CN100588430C

CN100588430C - 基于表位的SARS-Cov基因疫苗及其构建

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Publication number: CN100588430C
Application number: CN200410016453A
Authority: CN
Inventors: 熊思东; 汪晓华; 王缨; 储以微
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2010-02-10
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: CN1657102A

Abstract

本发明公开了一种基于表位的SARS-Cov基因疫苗，所述的疫苗以一种可用于人体的质粒为载体，以人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的若干B细胞表位为目的抗原，经密码子优化后，通过基因工程方法制备获得。本发明还公开了该疫苗的制备方法。该疫苗既具有特异性高的特点，又可降低非特异交叉反应引起的自身免疫病和抗体介导的感染增强效应的发生，克服了单表位短肽表达效率差，抗病毒突变能力弱，易产生耐受的缺点，有较好的预期临床价值。

Description

基于表位的SARS-Cov基因疫苗及其构建

技术领域

本发明属于生物工程和免疫学领域，涉及一种基因疫苗，进一步地，本发明涉及一种采用基因工程手段构建的基于表位的SARS-Cov基因疫苗。

背景技术

新近分离的冠状病毒(SARS-Cov)是目前公认的引起非典型性肺炎爆发的致病原。它给人类健康带来巨大威胁，使我国经济蒙受巨大损失，曾经感染了五大洲8000多人，并导致了大于10％的死亡率。根据基因组测序分析结果，目前已知该病毒的主要的结构蛋白包括膜表面的Spike(S)，M和E蛋白以及与RNA基因组相连的N蛋白，这都有可能成为发展疫苗的主要靶点。作为一种病毒引起的传染病，疫苗被广泛认为是最有效的防止与控制这类疾病的最佳方法。目前我国已着重发展了灭活病毒疫苗，取得了重要进展，而基于腺病毒载体的亚单位疫苗也完成了初步的动物实验。然而，现有研究表明，免疫***在产生有效控制病毒生长的中和性抗体的同时，也可能会产生有助于病毒感染的“恶性”抗体。此外，人们还发现全蛋白抗原中除了诱导免疫应答的功能性T、B表位外，一些无关的具有干扰甚至抑制作用的侧翼序列会影响全蛋白疫苗以及全抗原基因疫苗的效果。因而，以表位为基础的高特异性疫苗将为人类提供更安全有效的保护。

抗原表位(epitope)是抗原分子中诱生不同免疫应答最基本的结构及功能单位，结构短小，B细胞表位长度为10～15个氨基酸，CTL表位仅有8～10个氨基酸。以精心筛选的T、B细胞抗原表位构建免疫分子，既可有目的地诱生各类不同的免疫反应，又避免了天然蛋白中抑制性抗原表位引起的免疫抑制现象，是新近预防及治疗性疫苗研究的热点。因此抗原表位或短肽的基因工程表达疫苗及以抗原表位为基础的基因疫苗研究一直是近年分子免疫学研究的重点和难点。

在当前疫苗的研制中，蛋白疫苗作为经典疫苗仍在一定程度上被广泛应用，而基因疫苗作为第三代疫苗的新兴代表，越来越受到广大学者的重视。1990年，美国学者Wolff等首次发现：裸露的质粒DNA直接肌肉注射后，可高水平、持续表达外源蛋白质，并可诱生特异性免疫反应。此后，以此为基础建立及发展的基因免疫技术(Gene Immunization)已被广泛应用于抗病毒、细菌、寄生虫、肿瘤及自身抗原等的免疫应答研究。研究证实，编码靶抗原基因的基因疫苗(DNA疫苗)由于可较好地模拟天然病毒等的感染过程，因此可在注射局部天然地表达具有空间构像的靶抗原，从而更有利于诱导抗原特异性免疫应答，尤其是对清除病毒感染起决定性作用的CTL应答。十余年来，基因免疫正逐步地由最初阶段的全基因免疫***的建立及广泛应用，发展到以抗原表位为靶抗原的精确定位阶段，进而到探讨基因免疫机理、改造建立新型免疫***阶段。

