CN111433362A - 用于治疗眼纤维化的miR29模拟物 - Google Patents
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Abstract
本文中提供了miR‑29的双链、经化学修饰的寡核苷酸模拟物，其用于治疗与眼纤维化相关的眼疾病或病症和眼纤维化状况。
Description
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年7月6日提交的美国临时专利申请No.62/694,936和于2017年11月30日提交的美国临时专利申请No.62/593,198的权益，两者在此通过引用完整并入。
发明背景
微小RNA(miRNA)作为治疗干预点具有的几个优点在于它们是小的并且包含已知序列。由于单个miRNA可以调节生物途径内的许多靶mRNA，miRNA的调控可以允许影响整个基因网络并修饰复杂的疾病表型(van Rooij和Olson，2012)。
眼稳态取决于正常血管***和胞外基质的存在。若此类稳态受到例如感染、炎症或代谢性疾病的干扰，则视觉功能被损害。这些状况的最终结果通常是纤维化。由纤维化引起的眼中高度有序的组织结构的破坏可导致视轴的机械破坏和/或生物学故障(Friedlander M.,Journal of Clinical Investigation.2007；117(3):576-586)。
对于能够有效治疗眼纤维化状况的干预存在未被满足的医学需求。本文中提供了解决此需求的方法和组合物。
发明概述
本文中提供了用于治疗眼纤维化状况的双链RNA miR-29模拟化合物(模拟物)。
在第一方面，本公开内容提供了在受试者中治疗眼纤维化的方法，该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的miR-29模拟化合物，其中所述miR-29模拟化合物包含23至26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列；和22至23个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端。在一些实施方案中，眼纤维化包括视网膜纤维化，角膜纤维化，结膜纤维化或小梁网纤维化。
在一些实施方案中，眼纤维化源自选自下组的眼疾病或病症：糖尿病性视网膜病变、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、变形虫感染、眼外伤、化学性角膜烧伤、热性角膜烧伤、翼状胬肉、青光眼、手术创伤、富克斯内皮角膜营养不良(Fuch’s EndothelialCorneal Dystrophy，FECD)和前增殖性玻璃体视网膜病变(前PVR)。
在第二方面，本公开内容提供了治疗受试者中的眼疾病或病症的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的miR-29模拟化合物，其中所述miR-29模拟化合物包括：23至26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列；和22至23个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端。在一些实施方案中，眼疾病或病症选自下组：糖尿病性视网膜病变、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、变形虫感染、眼外伤、化学性角膜烧伤、热性角膜烧伤、翼状胬肉、青光眼、手术创伤、富克斯内皮角膜营养不良(FECD)和前增殖性玻璃体视网膜病变(前PVR)。
在一些实施方案中，眼疾病或病症包含选自下组的眼纤维化：视网膜纤维化、角膜纤维化、结膜纤维化或小梁网纤维化。
在一些实施方案中，经由离子电渗疗法(iontophoresis)、结膜下注射、对翼状胬肉的注射、小梁泡部位处的注射、腱下注射、玻璃体内注射、前房内或局部施用所述miR-29模拟化合物。
在一些实施方案中，眼纤维化包括增殖性玻璃体视网膜病变。
在一些实施方案中，眼纤维化包括与糖尿病性视网膜病变相关的视网膜纤维化。
在一些实施方案中，眼纤维化包括与抗VEGF治疗相关的视网膜纤维化。
在一些实施方案中，眼纤维化包括角膜混浊或角膜瘢痕形成。
在一些实施方案中，眼纤维化源自角膜烧伤。
在一些实施方案中，眼纤维化源自翼状胬肉。
在一些实施方案中，眼纤维化源自富克斯内皮角膜营养不良(FECD)。
在一些实施方案中，眼纤维化源自青光眼。
在一些实施方式中，眼纤维化包括小梁泡。
在一些实施方案中，将所述miR-29模拟化合物局部施用到角膜中。
在一些实施方案中，在液滴配制剂中将所述miR-29模拟化合物局部施用到角膜中。
在一些实施方案中，每天一次、每天两次、每天三次或每天四次将所述miR-29模拟化合物局部施用到角膜中。
在一些实施方案中，定期将所述miR-29模拟化合物局部施用长达一周、两周、三周、四周或28天。
在一些实施方案中，在液滴配制剂中施用所述miR-29模拟化合物。
在一些实施方案中，每周一次经由玻璃体内注射施用所述miR-29模拟化合物。
在一些实施方式中，定期经由玻璃体内注射将所述miR-29模拟化合物施用一个月。
在一些实施方案中，所述miR-29模拟化合物如表2中所示。
在一些实施方案中，COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL4A3、COL5A2、COL11A1、FN1、MMP2、CTGF、TGFB2和/或TGFB3的表达降低。
在一些实施方案中，所述第一链包含选自SEQ ID NO:2、18-21或31-34的序列，并且所述第二链包含选自1、8-10、13-17或28-30的序列。
在一些实施方案中，miR-29模拟化合物包含：包含成熟miR-29b序列的约23至约26个核糖核苷酸的第一链，其中所述第一链包含选自SEQ ID NO:2、18-21和31-34的序列；和约22至约25个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端。
在一些实施方案中，miR-29模拟化合物包含：包含成熟miR-29b序列的约23至约26个核糖核苷酸的第一链；和约22至约25个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端，并且其中所述第二链包含选自SEQ ID NO:1、8-10、13-17和28-30的序列。
在一些实施方案中，第一链包含SEQ ID NO:19的序列，并且所述第二链包含SEQID NO:1的序列。
在一些实施方案中，第一链包含SEQ ID NO:19的序列，并且所述第二链包含SEQID NO:15的序列。
在一些实施方案中，第一链包含成熟miR-29a序列。
在一些实施方案中，所述miR-29模拟化合物如表1中所示。
在一些实施方案中，第一链包含SEQ ID NO:6、7或27的序列，并且第二链包含选自SEQ ID NO:3-5或11的序列。
在一些实施方案中，第一链包含成熟miR-29c序列。
在一些实施方案中，所述miR-29模拟化合物如表3中所示。
在一些实施方案中，第一链包含SEQ ID NO:25、26或35的序列，并且第二链包含选自SEQ ID NO:22-24或12的序列。
在一些实施方案中，药物组合物中包含治疗有效量的miR-29模拟化合物。
在一些实施方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，所述受试者患有糖尿病。
在一些实施方案中，所述受试者患有糖尿病性视网膜病变。
在一些实施方案中，所述受试者患有年龄相关的性黄斑变性(AMD)。
在一些实施方案中，所述受试者患有湿性与年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)。
在一些实施方案中，受试者正在接受抗VEGF疗法。
附图简述
图1A显示了通过施用NaOH创建的角膜烧伤，并且图1B显示了将本公开内容的示例性miR-29b模拟物摄取到眼中。图1C显示了DAPI核染色。
图2A和图2B显示了本公开内容的示例性miR-29b模拟物在眼中的生物分布和药代动力学(PK)。
图3A、图3B、图3C和图3D显示了本公开内容的示例性miR-29b模拟物跨时间点在角膜烧伤后体内降低靶基因表达。
图4A和图4B显示了miR-29b模拟物施用对角膜损伤后第4天和第14天之间收获的角膜的组织病理学的影响。
图5A和图5B显示了miR-29b模拟物施用对角膜损伤后α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响。
图6A和图6B显示了miR-29b模拟物施用对角膜瘢痕形成和混浊(hazing)的影响。
图7A、图7B、图7C和图7D显示了本公开内容的示例性miR-29b模拟物摄取到眼中。
图8A和图8B显示了本公开内容的示例性miR-29b模拟物在眼中的生物分布和药代动力学(PK)。
图9A显示了本公开内容的示例性miR-29b模拟物在增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)中体内降低靶基因表达。图9B显示了本公开内容的示例性miR-29b模拟物在糖尿病性视网膜病变中体内降低靶基因表达。
图10A、图10B和图10C显示了示例性miR-29b模拟物在诱导的多潜能衍生的视网膜色素上皮(iPS-RPE)和原代人视网膜色素上皮(hRPE)细胞中在体外对靶基因表达的影响。
发明详述
本文中提供了用于治疗眼纤维化状况，例如视网膜纤维化、角膜纤维化、结膜纤维化或小梁网纤维化的双链RNA miR-29模拟化合物(模拟物)。
微小RNA模拟化合物
根据本公开内容的微小RNA模拟化合物包含第一链和第二链，其中第一链包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列，并且第二链包含与第一链基本上互补并且具有至少一个经修饰的核苷酸的序列。贯穿公开内容，术语“微小RNA模拟化合物”可以与术语“promiR-29”、“miR-29激动剂”、“微小RNA激动剂”、“微小RNA模拟物”、“miRNA模拟物”或“miR-29模拟物”可互换使用，术语“第一链”可以与术语“反义链”或“引导链”可互换使用；并且术语“第二链”可以与术语“有义链”或“乘客链”可互换使用。
