直通道的物光和参考光的干涉图像。所述水平通道的物光和参考光通过合光放大装置射入所述第一图像采集装置，所述垂直通道的物光和参考光通过合光放大装置射入所述第二图像采集装置；所述合光放大装置用于将参考光与物光进行合光后放大。
实施例1如图1所示，本发明所述双通道正交相位显微成像采样***，包括激光器1、分光镜2和五棱镜3，所述激光器1发出的光束经过分光镜2后形成平行、同性能特征的两束光束；所述五棱镜3的第一棱镜面、第二棱镜面和第四棱镜面为透射面，所述五棱镜3的第三棱镜面为半透半反面，所述五棱镜3的第五棱镜面为全反面；射入第一棱镜面的所述第一光束和第二光束光平行经过空心通道4从第三棱镜面射出，且所述第一光束透过所述空心通道4照射样品；一部分所述第一光束和第二光束通过第三棱镜面透射进入第一图像采集装置，另一部分所述第一光束和第二光束依次通过第三棱镜面、第五棱镜面和第二棱镜面透射进入第二图像采集装置；另一部分所述第二光束透过所述空心通道4照射样品；经过所述空心通道4的第一光束和第二光束分别与另一部分所述第一光束和第二光束相互垂直。
第一图像采集装置进行水平通道信息采集：从分光镜2出射的第一光束进入五棱镜3后水平通过样品通道4，照射样品，随后经过五棱镜的第三棱镜面后，部分第一光束水平射出，形成水平通道的物光；第二光束经过五棱镜的第三棱镜面后，部分第二光束水平透射出去，经过第一光栅5产生衍射，衍射光经过第一滤波器6后，零级光被筛选出，形成水平通道的参考光；水平通道的物光和参考光经过第一合光镜7后相汇产生干涉，该干涉光束通过由第一透镜8和第二透镜9构成的第一后置放大透镜组，进行后置放大，将干涉图成像在第一CCD相机10上。
第二图像采集装置进行垂直通道信息采集：从分光镜2出射的第二光束经过五棱镜3的第三棱镜面后，另一部分第二光束经过两次反射、一次折射后垂直通过样品空心通道4，照射样品，形成垂直通道的物光；第一光束经五棱镜3后水平通过样品通道4后，另一部分第一光束经过两次反射、一次折射后垂直从五棱镜3的第二棱镜面射出，经过第二光栅11产生衍射，衍射光经过第二滤波器12后，零级光被筛选出，形成垂直通道的参考光束。垂直通道的物光和参考光经过第二合光镜13后相汇产生干涉，该干涉光束通过由第三透镜14和第四透镜15构成的第二后置放大透镜组，进行后置放大，将干涉图成像在第二CCD相机16上。
其中水平、垂直两通道上CCD均将捕获的干涉显微图样传输至计算机进行图样处理，为了确定细胞的三维形态分布，首先进行相位恢复，获取双通道的相位分布，然后需要重构相位物体的折射率空间分布，应用网格法对欲重建的相位物体进行等间距的划分，要求建立的立方体网格能完全覆盖相位物体。
控制***根据第一图像采集装置和第二图像采集装置采集的图案首先对其正交干涉图进行相位恢复，获取正交两通道的相位分布；然后基于正交相位分布，利用最大熵层析重建方法进行样品三维形态重建，获取样品形态图像
如图2为本发明的实施例2，所述五棱镜3的五个内角分别为：∠1为90°、∠2为117°、∠3为117°、∠4为108°、∠5为108°。其五个表面属性为：BC面为镀膜全反面；DE面为镀膜半透半反面，各占50％；AB面、AE面和CD为自然透射面。五棱镜中双光束正交处的正方空心通道设计，该通道保证了入射光不会产生二次折射，并且能够连续通过样品，正交光束相交通过样品。所述正方空心通道为样品通道，其中心位于自C到B三分之一垂线与E到D三分之一水平线交点。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种双通道正交相位显微成像采样***，其特征在于，包括五棱镜(3)、激光发射装置、第一图像采集装置和第二图像采集装置，所述五棱镜(3)内部设空心通道(4)，用于放置样品；
所述激光发射装置用于产生平行的光束；第一光束射入五棱镜(3)后水平射入空心通道(4)内的样品，所述第一光束通过所述五棱镜(3)的半透半反的棱镜面将部分第一光束水平透射出去，用于形成水平通道的物光，另一部分第一光束经过反射和折射后垂直从五棱镜(3)中射出，用于形成垂直通道的参考光；第二光束射入五棱镜(3)后通过所述五棱镜(3)的半透半反的棱镜面将部分第二光束水平透射出去，用于形成水平通道的参考光，另一部分第二光束经过反射后垂直射入空心通道(4)内的样品，且另一部分第二光束垂直从五棱镜(3)中射出，用于形成垂直通道的物光；
所述第一图像采集装置用于采集水平通道的物光和参考光的干涉图像，所述第二图像采集装置用于采集垂直通道的物光和参考光的干涉图像。
2.根据权利要求1所述双通道正交相位显微成像采样***，其特征在于，所述五棱镜(3)的第一棱镜面、第二棱镜面和第四棱镜面为透射面，所述五棱镜(3)的第三棱镜面为半透半反面，所述五棱镜(3)的第五棱镜面为全反面；
射入第一棱镜面的所述第一光束和第二光束光平行经过空心通道(4)从第三棱镜面射出，且所述第一光束透过所述空心通道(4)照射样品；一部分所述第一光束和第二光束通过第三棱镜面透射进入第一图像采集装置，另一部分所述第一光束和第二光束依次通过第三棱镜面、第五棱镜面和第二棱镜面透射进入第二图像采集装置；另一部分所述第二光束透过所述空心通道(4)照射样品；经过所述空心通道(4)的第一光束和第二光束分别与另一部分所述第一光束和第二光束相互垂直。
3.根据权利要求1所述双通道正交相位显微成像采样***，其特征在于，从所述五棱镜(3)射出的部分第二光束通过光栅滤波装置，形成水平通道的参考光；从所述五棱镜(3)射出的另一部分第一光束通过光栅滤波装置，形成垂直通道的参考光。
4.根据权利要求3所述双通道正交相位显微成像采样***，其特征在于，所述光栅滤波装置包括光栅(5、11)和滤波片(6、12)；部分第二光束或另一部分第一光束依次通过光栅(5、11)和滤波片(6、12)，所述光栅(5、11)用于使部分第二光束或另一部分第一光束产生衍射；所述滤波片(6、12)用于筛选衍射后的部分第二光束或另一部分第一光束的零级衍射光。
5.根据权利要求1所述双通道正交相位显微成像采样***，其特征在于，所述水平通道的物光和参考光通过合光放大装置射入所述第一图像采集装置，所述垂直通道的物光和参考光通过合光放大装置射入所述第二图像采集装置；所述合光放大装置用于将参考光与物光进行合光后放大。
6.根据权利要求5所述双通道正交相位显微成像采样***，其特征在于，所述合光放大装置包括合光镜(7、13)和透镜组件；所述合光镜(7、13)用于将参考光与物光相汇产生干涉光束，所述透镜组件用于放大干涉光束，所述干涉光束射入所述第一图像采集装置或第二图像采集装置。
7.根据权利要求1所述双通道正交相位显微成像采样***，其特征在于，还包括控制***，所述控制***根据第一图像采集装置和第二图像采集装置采集的图案通过最大熵层析重建方法进行样品三维形态重建，用于获取样品形态图像。
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