目前，由于短肽表达的低效性，所有报道的SARS-Cov疫苗还没有有效诱导机体针对病毒免疫应答的基于抗原表位的基因疫苗。基于载体蛋白的多肽疫苗也尚在尝试寻找靶位点阶段，本发明运用软件和数据库预测的方法，结合已有的病毒与其感染靶细胞结合相关位点报道，选取了四个可能与病毒宿主特异性或发病相关的有较好免疫特性的靶表位，通过连接序列串联，建立了能有效激发机体T、B淋巴细胞免疫反应、并能诱导较长时间免疫记忆的基因疫苗，为传统疫苗研究做了有益的补充，因此有较好的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于表位的SARS-Cov基因疫苗，它是以一种可用于人体的质粒为载体，以SEQ ID NO：18以及SEQ ID NO：19所述的氨基酸序列为目的抗原，通过基因工程方法制备获得。所述的SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：19分别为人类SARS冠状病毒膜外S、M蛋白抗原中的T、B细胞表位SARS-s_437-459aa和SARS-m_1-20aa的氨基酸序列。

较佳的，本发明所述的基于表位的SARS-Cov疫苗以一种可用于人体的质粒为载体，以SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21以及SEQ ID NO：19所述的氨基酸序列为目的抗原，通过基因工程方法制备获得。所述的SEQ IDNO：20和SEQ ID NO：21分别为人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的B细胞表位SARS-s_174-195aa和SARS-s_556-568aa的核苷酸序列。

本发明所述的可用于人体的质粒优选为pVAON33，它是由pVAX1质粒改建获得，将SEQ ID NO：17的33个碱基用HindIII、EcoRI双酶切，然后接入pVAX1质粒，获得pVAON33骨架质粒。改建后的质粒带有有助于增强真核翻译起始的KOZAK序列，pVAON33质粒的结构见图1。

本发明使用的载体中的真核转录元件组合包括人巨细胞病毒(hCMV)启动子序列以及牛生长因子(BGH)的polyA加尾序列。

在设计本发明的基于表位的SARS-Cov疫苗过程中，对多表位的编码基因进行了密码子优化，使之在真核细胞中高水平表达，产生较强的免疫应答。

将本发明所述的目的抗原的用特定的连接序列进行连接后，具有SEQ IDNO：23的氨基酸序列。本发明使用的连接序列优选三氨基酸表位连接序列AAY(GCCGCCTAC)进行连接，其在增强各表位抗原性的同时又保证了各表位的相对独立性。

本发明所要解决的技术问题还在于提供一种基于表位的SARS-Cov疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)运用软件和数据库预测的方法，选取多个病毒宿主特异性或发病相关的有较好免疫特性的靶表位，通过连接序列进行串联，并对所选序列按照哺乳动物密码子偏好进行优化，设计出目的基因；

b)选取一种可用于人体的质粒为载体；

c)将b)所述的质粒与a)中获得的基因片段相连接，筛选阳性克隆，得到带有目的基因的质粒。

d)将c)中得到的质粒进行大规模扩增，抽提和纯化质粒DNA；

e)将d)中扩增和纯化得到的质粒DNA以一定条件和浓度溶解于生物相容性介质，获得基于表位的SARS-Cov疫苗成品。

进一步的，作为本发明的一个较佳的实施方式，所述的基于表位的SARS-Cov疫苗的制备方法包括以下步骤：

a)运用软件和数据库预测的方法，选取人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的B细胞表位SARS-s_174-195aa、SARS-s_437-459aa、SARS-s_556-568aa、SARS-m_1-20aa作为靶表位，通过连接序列串联构建成多表位的新型SARS-Cov基因疫苗(如图1、图2所示)，并对所选序列按照哺乳动物密码子偏好进行优化，设计出目的基因；

b)人工分段合成该目的基因的两条互补寡核苷酸链，退火后其两端为特异性无回文结构的粘性末端，两两连接获得4个较大的二体片段，回收后再两两连接上述4个片段，并回收获得两目的片段，继续连接，体系以特异性引物扩增获得目的基因，目的基因片段用BglII和EcoRI酶切；

c)将pVAX1质粒***KOZAK序列和BglII酶切位点，得到pVAON33质粒，经BglII和EcoRI酶切后，与b)得到的基因片段相连接，筛选出阳性克隆，测序鉴定与设计序列相符，即得到pVAON33-epis质粒；

d)将pVAON33-epis质粒转化DH5α，经培养后获得大量菌体，大规模抽提纯化pVAON33-epis质粒DNA；

e)将抽提得到的纯化的pVAON33-epis质粒DNA在无菌条件下溶解于生理盐水中，获得基于表位的SARS-Cov疫苗成品。

本发明所述的基于表位的SARS-Cov疫苗成品浓度优选为1-3μg/μl。

本发明的另一目的在于提供基于表位的SARS-Cov基因疫苗在制备预防和治疗SARS的药物中的应用。

根据SARS病毒的相关序列SARS coronavirus TOR2(Genbank序列号：AY274119)，本发明以SARS-Cov表面S、M膜蛋白预测有较强免疫原性的T、B细胞抗原表位SARS-s_174-195aa、SARS-s_437-459aa、SARS-s_556-568aa、SARS-m_1-20aa为目的靶表位，通过加入连接序列，并且进行密码子优化，构建了一种非典型性肺炎冠状病毒的DNA疫苗。本发明的疫苗针对病毒免疫反应特异性高，又可降低发生因非特异交叉反应引起的自身免疫病和抗体介导的感染增强效应的风险，克服了单表位短肽表达效率差，抗病毒突变能力弱，易产生耐受的缺点，有较好的预期临床价值。