在一些实施方案中，微小RNA模拟化合物的第一链包含约23至约26个核苷酸，其包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c的序列，并且第二链包含约22至约23个核苷酸，其包含与第一链部分、基本上或完全互补的序列。在多个实施方案中，第一链可包含约23、24、25或26个核苷酸，并且第二链可包含约22或23个核苷酸。
形成微小RNA模拟化合物的第一和第二链的核苷酸可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸及其组合。在某些实施方案中，微小RNA模拟化合物的第一链和第二链包含核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸。术语“经修饰的核苷酸”是指核苷酸碱基和/或糖部分相对于未修饰的核苷酸被修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，微小RNA模拟化合物具有第一链或反义链，其序列与成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列的全部或部分相同，以及第二链或有义链，其序列与第一链的序列是约70％至约100％互补的。在一些实施方案中，miRNA模拟化合物的第一链与成熟的天然存在的miR-29a、miR-29b或miR-29c序列的整个序列至少约75、80、85、90、95或100％相同，包括其间的所有整数。在某些实施方案中，第一链与成熟的天然存在的miRNA的序列，例如小鼠、人或大鼠的miR-29a、miR-29b或miR-29c序列约或至少约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％相同。或者，如通过本领域中公知的序列比对算法和方法比较，第一链可包含与成熟的天然存在的miRNA共有的20、21、22或23个核苷酸位置。
应理解，即使第一链包含经修饰的核苷酸替换天然存在的核苷酸，认为第一链的序列与成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c的序列相同。例如，若成熟的天然存在的miRNA序列在特定位置处包含胞苷核苷酸，则模拟化合物的第一链可在相应位置处包含经修饰的胞苷核苷酸，例如2'-氟胞苷，或者若成熟的天然存在的miRNA序列在特定位置处包含尿苷核苷酸，则模拟化合物第一链的miRNA区域可以在相应位置处包含经修饰的尿苷核苷酸，例如2'-氟尿苷、2'-O-甲基-尿苷、5-氟尿嘧啶或4-硫尿嘧啶。因此，只要经修饰的核苷酸具有与成熟的天然存在的miRNA序列中存在的核苷酸相同的碱基配对能力，则认为第一链的序列与成熟的天然存在的miRNA序列相同。在一些实施方案中，第一链可包含5'-末端残基的修饰。例如，第一链可具有5'末端的单磷酸酯。在一些其他实施方案中，第一链不含5'-末端单磷酸酯。
在一些实施方案中，微小RNA模拟物的第二链与第一链的序列部分互补。例如，第二链的序列与第一链的序列是至少约70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％(包括其间的所有值)互补的。在一些其他实施方案中，第二链与第一链的序列基本上互补。例如，第二链与第一链的序列是至少约85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％(包括其间的所有值)互补的。在又一些其他实施方案中，第二链的序列可以与第一链完全互补。在某些实施方案中，第二链的互补区的约19、20、21、22或23个核苷酸可以与第一链互补。
应当理解，即使第二链包含经修饰的核苷酸替换天然存在的核苷酸，认为第二链的序列与第一链互补。例如，若第一链序列在特定位置处包含鸟苷核苷酸，则第二链可在相应位置处包含经修饰的胞苷核苷酸，例如2’-O-甲基胞苷。
在一些实施方案中，第二链相对于第一链包含约1、2、3、4、5或6个错配。也就是说，第一链和第二链之间的多达1、2、3、4、5或6个核苷酸可以不互补。在一些实施方案中，错配不是连续的，并且分布在整个第二链中。在另一个实施方案中，错配是连续的并且可以创建凸出(bulge)。在一些实施方案中，第二链相对于第一链包含3个错配。在某些实施方案中，miR-29a模拟物或miR-29c模拟物的第二链相对于第一链在从(第二链的)3'末端起的位置4、13和/或16处含有错配。在一些实施方案中，miR-29b模拟物的第二链相对于第一链在(第二链的)3'末端起的位置4、13和/或16处含有错配。在另一个实施方案中，miR-29b模拟物的第二链相对于第一链在(第二链的)3'末端起的位置4、9、10、11、13和/或16处含有错配。
在一些实施方案中，模拟化合物的第一和/或第二链可以在链的5'或3'末端上包含突出端。在某些实施方案中，第一链包含3’突出端，即相对于第二链延伸超过双链体区域的单链区域。第一链的3'突出端的范围可以为约1个核苷酸至约4个核苷酸。在某些实施方案中，第一链的3'突出端可包含1或2个核苷酸。在一些实施方案中，第一链中包含3'突出端的核苷酸通过硫代磷酸酯键连接。在第一链中包含3'突出端的核苷酸可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或它们的组合。在某些实施方案中，第一链中的3'突出端包含两个核糖核苷酸。在一些实施方案中，第一链的3'突出端包含通过硫代磷酸酯键连接的两个尿苷核苷酸。在一些实施方案中，第一链可以不包含突出端。
在一些实施方案中，除了通过硫代磷酸酯键彼此连接的3'端的最后三个核苷酸外，本公开内容的miR-29模拟物的第二/有义链中的核苷酸通过磷酸二酯键连接，并且第一/反义链中的核苷酸通过磷酸二酯键连接。
在各个实施方案中，本公开内容的miR-29模拟物包含经修饰的核苷酸。例如，在一些实施方案中，模拟物的第一链包含一个或多个2'-氟核苷酸。在另一个实施方案中，第一链可以不包含任何经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，第二链包含一个或多个2'-O-甲基修饰的核苷酸。
在多个实施方案中，根据本公开内容的miR-29模拟物包含下表中列出的第一链和第二链。在表4中呈现修饰的描述。这些miR-29模拟物先前已在国际公开文本WO/2016/040373中描述；因此，本申请通过引用在本文中整体并入2016年3月17日公布的Montgomery等人的国际公开文本WO/2016/040373。
表1：miR-29a模拟物
表2:miR-29b模拟物
表3:miR-29c模拟物
表4:缩写
在某些实施方案中，miR-29a模拟物含有包含SEQ ID NO:27的第一链和包含SEQID NO:5的第二链。在其他实施方案中，miR-29a模拟物含有包含SEQ ID NO:7的第一链和包含SEQ ID NO:5的第二链。
在一些实施方案中，miR-29b模拟物含有包含SEQ ID NO:19的第一链和包含SEQID NO:1的第二链。在一些其他实施方案中，miR-29b模拟物含有包含SEQ ID NO:2的第一链和包含SEQ ID NO:1的第二链。在另外一些实施方案中，miR-29b模拟物含有包含SEQ IDNO:19的第一链和含有SEQ ID NO:15的第二链。在又一些其他实施方案中，miR-29b模拟物含有包含SEQ ID NO:33的第一链和包含SEQ ID NO:1的第二链。在又一些其他实施方案中，miR-29b模拟物含有包含SEQ ID NO:34和包含SEQ ID NO:1的第二链。在又一些其他实施方案中，miR-29b模拟物含有包含SEQ ID NO:19的第一链和包含SEQ ID NO:30的第二链。
在某些实施方案中，miR-29c模拟物含有包含SEQ ID NO:35的第一链和包含SEQID NO:24的第二链。在其他实施方案中，miR-29c模拟物含有包含SEQ ID NO:26的第一链和包含SEQ ID NO:24的第二链。
在某些实施方案中，miR-29模拟化合物包含：
(a)23至26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟miR-29a，miR-29b或miR-29c序列；和
(b)22至23个核糖核苷酸的第二链，其包含与第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中第一链相对于第二链具有3'核苷酸突出端。
在某些实施方案中，miR-29模拟化合物包含：
(c)包含成熟miR-29b序列的约23至约26个核糖核苷酸的第一链，其中所述第一链包含选自SEQ ID NO:2、18-21和31-34的序列；和
(d)约22至约25个核糖核苷酸的第二链，其包含与第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中第一链相对于第二链具有3’核苷酸突出端。
在某些实施方案中，miR-29模拟化合物包含：
(a)包含成熟miR-29b序列的约23至约26个核糖核苷酸的第一链；和
(b)约22至约25个核糖核苷酸的第二链，其包含与第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中第一链相对于第二链具有3'核苷酸突出端，并且其中第二链包含选自SEQ ID NO:1、8-10、13-17和28-30的序列。
可用于本公开内容的微小RNA模拟化合物的经修饰的核苷酸可包括具有碱基修饰或取代的核苷酸。在RNA中的天然的或未修饰的碱基是嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(C)和尿嘧啶(U)(DNA具有胸腺嘧啶(T))。相比之下，经修饰的碱基也称为杂环碱基部分，包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(包括5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