以下进一步详细叙述本发明的技术方案。

1、多表位串联的靶基因片段获得

以软件预测结合网络数据库预测后，首先确定如表1的四个靶表位。

表1有较强免疫原性的抗原表位

SARS-s<sub>174-195aa</sub>(EY22)	EKSGNFKHLREFVFKNKDGFLY	SEQ IDNO：20
SARS-s<sub>174-195aa</sub>(EY22)	EKSGNFKHLREFVFKNKDGFLY	SEQ IDNO：20	SARS-s<sub>437-459aa</sub>(NP23)	NYKYRYLRHGKLRPFERDISNVP	SEQ IDNO：18
SARS-s<sub>556-568aa</sub>(FT10)	SDFTDSVRDPKTS	SEQ IDNO：21	SARS-s<sub>437-459aa</sub>(NP23)	NYKYRYLRHGKLRPFERDISNVP	SEQ IDNO：18
SARS-s<sub>556-568aa</sub>(FT10)	SDFTDSVRDPKTS	SEQ IDNO：21	SARS-m<sub>1-20aa</sub>(MN20)	MADNGTITVEELKQLLEQWN	SEQ IDNO：19

以上述选定的靶表位氨基酸序列为基础，根据Kotsopoulou E.(Journal ofVirology；Vol.74，No.10，4839-4852)报道的哺乳动物密码子偏好进行优化，人工合成如表2的基因片段，(表2中的序列在退火前序列，)序列寡核苷酸磷酸化后1，2相对应退火，复性分别得到a-h片段。两两连接得ab、cd、ef、gh，连接片段经回收后再次进行两两连接得abcd、efgh，再次回收后连接，以1a，8b为引物扩增，得到两头带有BglII和EcoRI酶切位点的靶基因片段(SEQ IDNO：22)如下：

GAGAAGTCCGGCAACTTTAAGCACTTACGCGAGTTTGTGTTTAAGAA

CAAGGACGGCTTTCTGTACGCCGCCTACAACTACAAGTACAGGTACCTGAGAC

ACGGCAAGCTGAGGCCCTTTGAGAGAGACATCTCCAACGTGCCCGCCGCCTAC

TCCGACTTCACTGACTCCGTTCGCGACCCCAAGACCTCCGCCGCCTACATGGCC

GACAACGGCACCATCACCGTGGAGGAGCTGAAGCAGCTGCTGGAGCAGTGGA

ACTAATAG

其中，

为BglII酶切位点，

为EcoRI酶切位点，GCCGCCTAC为AAY连接序列。

上述序列编码疫苗的目的氨基酸(SEQ ID NO：23)：

EKSGNFKHLREFVFKNKDGFLY AAY NYKYRYLRHGKLRPFERDISNVP AAY

SDFTDSVRDPKTS AAY MADNGTITVEELKQLLEQWN

1a	5’-GGAAGATCTGAGAAGTCCGGCAACTTTAAG-3’	SEQ IDNO：1
1a	5’-GGAAGATCTGAGAAGTCCGGCAACTTTAAG-3’	SEQ IDNO：1	2a	5’-CGCGTAAGTGCTTAAAGTTGCCGGACTTCTCAGATCTTCC-3’	SEQ IDNO：2
1b	5’-CACTTACGCGAGTTTGTGTTTAAGAACAAGGACGGCTTTCT-3’	SEQ IDNO：3	2a	5’-CGCGTAAGTGCTTAAAGTTGCCGGACTTCTCAGATCTTCC-3’	SEQ IDNO：2
1b	5’-CACTTACGCGAGTTTGTGTTTAAGAACAAGGACGGCTTTCT-3’	SEQ IDNO：3	2b	5’-GGCGGCGTACAGAAAGCCGTCCTTGTTCTTAAACACAAACT-3’	SEQ IDNO：4
1c	5’-GTACGCCGCCTACAACTACAAGTACAGGTACCTGAGACA-3’	SEQ IDNO：5	2b	5’-GGCGGCGTACAGAAAGCCGTCCTTGTTCTTAAACACAAACT-3’	SEQ IDNO：4
1c	5’-GTACGCCGCCTACAACTACAAGTACAGGTACCTGAGACA-3’	SEQ IDNO：5	2c	5’-CAGCTTGCCGTGTCTCAGGTACCTGTACTTGTAGTTGTA-3’	SEQ IDNO：6
1d	5’-CGGCAAGCTGAGGCCCTTTGAGAGAGACATCT-3’	SEQ IDNO：7	2c	5’-CAGCTTGCCGTGTCTCAGGTACCTGTACTTGTAGTTGTA-3’	SEQ IDNO：6
1d	5’-CGGCAAGCTGAGGCCCTTTGAGAGAGACATCT-3’	SEQ IDNO：7	2d	5’-GGCACGTTGGAGATGTCTCTCTCAAAGGGCCT-3	SEQ IDNO：8
1e	5’-CCAACGTGCCCGCCGCCTACTCCGACTTCACTGACT-3’	SEQ IDNO：9	2d	5’-GGCACGTTGGAGATGTCTCTCTCAAAGGGCCT-3	SEQ IDNO：8
1e	5’-CCAACGTGCCCGCCGCCTACTCCGACTTCACTGACT-3’	SEQ IDNO：9	2e	5’-GGTCGCGAACGGAGTCAGTGAAGTCGGAGTAGGCGGCG-3’	SEQ IDNO：10
1f	5’-CCGTTCGCGACCCCAAGACCTCCGCCGCCTACATGGC-3’	SEQ IDNO：11	2e	5’-GGTCGCGAACGGAGTCAGTGAAGTCGGAGTAGGCGGCG-3’	SEQ IDNO：10
1f	5’-CCGTTCGCGACCCCAAGACCTCCGCCGCCTACATGGC-3’	SEQ IDNO：11	2f	5’-GCCGTTGTCGGCCATGTAGGCGGCGGAGGTCTTGG-3’	SEQ IDNO：12
1g	5’-CGACAACGGCACCATCACCGTGGAGGAGCTGAAGCA-3’	SEQ IDNO：13	2f	5’-GCCGTTGTCGGCCATGTAGGCGGCGGAGGTCTTGG-3’	SEQ IDNO：12
1g	5’-CGACAACGGCACCATCACCGTGGAGGAGCTGAAGCA-3’	SEQ IDNO：13	2g	5’-GCTCCAGCAGCTGCTTCAGCTCCTCCACGGTGATGGT-3’	SEQ IDNO：14
1h	5’-GCTGCTGGAGCAGTGGAACTAATAGGAATTCCG-3’	SEQ IDNO：15	2g	5’-GCTCCAGCAGCTGCTTCAGCTCCTCCACGGTGATGGT-3’	SEQ IDNO：14
1h	5’-GCTGCTGGAGCAGTGGAACTAATAGGAATTCCG-3’	SEQ IDNO：15	2h	5’-CGGAATTCCTATTAGTTCCAC T-3’	SEQ IDNO：16

表2人工合成的基因片段

2、基因疫苗表达载体的构建表

pVAON33骨架质粒由经FDA认证可用于人体的pVAX1质粒(李忠明教授Food and Drug Administration，Bethesda，MD，USA惠增)改建获得。人工合成的33碱基序列：AGCTTGCCACCATGGGGAGATCTGGATCCTGAG，(SEQ ID NO：17)，依次编码HindIII，Kozak序列，BglII，BamHI和EcoRI序列，经HindIII，EcoRI双酶切后接入pVAX1质粒，获得pVAON33。

3、基因疫苗的鉴定

多表位串联靶基因片段经BglII和EcoRI双酶切后接入pVAON33质粒，经PCR及DNA序列测定，***基因片段与设计相符合(图3)。

4、基因疫苗效果验证

在本发明的实施例中，多表位串联的靶基因通过BamHI和EcoRI双酶切连接克隆到pcDNA4-his/myc载体中体外转染293T细胞，48小时后以anti-myc抗体Western检测可见明显的目的蛋白表达，大小与预测相符(图4)。可见多表位串联的靶基因片段在哺乳动物细胞中能够高效表达。

在本发明的实施例中，以基于表位的SARS-Cov基因疫苗质粒DNA直接肌注免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，结果诱生了的抗SARS-Cov膜表面S和M蛋白的特异性抗体应答(图5)，以大肠杆菌原核表达的多表位串联蛋白在不同时间点刺激，可见该基因疫苗可在小鼠体内诱导至少4个月的免疫记忆反应，从而为该疫苗可能诱导抗SARS-Cov免疫保护效应的长期性提供了佐证。