在一些实施方案中，微小RNA模拟化合物可以具有带有经修饰的糖部分的核苷酸。代表性的经修饰的糖包括碳环或非环糖，在其2’、3’或4’位置的一处或多处具有取代基基团的糖以及具有替换糖中的一个或多个氢原子的取代基的糖。在某些实施方案中，通过在2’位置具有取代基基团对糖进行修饰。在另外的实施方案中，通过在3’位置处具有取代基基团对糖进行修饰。在其他实施方案中，通过在4’位置具有取代基基团对糖进行修饰。也涵盖的是糖可以在那些位置的超过一处具有修饰，或者RNA分子可以具有在一个位置处具有糖修饰的一个或多个核苷酸和还有在不同位置处具有糖修饰的一个或多个核苷酸。
在miRNA模拟化合物中涵盖的糖修饰包括但不限于选自以下的取代基基团：OH；F；O-，S-或N-烷基；O-，S-或N-烯基；O-，S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。
在一些实施方案中，miRNA模拟化合物具有选自下组的糖取代基基团：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基或类似取代基。在一些实施方案中，修饰包括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，其也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)，即烷氧基烷氧基基团。另一种修饰包括2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2’-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-DMAEOE)，即2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
2’位置(2’-)上的糖取代基基团可以在***糖基(arabino)(上)位或核糖基(ribo)(下)位中。一个2’-***糖修饰是2’-F。也可以在糖部分上的其它位置处进行其它类似的修饰，特别是在3’末端核苷酸上的糖的3’位置或者在2’-5’连接寡核苷酸和5’末端核苷酸的5’位置中。
在某些实施方案中，糖修饰是2’-O-烷基(例如2’-O-甲基，2’-O-甲氧基乙基)，2’-卤代(例如2’-氟，2’-氯，2’-溴)和4'硫代修饰。例如，在一些实施方案中，miR-29a、miR-29b或miR-29c模拟化合物的第一链包含一个或多个2’氟核苷酸。在另一个实施方案中，模拟化合物的第一链没有经修饰的核苷酸。在又一个实施方案中，miR-29a、miR-29b或miR-29c模拟化合物的第二链包含一个或多个2'-O-甲基修饰的核苷酸。
本公开内容的微小RNA模拟化合物的第一链和第二链也可以包含主链修饰，例如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代或膦酰基羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接(参见例如美国专利No.6,693,187和7,067,641，其通过引用完整并入本文)。例如，在一些实施方案中，第一链中包含3'突出端的核苷酸通过硫代磷酸酯连接来连接。
在一些实施方案中，微小RNA模拟化合物与载体分子如类固醇(胆固醇)、维生素、脂肪酸、碳水化合物或糖苷、肽或其他小分子配体缀合，以利于体内递送和稳定性。优选地，载体分子在其3’或5’端通过接头或间隔物基团连接至微小RNA模拟化合物的第二链。在各个实施方案中，载体分子是胆固醇、胆固醇衍生物、胆酸或胆酸衍生物。也涵盖美国专利No.7,202,227(其全部内容通过引用并入本文)中公开的载体分子的用途。在某些实施方案中，载体分子是胆固醇并且其通过至少6个碳的接头连接至第二链的3’或5’端。在一些实施方案中，载体分子通过6个或9个碳的接头连接至第二链的3’端。在一些实施方案中，接头是可切割的接头。在各个实施方案中，接头包含基本上直链的烃部分。烃部分可以包含从约3至约15个碳原子并且可以通过相对非极性的基团如醚或硫醚连接与胆固醇缀合。在某些实施方案中，烃接头/间隔物包含任选取代的C2至C15饱和的或非饱和的烃链(例如亚烷基或亚烯基)。可以将在美国授权前公开号2012/0128761(其全部内容通过引用并入本文)中描述的多种接头/间隔物基团用于本公开内容中。
使用方法
在各个实施方案中，本公开内容提供了在有此需要的受试者中治疗、改善或预防眼纤维化状况的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的本文所述的miR-29a、miR-29b和/或miR-29c模拟物中的至少一种。在美国专利No.8,440,636(其在此通过引用完整并入本文)中描述了miR-29激动剂在治疗某些非眼纤维化状况中的用途。
可以使用本公开内容的miR-29模拟物治疗的眼纤维化状况包括但不限于视网膜纤维化、角膜纤维化、结膜纤维化或小梁网纤维化。在一些实施方案中，眼纤维化包括增殖性玻璃体视网膜病变。在一些实施方案中，眼纤维化包括与糖尿病性视网膜病变相关的视网膜纤维化。在一些实施方案中，眼纤维化包括与抗VEGF治疗相关的视网膜纤维化。在一些实施方案中，眼纤维化包括角膜混浊或角膜瘢痕形成，例如在光性屈光性角膜切削术(PRK)或创伤后。在一些实施方案中，眼纤维化源自PRK。在一些实施方案中，眼纤维化源自创伤。在一些实施方案中，眼纤维化源自感染。在一些实施方案中，眼纤维化源自细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染或变形虫感染。在一些实施方案中，眼纤维化源自角膜移植。在一些实施方案中，眼纤维化包括角膜烧伤。在一些实施方案中，角膜烧伤包括热角膜烧伤。在一些实施方案中，角膜烧伤包括化学角膜烧伤。在一些实施方案中，眼纤维化包括翼状胬肉。在一些实施方案中，眼纤维化包括青光眼。在一些实施方案中，眼纤维化是手术创建的泡的纤维化，其可导致泡失败(防止手术创建的小梁泡的部位处的纤维化以防止其密封关闭)并导致青光眼的复发(本文中指作为小梁泡)。在一些实施方案中，眼纤维化包括富克斯内皮角膜营养不良(FECD)。在一些实施方案中，眼纤维化包括前增殖性玻璃体视网膜病变(前PVR)。
在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗受试者中的眼疾病或病症的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的miR-29模拟化合物，其中miR-29模拟化合物包含23至26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列；和22至23个核糖核苷酸的第二链，其包含与第一条链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中第一链相对于第二链具有3'核苷酸突出端，其中眼疾病或病症选自下组：糖尿病性视网膜病变、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、变形虫感染、眼外伤、化学角膜烧伤、热角膜烧伤、翼状胬肉、青光眼、手术创伤、富克斯内皮角膜营养不良(FECD)和前增殖性玻璃体视网膜病变(前PVR)。在一些实施方案中，眼疾病或病症包括选自下组的眼纤维化：视网膜纤维化、角膜纤维化、结膜纤维化或小梁网纤维化。
在一些实施方案中，本公开内容的miR-29模拟物的施用降低受试者细胞中一种或多种胞外基质基因的表达或活性。在另一个实施方案中，本公开内容的miR-29模拟物的施用降低受试者细胞中一个或多个胶原合成基因的表达或活性。在另一个实施方案中，miR-29模拟物的施用上调涉及皮肤发育，角膜发育、表皮发育、外胚层发育、成肌纤维细胞活化和细胞稳态的一个或多个基因的表达或活性。多种基因的表达或活性受本公开内容的miR-29模拟物调节的受试者的细胞包括成纤维细胞、角膜细胞、表皮、上皮和内皮细胞。在一些实施方案中，miR-29模拟物的施用降低COL1A1,COL1A2,COL3A1,COL4A3,COL5A2,COL11A1,FN1,MMP2,CTGF,TGFB2,和/或TGFB3的表达。在一些实施方案中，miR-29模拟物的施用下调与纤维化相关的炎症应答。在一些实施方案中，miR-29模拟物的施用降低纤维化患者中促炎细胞因子如IL-12，IL-4，GCSF和TNF-α的水平。在一些实施方案中，miR-29模拟物的施用降低纤维化组织或器官中免疫效应细胞如嗜中性粒细胞，淋巴细胞，单核细胞和巨噬细胞的浸润。在一些实施方案中，miR-29模拟物的施用降低或抑制上皮至间充质转化。在一些实施方案中，miR-29模拟物的施用降低或抑制成肌纤维细胞分化。
在某些实施方案中，本公开内容提供了调节眼细胞中胞外基质基因的方法，其包括使细胞与本公开内容的miR-29模拟物接触。在一些实施方案中，本公开内容提供调节眼细胞中的胶原合成基因的方法，包括使眼细胞与本公开内容的miR-29模拟物接触。在治疗或接触后，miR-29模拟物降低胞外基质基因或胶原合成基因的表达或活性。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指任何脊椎动物，包括但不限于人和其他灵长类(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种)、农场动物(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如狗和猫)、实验动物(例如兔、啮齿类，例如小鼠、大鼠和豚鼠)和禽类(例如家禽、野生禽和猎禽，例如鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽类、鸭、鹅等)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，受试者是人。