以基于表位的SARS-Cov基因疫苗质粒DNA直接肌注免疫雌性BALB/c小鼠，经两次加强后，获取免疫小鼠的全脾脏细胞，分别以合成的各预测表位肽和原核表达S蛋白片段进行刺激，以³H渗入法检测淋巴细胞的增殖反应。结果表明该基因诱生了较强的表位肽特异的针对SARS-Cov膜蛋白的细胞免疫应答(图6)，表明该新型基因疫苗不仅包含了有效的B细胞表位，也提供了必要的T细胞表位，从而能在诱导较好的抗体免疫应答的同时，也诱导了的相应的细胞免疫应答。

附图说明

图1是本发明基于表位的SARS-Cov基因疫苗质粒模式图。

图2是本发明基于表位的SARS-Cov基因疫苗质粒中***的目的抗原的结构示意图。

图3是本发明基于表位的SARS-Cov基因疫苗的PCR及测序鉴定，其中(A)中1为DL2000DNA分子量Marker；2为以pVAON33-epis为模板PCR扩增产物(大小为284bp)；(B)为测序结果图(部分)。

图4是多表位串联的靶基因片段在293T细胞中的表达Western检测结果，其中1为pcDNA4-his/myc-epis转染细胞裂解液，2为pcDNA4-his/myc-epis转染细胞上清，3为pcDNA4空质粒转染细胞裂解液，4为pcDNA4空质粒转染细胞上清。

图5是基于多表位的新型SARS-Cov基因疫苗免疫雌性BALB/c小鼠后诱导产生SARS-Cov膜蛋白特异性抗体应答(pVAON33-epis质粒免疫组位试验组；pVAON33空质粒免疫组为对照)，其中(A)为以原核表达的多表位串联的靶基因对应蛋白为抗原检测免疫小鼠抗血清时间曲线图，各质粒免疫组(pVAON33-epis和pVAON33空质粒)分别在第12、18周给予以PBS(pH＝7.2)溶解的对应蛋白20ug/只基因免疫后的实验组小鼠(3只/次)刺激，检测的抗血清对应变化状况。(B)为抗血清滴度峰值时对各预测表位的结合反应特性(以合成的各表位肽作为抗原检测血清免疫反应性的结果)。(C)为抗血清滴度峰值时对原核表达的SARS-Cov表面膜蛋白S(部分)和M的的结合反应特性(以原核表达的SARS-Cov表面膜蛋白S(部分)和M作为抗原检测血清免疫反应性的结果)。

图6是基于多表位的新型SARS-Cov基因疫苗基因免疫雌性BALB/c小鼠后可诱导特异性淋巴细胞增殖反应(pVAON33-epis质粒免疫组位试验组；pVAON33空质粒免疫组为对照)。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的基因疫苗及其构建和用途，而不是用于限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下：

质粒、菌种、细胞、动物：质粒pVAX1由李忠明教授惠赠，宿主细菌DH5α为Gibco BRL公司产品，293T细胞购自中科院上海细胞所。寡核苷酸片段均由北京三博公司合成。6-8周龄雌性BALB/c(H-2^d)小鼠购自中科院上海实验动物中心。

分子生物学试剂：限制性核酸内切酶EcoRI、BglII、T4DNA连接酶(TaKaRa公司)；T4多核苷酸激酶(Biolab公司)；Taq DNA多聚酶(Promega公司)；RNaseA(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；DL2000DNAMarker(TaKaRa公司)。LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB、重蒸酚(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜生物制品公司)。

多肽：由吉尔生物有限公司合成。

细胞培养、转化试剂：细胞培养试剂(Gibco BRL公司)。Lipofectamin2000真核细胞转染试剂(Invitrogen公司)。

免疫学试剂和材料：兔抗myc多克隆抗体(Santa cruz公司)，HRP标记的羊抗兔IgG(ELISA效价1∶1000)(华美生物工程公司)，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(Southern Biotechnology Associates，Inc)。丁哌卡因(Sigma公司)，丝裂霉素C(日本Kyowa Hakko Kogyo公司)，ELISA酶标板(Coastar公司)，ECL+plus化学发光试剂盒(Pharmacia公司)。

实施例1基于表位的SARS-Cov基因疫苗的构建、鉴定和表达

1、基于表位的SARS-Cov基因疫苗的构建

以软件预测结合网络数据库预测后，首先确定了如表1的多肽序列为靶表位，根据Kotsopoulou E.(Journal of Virology；Vol.74，No.10，4839-4852)报道的哺乳动物密码子偏好进行优化后人工合成了如表2的基因片段。合成片段经T4多核苷酸激酶做磷酸化处理1小时后，加热煮沸5分钟，保温缓慢冷却退火后先两两连接得ab、cd、ef、gh(16℃连接6小时)，连接片段经试剂盒回收后再次进行两两连接得abcd、efgh，再度回收后连接，以1a，2h为引物扩增得到两头带有BglII和EcoRI酶切位点的靶基因片段。

pVAON33骨架质粒是由经FDA认证可用于人体的pVAX1质粒(李忠明教授Food and Drug Administration，Bethesda，MD，USA惠赠)改建获得。人工合成的33碱基序列依次编码HindIII，Kozak序列，BglII，BamHI和EcoRI序列并经HindIII，EcoRI双酶切后接入pVAX1质粒后获得。

载体与目的基因片段都经BglII和EcoRI双酶切后回收，连接后筛选阳性克隆，经PCR及DNA序列测定，***基因片段与设计相符合(图3)。

2、基于表位的SARS-Cov基因疫苗的制备与纯化

依照QIAGEN Plasmid Mega Kit推荐程序进行。将重组质粒pVAON33-epis与空pVAON33质粒分别转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，经LB(Amp100ug/ml)液体培养基振荡培养15小时，收集菌体，按照QIAGEN Plasmid MegaKit去杂蛋白、细菌内毒素，最后得到纯化DNA。将质粒DNA溶解于无菌、无热源的NS中，浓度调整为1-3μg/μl，-20℃冻存备用。

3、多表位基因片段的在哺乳动物真核细胞内的体外表达：

293T细胞培养于DMEM。转染前一天以1×10⁵-3×10⁵细胞数种入35mm六孔板，前4小时换液，。借助Lipofectamin2000真核细胞转染试剂，将1-2ug纯化质粒pcDNA4-his/myc-epis或空pcDNA4-his/myc转染该细胞株。37℃，5％CO₂培养4小时后更换培养液，48小时后，收集上清，以15％的不连续变性聚丙烯酰安凝胶电泳分离蛋白组份，转膜并经5％脱脂奶粉封闭后，与兔抗myc多克隆抗体(1∶1000稀释)孵育过夜。洗去一抗后，与HRP标记的羊抗兔IgG抗体(1∶200稀释)孵育2小时。清洗去二抗后，以化学发光试剂盒显色曝光15秒获得Western杂交结果。

Western杂交检测多表位基因片段的在哺乳动物真核细胞内的体外表达显示：在细胞转染48小时后，pcDNA4-his/myc-epis转染的293T细胞中即可检测出该多表位基因片段表达的约近10kd的蛋白分子；而pcDNA4-his/myc质粒转染组及未转染的正常细胞中则无表达，表明经密码子修改的人工合成组装的编码多表位的基因片段能够有效的在体外哺乳动物细胞系内表达(图4)。

实施例2基于表位的SARS-Cov基因疫苗免疫小鼠诱导特异性体液免疫应答的实验研究

实验动物：6-8周龄雌性BALB/c(H-2^d)小鼠，体重16-18克，购自中科院上海实验动物中心。

实验分组与动物免疫：健康雌性BALB/c小鼠各12只，分为2组：(1)以纯化的pVAON33空质粒载体免疫组作对照，6只；(2)以纯化的pVAON33-epis质粒免疫组，6只。肌肉免疫雌性BALB/c小鼠采用轻度麻醉后胫骨前肌肉注射法：以0.75％戊巴比妥钠100-150ul腹腔注射小鼠(按50ug/g体重)，暴露胫骨前肌肉，以1ml注射器自肌肉中部垂直入针，针尖***深度2～3mm，缓慢进针，停留5秒钟。DNA免疫前24小时，注射100ul 0.25％丁哌卡因，使局部肌肉坏死；24小时后再次麻醉小鼠并在同一部位注射100ug/100ul质粒DNA溶液。于0周、3周肌注基因免疫小鼠两次。每两周采血一次，检验产生的体液免疫应答水平。获得血样4℃放置过夜后，6000rpm离心15分钟获得血清样本。用大肠杆菌表达的基于表位的SARS-Cov基因疫苗对应蛋白(10ug/ml)包被的酶标板经含有10％山羊血清、0.5％牛血清白蛋白、0.05％的Tween-20封闭后，以间接ELISA法检测免疫小鼠抗血清中特异的IgG：抗血清经1∶200稀释后，37℃作用2小时，与HRP-兔抗人IgG-在37℃作用1小时，以邻苯二胺显色，测OD490值。