在一些实施方案中，受试者患有糖尿病。在一些实施方案中，受试者患有糖尿病性视网膜病变。在一些实施方案中，受试者患有年龄相关的黄斑变性(AMD)。在一些实施方案中，受试者患有湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)。在一些实施方案中，正在用引起视网膜纤维化的抗VEGF疗法治疗受试者的糖尿病性视网膜病变。在一些实施方案中，本公开内容提供了在有此需要的受试者中治疗糖尿病性视网膜病变和/或与用于糖尿病性视网膜病变的治疗相关的视网膜纤维化的方法，所述方法包括对受试者施用本公开内容的miR-29模拟物。在一些实施方案中，本公开内容提供了在有需要的受试者中治疗糖尿病性视网膜病变的方法，该方法包括对受试者施用本公开内容的miR-29模拟物，还同时、序贯或间歇对受试者施用抗VEGF疗法。在一些实施方案中，通过玻璃体内注射共施用miR-29模拟物和抗VEGF疗法。用抗VEGF疗法治疗糖尿病性视网膜病变可以需要重复注射抗VEGF疗法。本发明的miR-29模拟物与抗VEGF疗法的共施用可抑制、减轻或预防由于单次或重复注射抗VEGF疗法而对眼的损害(包括但不限于眼纤维化)。在一些实施方案中，本公开内容的miR-29模拟物与其他眼治疗剂共施用。本发明的miR-29模拟物与眼用治疗剂的共施用可抑制、减轻或预防由于单次或重复注射眼治疗剂而对眼的损害(包括但不限于眼纤维化)。本公开内容的示例性抗VEGF治疗包括但不限于抗-VEGF抗血清、可溶性VEGF受体、抗VEGF适体、VEGFR1中和抗血清、抗VEGF多克隆抗体、抗VEGF单克隆抗体和抗VEGF双特异性或多特异性抗体。其他示例性抗VEGF治疗包括但不限于贝伐单抗(Avastin)，其可与氟尿嘧啶和亚叶酸钙组合；兰尼单抗(ranibizumab)(Lucentis)、阿帕西普(aflibercept)、ziv-aflibercept或brolucizumab。
在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗、预防、降低或减少用抗体、小分子药物、生物药物、适体或病毒(例如，病毒载体)治疗眼继发的眼纤维化的方法。在一些实施方案中，本公开内容提供了进行眼手术的方法，其包括在眼手术之前、期间或之后施用miR-29模拟物。在一些实施方案中，眼手术包括激光眼手术(例如LASIK)。在一些实施方案中，眼手术包括屈光手术，用于矫正近视、远视和散光。在一些实施方案中，眼手术包括光性屈光性角膜切削术(PRK)。在一些实施方案中，眼手术包括视网膜脱离修复。本公开内容的miR-29模拟物的施用降低眼手术的副作用，包括但不限于高阶像差(higher-order aberration)、干眼、晕圈(halos)、弥漫性层状角膜炎(diffuse lamellar keratitis)、角膜瘢痕形成、上皮向内生长、脉络膜新生血管形成、葡萄膜炎和眼漂浮物(eye floaters)。在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗眼损伤的方法，其包括在眼损伤的1、2、5、10或24小时施用miR-29模拟物。在一些实施方案中，眼损伤是创伤性或偶然性眼损伤。
本公开内容还提供了用于评估用miR-29激动剂(例如，药物或miR-29模拟物)治疗眼纤维化的功效的方法。例如，在一些实施方案中，用于评估治疗功效的方法包括在用miR-29模拟物治疗之前确定受试者的眼细胞中一种或多种基因的表达水平，其中从由miR-29调控的一组基因中选择一种或多种基因，确定用miR-29模拟物治疗后受试者的细胞/纤维化组织中相同的一个或多个基因的表达水平；并根据治疗之前和之后的表达水平确定治疗有效，不太有效或无效。在另一个实施方案中，在治疗之前和之后，基因表达的至少1倍，1.5倍，2倍，2.5倍，3倍，3.5倍或4倍的差异指示治疗为有效的。
药物组合物
本公开内容还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的根据本公开内容的miR-29a、miR-29b和/或miR-29c的一种或多种微小RNA模拟化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29a模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中模拟化合物的第一链包含成熟miR-29a序列，并且第二链与第一链基本上互补。在另一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29b模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中模拟化合物的第一链包含成熟miR-29b序列，并且第二链与第一链基本上互补。在又一个实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29c模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂，其中所述模拟化合物的第一链包含成熟miR-29c序列，并且第二链与第一链基本上互补。
在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的至少两种本公开内容的微小RNA模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。例如，药物组合物可以包含miR-29a和miR-29b模拟物的组合；miR-29a和miR-29c模拟物；或miR-29b和miR-29c模拟物。或者，组合物可以包含同一微小RNA的两个模拟物。在又一些其他实施方案中，本公开内容提供了药物组合物，其包含治疗有效量的三种本公开内容的微小RNA模拟化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。例如，药物组合物可以包含miR-29a、miR-29b和miR-29c模拟物的组合。
在药物组合物包含至少两种根据本公开内容的微小RNA模拟化合物的一些实施方案中，第一和第二模拟化合物或第一、第二和第三模拟化合物可以以等摩尔浓度存在。也涵盖其他混合比率，例如约1:2,1:3,1:4,1:5,1:2:1,1:3:1,1:4:1,1:2:3,1:2:4，用于制备包含miR-29a，miR-29b和miR-29c模拟化合物中的至少两种的药物组合物。
本公开内容的活性化合物和组合物可以包括经典的药物制剂。根据本公开内容的这些组合物的施用可以通过任何常见的路径进行，只要靶组织通过此路径可用。
在本公开内容的另一个实施方案中，可以将包含如本文所述的miR-29模拟物的组合物配制成用于医疗装置，例如隐形眼镜、海绵或其他材料的涂层材料。
可通过将适当量的活性化合物根据需要与任何其他成分(例如上述列举的)一起掺入溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基本分散介质和期望的其他成分，例如以上列举的。
本公开内容的组合物通常可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括例如源自无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸，扁桃酸等)的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)。与蛋白质的游离羧基形成的盐也可以源自无机碱(例如，氢氧化钠、钾、铵、钙或铁)或有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。
在配制后，溶液优选以与剂量配制剂相容的方式和以治疗有效的量施用。配制剂可以容易地以多种剂量形式施用，例如可注射溶液、局部溶液、药物洗脱装置或其他包被的血管装置等。在具体的实施方案中，将miR-29模拟化合物配制用于通过离子电渗疗法、结膜下注射、对翼状胬肉的注射、小梁泡部位处的注射、腱下注射、玻璃体内注射、前房内(intracamerally)或局部施用。
胶体分散***，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的***，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体和外来体可以用作miR-29a、miR-29b和/或miR-29c模拟化合物的递送载体。在一些实施方案中，本公开内容的miR-29模拟物可以配制成脂质体颗粒。
适用于将本公开内容的核酸递送到靶组织的商品化脂肪乳剂包括
II,
III,Nutrilipid和其他类似的脂质乳剂。用作体内递送载体的优选的胶体***是脂质体(即，人工膜囊泡)。此类***的制备和使用在本领域中是公知的。示例性配制剂也公开于US 5,981,505；US 6,217,900；US 6,383,512；US 5,783,565；US 7,202,227；US 6,379,965；US 6,127,170；US 5,837,533；US 6,747,014；和WO03/093449，其通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，用于递送的脂质体是两性脂质体，例如
(Marina Biotech,Inc.)，其在美国授权前公开文本No.20110076322中详细描述。
上的表面电荷是完全可逆的，这使它们特别适合于核酸的递送。
可以通过注射递送，保持稳定，并且无聚集体和跨细胞膜以递送核酸。
在一些实施方案中，本公开内容的微小RNA模拟化合物或药物组合物配制用于眼递送，并且可以呈粉末、水溶液或滴眼剂的形式。固体配制剂可含有赋形剂，例如乳糖或葡聚糖。液体配制剂可以是水或油溶液，以气雾剂、滴剂或计量喷雾的形式使用。
在一些实施方案中，配制剂是脂质体配制剂、纳米悬浮配制剂或微悬浮配制剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29a模拟化合物和药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体选自注射用水(WFI)，0.9％(w/v)的氯化钠，5mM磷酸盐缓冲液，10mM磷酸盐缓冲液，25mM磷酸盐缓冲液，50mM磷酸盐缓冲液，85mM磷酸盐缓冲液和100mM磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29a模拟化合物和药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体选自注射用水(WFI)，10mM磷酸盐缓冲液和85mM磷酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29b模拟化合物和药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体选自注射用水(WFI)，0.9％(w/v)氯化钠，5mM磷酸盐缓冲液，10mM磷酸盐缓冲液，25mM磷酸盐缓冲液，50mM磷酸盐缓冲液，85mM磷酸盐缓冲液和100mM磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29b模拟化合物和药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体选自注射用水(WFI)，10mM磷酸盐缓冲液和85mM磷酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29c模拟化合物和药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体选自注射用水(WFI)，0.9％(w/v)的氯化钠，5mM磷酸盐缓冲液，10mM磷酸盐缓冲液，25mM磷酸盐缓冲液，50mM磷酸盐缓冲液，85mM磷酸盐缓冲液和100mM磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的miR-29c模拟化合物和药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体选自注射用水(WFI)，10mM磷酸盐缓冲液和85mM磷酸盐缓冲液。
在一些实施方案中，药物组合物包含0.2mg/mL至200mg/mL的miR-29模拟物。在一些实施方案中，药物组合物包含0.2mg/mL至10mg/mL，10mg/mL至50mg/mL，50mg/mL至90mg/mL或90mg/mL至120mg/mL miR-29模拟物。在一些实施方案中，药物组合物包含0.2mg/mL至1mg/mL，1mg/mL至5mg/mL，5mg/mL至10mg/mL，10mg/mL至20mg/mL，20mg/mL至30mg/mL，30mg/mL至40mg/mL，40mg/mL至50mg/mL，50mg/mL至60mg/mL，60mg/mL至70mg/mL，70mg/mL至90mg/mL，或90mg/mL至120mg/mL的miR-29模拟物。在一些实施方案中，药物组合物包含至少约0.3mg/mL，至少约0.5mg/mL，至少约1mg/mL，至少约2mg/mL，至少约3mg/mL，至少约4mg/mL，至少约5mg/mL，至少约7mg/mL，至少约10mg/mL，至少约20mg/mL，至少约30mg/mL，至少约40mg/mL，或至少约50mg/mL的miR-29模拟物。
在一些实施方案中，药物组合物包含约100mg/mL，约70mg/mL，约35mg/mL，约7mg/mL，约3.5mg/mL，约0.7mg/mL或0.35mg/mL的miR-29模拟物。在一些实施方案中，药物组合物包含约70mg/mL的miR-29模拟物。在一些实施方案中，药物组合物包含约35mg/mL的miR-29模拟物。
在一些实施方案中，药物组合物具有4至9的pH。在一些实施方案中，药物组合物具有约4，约4.5，约5，约5.5，约6，约6.5，约7，约7.5，约8，约8.5或约9的pH。
在一些实施方案中，药物组合物配制为联合疗法。在一些实施方案中，药物组合物包含本公开内容的miR-29模拟物和一种或多种抗VEGF治疗，包括但不限于贝伐单抗(Avastin)、兰尼单抗(Lucentis)、阿帕西普、ziv-aflibercept或brolucizumab中的一种或多种。在一些实施方案中，联合疗法是眼科配制剂。在一些实施方案中，联合疗法配制用于玻璃体内注射。在一些实施方案中，联合疗法进一步包含氟尿嘧啶和亚叶酸钙中的一种或两者。在一些实施方案中，药物组合物包含本公开内容的miR-29模拟物和一种或多种抗VEGF小分子药物，例如PF-00337210。
在一些实施方案中，药物组合物包含本公开内容的miR-29模拟物和一种或多种癌症治疗剂。例如，本公开内容提供了药物组合物，其包含本公开内容的miR-29模拟物和配制的利妥昔单抗。在一些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗或预防眼内淋巴瘤的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物包含抗生素。抗生素可以与抗-VEGF治疗和本公开内容的miR-29模拟物一起作为三药组合提供，用于预防眼内炎或其他感染性眼疾病。在一些实施方案中，本公开内容提供了药物组合物，其包含本公开内容的miR-29模拟物和抗生素、抗真菌剂、抗微生物剂或抗病毒剂中的一种或多种。
在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种本公开内容的miR-29模拟物。在一些实施方案中，药物组合物包含本公开内容的一种或多种miR-29模拟物和一种或多种其他微小RNA或微小RNA模拟物，包括但不限于本文公开的miR-29模拟物以外的miR-29模拟物。
在一些实施方案中，本公开内容提供了药物组合物，用于在将治疗剂注射到眼中之前、期间或之后经历定期施用的糖尿病性视网膜病变、AMD或湿性AMD的治疗的受试者。本公开内容的miR-29模拟物或包含本公开内容的miR-29模拟物的药物组合物可以在医务室或家庭使用的试剂盒中提供，任选地作为滴眼剂，任选地附有使用说明书。
技术人员可期望使用适当的盐和缓冲剂以使递送载体稳定并允许靶眼细胞摄取。本公开内容的水性组合物包含有效量的递送载体，其包含溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中的miR-29模拟物(例如脂质体或其他复合物)。短语“药学上可接受的”或“药理学可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括在配制药物，例如适用于向人施用的药物中使用的可接受的溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、涂层材料、抗细菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中公知的。除非任何常规介质或试剂与本公开内容的活性成分不相容，涵盖其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分也可以掺入组合物中，条件是它们不使组合物的多核苷酸失活。
施用和给药
如本文所提供，施用一种或多种miR-29模拟化合物以治疗眼纤维化。在一些实施方案中，将miR-29模拟化合物直接施用于受试者的眼/眼细胞。在一些实施方案中，周围施用miR-29模拟化合物。在一些实施方案中，经由离子电渗疗法、结膜下注射、对翼状胬肉的注射、小梁泡部位处的注射、腱下注射、玻璃体内注射、前房内或局部施用所述miR-29模拟化合物。
在一些实施方案中，药物组合物包含滴剂、软膏剂或悬浮剂。在一些实施方案中，本公开内容提供了施用miR-29模拟物或包含miR-29模拟物的药物组合物的方法，该方法包括选自以下的施用途径：局部施用，使眼与药物洗脱隐形眼镜接触，结膜下注射，泡内注射，前房内注射，前房内贮库(例如，硅或其他材料的药物包埋的“种子”)，玻璃体内注射，玻璃体内贮库(例如，硅或其他材料的药物包埋的“种子”)，和离子电渗疗法。
在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗角膜纤维化的方法，其包括施用miR-29模拟物或包含miR-29模拟物的药物组合物，包括局部施用或使眼与药物洗脱隐形眼镜接触。在一些实施方案中，药物组合物是滴剂。
在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗翼状胬肉的方法，其包括施用miR-29模拟物或包含miR-29模拟物的药物组合物，包括局部施用或结膜下注射。在一些实施方案中，药物组合物是滴剂。
在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗小梁切除术泡的方法，其包括施用miR-29模拟物或包含miR-29模拟物的药物组合物，包括泡内注射，结膜下注射或局部施用。在一些实施方案中，药物组合物是滴剂。
在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗青光眼的方法，其包括施用miR-29模拟物或包含miR-29模拟物的药物组合物，包括结膜下注射，前房内注射或前房内贮库。在一些实施方案中，前房内贮库包含硅或其他药学上可接受的材料的药物包埋的“种子”。
在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗视网膜纤维化的方法，其包括施用miR-29模拟物或包含miR-29模拟物的药物组合物，包括玻璃体内注射，玻璃体内贮库或离子电渗疗法。在一些实施方案中，玻璃体内贮库包含硅或其他药学上可接受的材料的药物包埋的种子。
在一些实施方案中，本公开内容的一种或多种微小RNA模拟化合物可以同时施用但在分开的组合物中施用，其中同时是指在短时段内，例如在彼此的约5、10、20或30分钟内给予的模拟化合物。在一些其他实施方案中，miR-29a，miR-29b和/或miR-29c模拟化合物可以在不同的时间在分开的组合物中施用。