分别在第12、18周以PBS(pH＝7.2)溶解的大肠杆菌表达的基于表位的SARS-Cov基因疫苗对应蛋白20ug/只基因免疫后的实验组小鼠(3只/次)，隔周采血。用间接ELISA法确定抗血清对疫苗对应蛋白、各候选表位、原核表达的SARS-Cov膜S和M蛋白的反应特性。

实验结果(图5)显示：基因疫苗免疫两次后可以在小鼠体内诱导产生特异性的体液免疫应答，其抗血清中IgG滴度在第八周时达到最高，约1∶512左右，空质粒注射组则无特异性抗体生成。该特异性的体液免疫反应主要针对NP和MN表位，并且能较好的与原核表达的SARS-Cov膜S和M蛋白的反应。免疫两个月和四个月后，通过相应抗原蛋白刺激，可以很快诱导免疫记忆反应，短时间产生高达1∶2000以上的特异性IgG抗体，空白质粒免疫组小鼠则无此记忆反应，提示本发明可以诱导较长时间的免疫记忆，时间至少约4个月。

实施例3基于表位的SARS-Cov基因疫苗免疫小鼠诱导特异性细胞免疫应答的实验研究

实验动物：6-8周龄雌性BALB/c(H-2d)小鼠，体重16-18克，购自中科院上海实验动物中心。

实验分组与动物免疫：健康雌性BALB/c小鼠各12只，分为2组：(1)以纯化的pVAON33空质粒载体免疫组作对照，6只；(2)以纯化的pVAON33-epis质粒免疫组，6只。肌肉免疫雌性BALB/c小鼠采用轻度麻醉后胫骨前肌肉注射法：以0.75％戊巴比妥钠100-150ul腹腔注射小鼠(按50ug/g体重)，暴露胫骨前肌肉，以1ml注射器自肌肉中部垂直入针，针尖***深度2～3mm，缓慢进针，停留5秒钟。DNA免疫前24小时，注射100ul 0.25％丁哌卡因，使局部肌肉坏死；24小时后再次麻醉小鼠并在同一部位注射100ug/100ul质粒DNA溶液。于0周、3周肌注基因免疫小鼠两次。二次免疫10天后，处死小鼠，无菌获取全脾脏，三复孔分别加入96孔细胞培养板中，以终浓度为肽5ug/ml，蛋白10ug/ml的各抗原、原核表达的SARS-Cov膜S蛋白片段，多表位疫苗对应的原核表达蛋白体外刺激56小时后加入³H标记的胸腺嘧啶，继续培养16小时，以多头细胞收集器收集细胞，液闪计数仪检测相应的cpm值，计算刺激指数(SI)。

结果(图6)显示：NP、MN表位和多表位疫苗对应的原核表达蛋白对pVAON33-epis免疫后小鼠的脾淋巴细胞有较强刺激增殖作用，对应的空质粒免疫组小鼠则表现为不反应或低反应性；pVAON33-epis免疫后小鼠对原核表达的SARS-Cov膜S蛋白片段有特异性的皮淋巴细胞增殖反应，而空质粒免疫小鼠脾细胞则无此特性。两组间SI值经t检验，p值都小于0.05。这提示，NP和MN表位不仅是有效的B细胞表位也是有效的T细胞表位，且NP表位有很高的免疫特异性。