本公开内容还包括如下的实施方案，其中可以与miR-29a，miR-29b和/或miR-29c模拟化合物一起施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是第二抗纤维化剂。可以同时但在分开的配制剂中或序贯施用另外的治疗剂。在其他实施方案中，可以在施用miR-29a，miR-29b和/或miR-29c模拟化合物之前之后的不同时间施用另外的治疗剂。在考虑临床应用的情况下，药物组合物将以适合于意图应用的形式制备。通常，这可以需要制备基本不含热原以及其他可对人或动物有害的杂质的组合物。
在一些示例性的实施方案中，将miR-29模拟化合物局部施用到角膜中。在一些示例性的实施方案中，将miR-29模拟化合物例如在滴剂配制剂中局部施用到角膜中。在一些实施方案中，将miR-29模拟化合物局部施用到角膜中，例如每天两次，或例如每天四次。在一些实施方案中，将miR-29模拟化合物局部施用到角膜中，例如每天四次。
在一些示例性的实施方案中，将miR-29模拟化合物定期局部施用长达一周。在一些示例性的实施方案中，将miR-29模拟化合物定期局部施用长达四周。在一些示例性的实施方案中，每天两次局部施用miR-29模拟化合物。在一些实施方案中，每天两次将miR-29模拟化合物局部施用长达四周。在一些示例性的实施方案中，将miR-29模拟化合物定期局部施用长达28天。在一些实施方案中，每天两次将miR-29模拟化合物局部施用长达28天。应理解的是，贯穿整个公开内容，术语每天一次，每天两次等是指单侧或双侧施用的频率，即“每天两次”是指一天两次在一只眼中或一天两次在两只眼中，而不是每天一次在两只眼中施用。通常，当期望两只眼的治疗时，双侧施用本公开内容的组合物，并且当期望仅一只眼的治疗时，单侧施用本公开内容的组合物——例如，对于仅左眼的眼损伤治疗，仅将本发明的组合物施用于左眼。
在一些示例性的实施方案中，miR-29模拟化合物在滴剂配制剂中施用。
在一些示例性的实施方案中，miR-29模拟化合物每周一次通过玻璃体内注射施用。
在一些示例性的实施方案中，miR-29模拟化合物通过玻璃体内注射定期施用1个月。
本公开内容进一步提供了通过病毒基因递送来施用miR-29模拟物的载体、药物组合物和方法。在一些实施方案中，病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或腺伴随病毒(AAV)载体。经由AAV载体将miR-29模拟物递送到人体记载于例如Heller等人JCIInsight.2017 May 4；2(9):e93309和国际专利公开文本No.WO2017181011A1，每篇通过引用完整并入本文。如Lebherz等人，J Gene Med.2008 Apr；10(4):375–382中所述，AAV载体可以适合在眼中使用，通过例如使用血清型实现改善的眼基因转移。
本公开内容进一步提供了包含本文所述的治疗性mir-29模拟物和组合物的试剂盒。本公开内容还提供了包含本文所述的任一种治疗组合物或试剂盒的制品。制品的例子包括小瓶(例如密封小瓶)。
列举的实施方案
实施方案1.治疗受试者中的眼纤维化的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的miR-29模拟化合物，其中所述miR-29模拟化合物包含：
(a)23至26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列；和
(b)22至23个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端，
其中所述眼纤维化包括视网膜纤维化、角膜纤维化、结膜纤维化或小梁网纤维化。
实施方案2.实施方案1的方法，其中所述眼纤维化源自选自下组的眼疾病或病症：糖尿病性视网膜病变、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、变形虫感染、眼外伤、化学性角膜烧伤、热性角膜烧伤、翼状胬肉、青光眼、手术创伤、富克斯内皮角膜营养不良(FECD)和前增殖性玻璃体视网膜病变(前PVR)。
实施方案3.治疗受试者中的眼疾病或病症的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的miR-29模拟化合物，其中所述miR-29模拟化合物包括：
(a)23至26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列；和
(b)22至23个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端，
其中所述眼疾病或病症选自下组：糖尿病性视网膜病变、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、变形虫感染、眼外伤、化学性角膜烧伤、热性角膜烧伤、翼状胬肉、青光眼、手术创伤、富克斯内皮角膜营养不良(FECD)和前增殖性玻璃体视网膜病变(前PVR)。
实施方案4.实施方案3的方法，其中所述眼疾病或病症包含选自下组的眼纤维化：视网膜纤维化、角膜纤维化、结膜纤维化或小梁网纤维化。
实施方案5.实施方案1-4中任一项的方法，其中经由离子电渗疗法、结膜下注射、对翼状胬肉的注射、小梁泡部位处的注射、腱下注射、玻璃体内注射、前房内或局部施用所述miR-29模拟化合物。
实施方案6.实施方案1、2或4中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括增殖性玻璃体视网膜病变。
实施方案7.实施方案1、2或4中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括与糖尿病性视网膜病变相关的视网膜纤维化。
实施方案8.实施方案1、2或4中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括与抗VEGF治疗相关的视网膜纤维化。
实施方案9.实施方案1、2或4中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括角膜混浊或角膜瘢痕形成。
实施方案10.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述眼纤维化源自角膜烧伤。
实施方案11.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述眼纤维化源自翼状胬肉。
实施方案12.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述眼纤维化源自富克斯内皮角膜营养不良。
实施方案13.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述眼纤维化源自青光眼。
实施方案14.实施方案1至13中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括小梁泡。
实施方案15.实施方案1至14中任一项的方法，其中将所述miR-29模拟化合物局部施用到角膜中。
实施方案16.实施方案15的方法，其中在液滴配制剂中将所述miR-29模拟化合物局部施用到角膜中。
实施方案17.实施方案15至16中任一项的方法，其中每天一次、每天两次、每天三次或每天四次将所述miR-29模拟化合物局部施用到角膜中。
实施方案18.实施方案15至16中任一项的方法，其中定期将所述miR-29模拟化合物局部施用长达一周、两周、三周、四周或28天。
实施方案19.实施方案1至14中任一项的方法，其中在液滴配制剂中施用所述miR-29模拟化合物。
实施方案20.实施方案1至14中任一项的方法，其中每周一次经由玻璃体内注射施用所述miR-29模拟化合物。
实施方案21.实施方案1至14中任一项的方法，其中定期经由玻璃体内注射将所述miR-29模拟化合物施用一个月。
实施方案23.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物如表2中所示。
实施方案22.实施方案1至21中任一项的方法，其中COL1A1、C实施方案OL1A2、COL3A1、COL4A3、COL5A2、COL11A1、FN1、MMP2、CTGF、TGFB2和/或TGFB3的表达降低。
实施方案24.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含选自SEQ IDNO:2、18-21或31-34的序列，并且所述第二链包含选自1、8-10、13-17或28-30的序列。
实施方案25.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物包含：
(a)包含成熟miR-29b序列的约23至约26个核糖核苷酸的第一链，其中所述第一链包含选自SEQ ID NO:2、18-21和31-34的序列；和
(b)约22至约25个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端。
实施方案26.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物包含：
(a)包含成熟miR-29b序列的约23至约26个核糖核苷酸的第一链；和
(b)约22至约25个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端，并且其中所述第二链包含选自SEQ ID NO:1、8-10、13-17和28-30的序列。
实施方案27.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含SEQ ID NO:19的序列，并且所述第二链包含SEQ ID NO:1的序列。
实施方案28.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含SEQ ID NO:19的序列，并且所述第二链包含SEQ ID NO:15的序列。
实施方案29.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含成熟miR-29a序列。
实施方案30.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物如表1中所示。
实施方案31.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含SEQ ID NO:6、7或27的序列，并且所述第二链包含选自SEQ ID NO:3-5或11的序列。
实施方案32.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含成熟miR-29c序列。
实施方案33.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物如表3中所示。
实施方案34.实施方案1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含SEQ ID NO:25、26或35的序列，并且所述第二链包含选自SEQ ID NO:22-24或12的序列。
实施方案35.实施方案1至34中任一项的方法，其中在药物组合物中包含治疗有效量的所述miR-29模拟化合物。
实施方案36.实施方案1至35中任一项的方法，其中所述受试者是人。
实施方案37.实施方案36的方法，其中所述受试者患有糖尿病。
实施方案38.实施方案36或37的方法，其中所述受试者患有糖尿病性视网膜病变。
实施方案39.实施方案36或37的方法，其中所述受试者患有年龄相关的黄斑变性(AMD)。
实施方案40.实施方案39的方法，其中所述受试者患有湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)。
实施方案41.实施方案1-40中任一项的方法，其中所述受试者正在接受抗VEGF疗法。
通过以下另外的实施例进一步说明本公开内容，所述实施例不应解释为限制性的。根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下仍获得类似或相似的结果。
在本公开内容全文中引用的所有专利和非专利文件通过引用整体并入本文用于所有目的。
实施例
实施例1：在角膜碱烧伤后引入miR-29b模拟物
碱烧伤代表对角膜的损害。它尤其代表由病毒性感染、细菌性感染、真菌性感染、神经营养性角膜炎、无菌性角膜炎(sterile keratitis)、角膜创伤和手术诱导的上皮破坏。已知碱烧伤具有可靠的时间进程，在烧伤后7-14天时胞外基质分子表达上调，在烧伤后10-14天时肉眼和组织学上明显出现角膜混浊和疤痕形成。
方法
碱烧伤：将8-10周龄的雄性Sprague Dawley大鼠用异氟烷麻醉，并且应用0.5％的盐酸丙美卡因(Proparacaine Hydrochloride)眼科溶液用于局部麻醉。通过应用0.5或1NNaOH达10秒，对每只动物一只角膜进行碱烧伤，然后用盐水冲洗。此后每天两次应用抗生素软膏剂，以防止感染。通过烧伤时的荧光素染色和/或烧伤后6小时的组织学检查(苏木精和曙红染色)确认一部分动物中的碱烧伤。
miR-29b模拟物局部施用：将盐水或双链miR-29b模拟物(SEQ ID NO:1/SEQ IDNO:19)在滴剂配制剂(每滴10uL，在无菌盐水中1或70mg/mL miR-29b模拟物)中局部施用于大鼠角膜。每天四次应用液滴达1天，或每天两次达1至28天。通过共聚焦显微术评估异硫氰酸荧光素(FITC)标记的寡聚物的摄取/分布。
miR-29靶表达：使用Trizol(Life Technologies)从用盐水或miR-29b模拟处理处理7、10或14天的碱烧伤的大鼠角膜提取总RNA。在第7、10和14天通过qRT-PCR(来自LifeTechnologies的试剂)评估miR-29靶物和miR-29b模拟物药效生物标志物(COL1A1,COL1A2,COL5A2,COL11A1,MMP2,TGFB2,和/或FN1)的表达。通过从整个组织匀浆的定量RT-PCR随时间评估药代动力学。
组织病理学：将用盐水或miR-29b模拟物处理4、7、10或14天的碱烧伤角膜进行***固定和石蜡包埋。使用从苏木精和曙红染色的切片捕捉的20倍图像评估角膜上皮和基质的厚度(使用Aperio ImageScope软件)，并从用抗α-SMA抗体和比色底物染色与苏木精复染的载玻片上量化α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)阳性的成肌纤维细胞(在ImageJ软件中进行分析)。
临床评估：使用1-5量表，临床评估用盐水或miR-29b模拟物处理10、14、21或28天的碱烧伤角膜的角膜混浊或角膜瘢痕形成，其中1代表正常，透明角膜，并且5表示具有严重的疤痕形成和/或混浊的角膜(1＝缺乏，2＝最小，3＝轻度，4＝中度，5＝严重)。
在多个研究中重复这些方法。
结果
通过施用1N NaOH在每只大鼠的一只眼睛中创建碱灼伤(图1A)。将局部应用的FITC-miR-29b模拟物(1mg/mL)被摄取到碱烧伤的大鼠角膜的所有层中，并且最强烈地染色角膜基质和角膜内皮(图1B)。还显示了相同视图的DAPI核染色(图1C)。
在创建角膜碱烧伤后，通过局部(滴剂)施用每天两次向大鼠施用盐水或miR-29b模拟物(70mg/mL)，持续1至28天。最后液滴应用后6小时收获眼，并通过qRT-PCR定量miR-29b。烧伤后内源性miR-29b水平在很大程度上不变。相反，经miR-29b模拟物处理的眼在miR-29b模拟物处理后显示miR-29b水平的实质性增加，其中最大的摄取在烧伤创建后立即可见(高于内源的1717倍)，并且在重新建立角膜上皮后看到较少摄取(在第7天高于内源水平的14倍)(图2A)。在另一项研究中，评估了其他时间点(图2B)，结果相似(在第10天检测到miR-29b水平高于内源水平的11倍，在第28天检测到高于内源水平的1.7倍)。
在第7天，对于用miR-29b模拟物处理的多个miR-29b靶基因，看到表达降低(p＝0.0831)(图3A)。在分开的研究中，评估了其他时间点和基因(图3B-3D)。这三个图分别显示来自第7、10和14个时间点的数据。
在损伤后第4天和第14天之间收获的角膜的组织病理学显示了，相对于盐水处理的对照烧伤的眼，miR-29b模拟物增加上皮厚度并且降低基质厚度(图4A-4B)。每个图上的虚线表示正常的未烧伤的大鼠角膜的厚度。
在第14天进行α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的免疫组织化学分析，并且与用盐水处理的烧伤眼相比，在用miR-29b模拟物处理的烧伤眼中观察到α-SMA染色减少(图5A)。图5B中将数据作图。
在两项分开的研究中临床评估角膜瘢痕形成和混浊，并且在这两个研究中，发现与盐水处理相比用miR-29b模拟物的处理显著降低碱烧伤眼中角膜瘢痕形成和混浊的程度(图6A和图6B)。
实施例2：miR-29b模拟物的生物分布
方法
大鼠玻璃体内施用：用异氟烷和丙美卡因麻醉大鼠，并将盐水或miR-29b模拟物注射入玻璃体中(在无菌盐水中的5uL，2.5或70mg/mL miR-29b模拟物)。每只眼进行一次玻璃体内注射。
通过qRT-PCR(来自Life Technologies的试剂)评估miR-29靶标和miR-29b模拟物药效生物标志物(COL1A1,COL1A2,COL5A2,COL11A1,MMP2,TGFB2)的表达。通过从整个组织匀浆的定量RT-PCR随时间评估药代动力学。
结果
在玻璃体内注射后FITC-miR-29b模拟物(2.5mg/mL)被摄取到大鼠视网膜的所有层中，包括RPE层(图7A和图7C)。图7B和图7D中显示了相同切片的DAPI核染色。
将盐水或miR-29b模拟物(70mg/mL)玻璃体内注射到未受伤的大鼠眼中。注射应用后1至7天从每只眼解剖视网膜和RPE/巩膜/脉络膜，并通过qRT-PCR定量miR-29b。在miR-29b模拟物处理的眼中以极高水平检测到miR-29b(高于视网膜中内源的13753倍，高于RPE/巩膜/脉络膜中内源的8595倍)，并且持续长达7天时间点(高于视网膜中内源的1727倍，高于RPE/巩膜/脉络膜中内源的1343倍)(图8A和图8B)。
实施例3：在增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)中引入miR-29b模拟物
已知色素沉着的新西兰兔在玻璃体内注射结膜成纤维细胞后具有纤维化反应，并且在不需要创建原发性视网膜脱离的情况下重演人增殖性玻璃体视网膜病变。
方法
用***/赛拉嗪麻醉雄性和雌性色素沉着的新西兰兔(1.64-2.25kg)，并且应用0.5％盐酸丙美卡因眼科溶液进行局部麻醉。每只动物的一只眼对玻璃体注射一次100μL的平衡盐溶液(BSS)中悬浮的约5 x 10^5个兔结膜成纤维细胞。
用***/赛拉嗪和丙美卡因麻醉兔，并将BSS或miR-29b模拟物注射入玻璃体(100uL，BSS中的10mg/mL miR-29b模拟物)。玻璃体内注射每周一次进行1个月。通过共聚焦显微术评估FITC标记的寡聚物的摄取/分布。
miR-29靶标表达：使用Trizol(Life Technologies)从用BSS或miR-29b模拟物(10mg/mL)处理的兔视网膜中提取总RNA。通过qRT-PCR(Life Technologies的试剂)评估miR-29靶标和miR-29b模拟物药效生物标志物(COL1A1,COL1A2,MMP2,TGFB2)的表达。通过从整个组织匀浆的定量RT-PCR随时间评估药代动力学。
结果
通过每周玻璃体内注射向已经接受兔结膜成纤维细胞(RCF)的同种异体移植物(其代表增殖性玻璃体视网膜病变)的兔眼施用miR-29b模拟物(10mg/mL)或BSS。从RCF注射后一个月时和最后一次注射后1周时收获的视网膜中分离总RNA，并通过qRT-PCR定量miR-29b靶基因的表达。miR-29b模拟物显著(p<0.05)抑制多个miR-29b靶基因的表达(图9A)。