序列表

<110>复旦大学

<120>基于表位的SARS-Cov基因疫苗及其构建

<160>23

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

GGAAGATCTGAGAAGTCCGGCAACTTTAAG 30

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

CGCGTAAGTGCTTAAAGTTGCCGGACTTCTCAGATCTTCC 40

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

CACTTACGCGAGTTTGTGTTTAAGAACAAGGACGGCTTTCT 41

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

GGCGGCGTACAGAAAGCCGTCCTTGTTCTTAAACACAAACT 41

<210>5

<211>39

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

GTACGCCGCCTACAACTACAAGTACAGGTACCTGAGACA 39

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

CAGCTTGCCGTGTCTCAGGTACCTGTACTTGTAGTTGTA 39

<210>7

<211>32

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

CGGCAAGCTGAGGCCCTTTGAGAGAGACATCT 32

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

GGCACGTTGGAGATGTCTCTCTCAAAGGGCCT 32

<210>9

<211>36

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

CCAACGTGCCCGCCGCCTACTCCGACTTCACTGACT 36

<210>10

<211>38

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

GGTCGCGAACGGAGTCAGTGAAGTCGGAGTAGGCGGCG 38

<210>11

<211>37

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

CCGTTCGCGACCCCAAGACCTCCGCCGCCTACATGGC 37

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

GCCGTTGTCGGCCATGTAGGCGGCGGAGGTCTTGG 35

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

CGACAACGGCACCATCACCGTGGAGGAGCTGAAGCA 36

<210>14

<211>37

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

GCTCCAGCAGCTGCTTCAGCTCCTCCACGGTGATGGT 37

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

GCTGCTGGAGCAGTGGAACTAATAGGAATTCCG 33

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

CGGAATTCCTATTAGTTCCACT 22

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

AGCTTGCCACCATGGGGAGATCTGGATCCTGAG 33

<210>18

<211>23

<212>PRT

<213>人工序列

<400>

Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu 16

Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro 23

<210>19

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>

Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Gln Leu Leu 16

Glu Gln Trp Asn 20

<210>20

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<400>

Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn 16

Lys Asp Gly Phe Leu Tyr 22

<210>21

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<400>

Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser 13

<210>22

<211>279

<212>DNA

<213>合成的寡核苷酸

<400>

AGATCTGAGAAGTCCGGCAACTTTAAGCACTTACGCGAGTTTGTGTTTAA 050

GAACAAGGACGGCTTTCTGTACGCCGCCTACAACTACAAGTACAGGTACC 100

TGAGACACGGCAAGCTGAGGCCCTTTGAGAGAGACATCTCCAACGTGCCC 150

GCCGCCTACTCCGACTTCACTGACTCCGTTCGCGACCCCAAGACCTCCGC 200

CGCCTACATGGCCGACAACGGCACCATCACCGTGGAGGAGCTGAAGCAGC 250

TGCTGGAGCAGTGGAACTAATAGGAATTC 279

<210>23

<211>87

<212>PRT

<213>人工序列

<400>

Glu Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Va lPhe Lys Asn 16

Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Ala Ala Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu 32

Arg His Gly Lys Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro 48

Ala Ala Tyr Ser Asp Phe Thr Asp Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser 64

Ala Ala Tyr Met Ala Asp Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys 80

Gln Leu Leu Glu Gln Trp Asn 87

Claims

1.一种基于表位的SARS-Cov基因疫苗，其特征在于，以一种可用于人体的质粒为载体，以SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列依次串连连接构成多表位串联的靶抗原，然后将多表位串联的靶抗原***所述的载体，通过基因工程方法制备获得，所述的SEQ ID NO：20为人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的B细胞表位SARS-s_174-195aa氨基酸序列，所述的SEQ ID NO：18为人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的T、B细胞表位SARS-s_437-459aa的氨基酸序列，所述的SEQ ID NO：21为人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的B细胞表位SARS-s_556-568aa的氨基酸序列，所述的SEQ ID NO：19为人类SARS冠状病毒M蛋白抗原中的T、B细胞表位SARS-m_1-20aa的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的载体为pVAON33骨架质粒，所述的pVAON33骨架质粒是由pVAX1质粒改建获得，将人工合成的依次编码HindIII、Kozak序列、BglII、BamHI和EcoRI的SEQ ID NO：17所示的序列，经HindIII，EcoRI双酶切后接入pVAX1质粒获得。

3.根据权利要求1所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的抗原表位之间通过三氨基酸表位连接序列AAY进行连接。

4.根据权利要求1所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的疫苗中的多表位串联的靶抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。

5.根据权利要求1所述的基于表位的SARS-Cov疫苗，其特征在于，所述的疫苗中的多表位串联的靶抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示。

6.权利要求2所述的一种基于表位的SARS-Cov疫苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

a)运用软件和数据库预测的方法，选取人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的B细胞表位SARS-s_174-195aa、人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的T、B细胞表位SARS-s_437-459aa、人类SARS冠状病毒膜外S蛋白抗原中的B细胞表位SARS-s_556-568aa、人类SARS冠状病毒M蛋白抗原中的T、B细胞表位SARS-m_1-20aa作为靶表位，通过连接序列依次串联构建成多表位的SARS-Cov基因疫苗，并对所选序列按照哺乳动物密码子偏好进行优化，设计出目的基因；

7.根据权利要求6所述的基于表位的SARS-Cov疫苗的制备方法，其特征在于，所述的基于表位的SARS-Cov疫苗成品浓度为1-3μg/μl。

8.权利要求1或2所述的基于表位的SARS-Cov基因疫苗在制备预防和治疗SARS的药物中的应用。