实施例4：在糖尿病性视网膜病变中引入miR-29b模拟物
经链脲霉素处理的大鼠代表具有延长的高血糖症的不受控制的1型糖尿病，并且已经显示在糖尿病的约10周后具有视网膜的纤维化变化。它在无需使用大型动物，例如非人灵长类的情况下重演糖尿病性视网膜病变的分子和组织学变化。
方法
糖尿病性视网膜病变：通过经由IP注射施用65mg/kg链脲霉素，在雄性SpragueDawley大鼠(251-315g)中诱导糖尿病。注射后72小时，若大鼠空腹血糖水平>300mg/dL，则确认它们具有糖尿病。对大鼠给予营养支持，包括饮用的0.9％盐水、皮下液体和根据需要以维持动物健康而将血糖水平保持在350-650mg/dL范围内的长效胰岛素。将糖尿病大鼠维持总共11周。
大鼠玻璃体内施用：用异氟烷和丙美卡因麻醉大鼠，并将盐水或miR-29b模拟物注射入玻璃体中(5uL，在无菌盐水中的2.5或70mg/mL miR-29b模拟物)。每周每只眼进行一次玻璃体内注射达三周。
miR-29靶标表达：使用Trizol(Life Technologies)从用BSS或miR-29b模拟物(70mg/mL)处理的大鼠视网膜中提取总RNA。通过qRT-PCR(Life Technologies的试剂)评估miR-29靶标和miR-29b模拟物药效生物标志物(COL1A1,COL1A2,COL3A1,COL4A3,CTGF,MMP2,TGFB2)的表达。通过从整个组织匀浆的定量RT-PCR随时间评估药代动力学。
结果
通过每周玻璃体内注射对从患有持续性高血糖的大鼠(糖尿病性视网膜病变的模型)的眼中施用miR-29b模拟物(70mg/mL)或盐水。从诱导糖尿病后11周和最后一次注射后1周时收获的视网膜中分离总RNA，并通过qRT-PCR定量miR-29b靶基因的表达。miR-29b模拟物显著(p<0.001)抑制该模型中多个miR-29b靶基因的表达(图9B)。
实施例5：miR-29b模拟物在人视网膜色素上皮(RPE)细胞中的转染
方法
体外评估：按照制造商的指示培养人诱导的多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞(iPS-RPE,Cellular Dynamics)和原代人RPE细胞(hRPE，Lonza)。用重组人TGF-β1(TGF-β1,Peprotech)处理RPE细胞和/或使用Dharmafect 1转染试剂用miR-29b模拟物主动转染RPE细胞。在TGF-β1处理或转染后48小时，使用RNeasy试剂盒(Qiagen)或Trizol(LifeTechnologies)分离总RNA，并通过qRT-PCR(来自Life Technologies的试剂)评估miR-29靶基因(COL1A1，COL1A2，COL3A1，FN1)的表达。
结果
添加TGF-β1(0.5-5ng/mL)，并将miR-29b模拟物(0.5-25nM)主动转染到iPS-RPE细胞(图10A和图10B)或hRPE细胞(图10C)中。处理后48小时提取总RNA，并通过qRT-PCR定量miR-29b靶基因的表达。在这两种细胞系中，TGF-β1处理显著上调多个miR-29b靶基因的表达。此外，在存在和不存在TGF-β1处理的情况下，miR-29b模拟物抑制多个miR-29b靶基因的表达。
Claims (41)
1.治疗受试者中的眼纤维化的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的miR-29模拟化合物，其中所述miR-29模拟化合物包含：
(a)23至26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列；和
(b)22至23个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端，
其中所述眼纤维化包括视网膜纤维化、角膜纤维化、结膜纤维化或小梁网纤维化。
2.权利要求1的方法，其中所述眼纤维化源自选自下组的眼疾病或病症：糖尿病性视网膜病变、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、变形虫感染、眼外伤、化学性角膜烧伤、热性角膜烧伤、翼状胬肉、青光眼、手术创伤、富克斯内皮角膜营养不良(FECD)和前增殖性玻璃体视网膜病变(前PVR)。
3.治疗受试者中的眼疾病或病症的方法，其包括对所述受试者施用治疗有效量的miR-29模拟化合物，其中所述miR-29模拟化合物包括：
(a)23至26个核糖核苷酸的第一链，其包含成熟miR-29a、miR-29b或miR-29c序列；和
(b)22至23个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端，
其中所述眼疾病或病症选自下组：糖尿病性视网膜病变、细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、变形虫感染、眼外伤、化学性角膜烧伤、热性角膜烧伤、翼状胬肉、青光眼、手术创伤、富克斯内皮角膜营养不良(FECD)和前增殖性玻璃体视网膜病变(前PVR)。
4.权利要求3的方法，其中所述眼疾病或病症包含选自下组的眼纤维化：视网膜纤维化、角膜纤维化、结膜纤维化或小梁网纤维化。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中经由离子电渗疗法、结膜下注射、对翼状胬肉的注射、小梁泡部位处的注射、腱下注射、玻璃体内注射、前房内或局部施用所述miR-29模拟化合物。
6.权利要求1、2或4中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括增殖性玻璃体视网膜病变。
7.权利要求1、2或4中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括与糖尿病性视网膜病变相关的视网膜纤维化。
8.权利要求1、2或4中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括与抗VEGF治疗相关的视网膜纤维化。
9.权利要求1、2或4中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括角膜混浊或角膜瘢痕形成。
10.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述眼纤维化源自角膜烧伤。
11.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述眼纤维化源自翼状胬肉。
12.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述眼纤维化源自富克斯内皮角膜营养不良。
13.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述眼纤维化源自青光眼。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述眼纤维化包括小梁泡。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中将所述miR-29模拟化合物局部施用到所述角膜中。
16.权利要求15的方法，其中在液滴配制剂中将所述miR-29模拟化合物局部施用到所述角膜中。
17.权利要求15至16中任一项的方法，其中每天一次、每天两次、每天三次或每天四次将所述miR-29模拟化合物局部施用到所述角膜中。
18.权利要求15至16中任一项的方法，其中定期将所述miR-29模拟化合物局部施用长达一周、两周、三周、四周或28天。
19.权利要求1至14中任一项的方法，其中在液滴配制剂中施用所述miR-29模拟化合物。
20.权利要求1至14中任一项的方法，其中每周一次经由玻璃体内注射施用所述miR-29模拟化合物。
21.权利要求1至14中任一项的方法，其中定期经由玻璃体内注射将所述miR-29模拟化合物施用一个月。
22.权利要求1至21中任一项的方法，其中COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL4A3、COL5A2、COL11A1、FN1、MMP2、CTGF、TGFB2和/或TGFB3的表达降低。
23.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物如表2中所示。
24.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含选自SEQ ID NO:2、18-21或31-34的序列，并且所述第二链包含选自1、8-10、13-17或28-30的序列。
25.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物包含：
(a)包含成熟miR-29b序列的约23至约26个核糖核苷酸的第一链，其中所述第一链包含选自SEQ ID NO:2、18-21和31-34的序列；和
(b)约22至约25个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端。
26.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物包含：
(a)包含成熟miR-29b序列的约23至约26个核糖核苷酸的第一链；和
(b)约22至约25个核糖核苷酸的第二链，其包含与所述第一链基本上互补并具有至少一个经修饰的核苷酸的序列，其中所述第一链相对于所述第二链具有3’核苷酸突出端，并且其中所述第二链包含选自SEQ ID NO:1、8-10、13-17和28-30的序列。
27.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含SEQ ID NO:19的序列，并且所述第二链包含SEQ ID NO:1的序列。
28.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含SEQ ID NO:19的序列，并且所述第二链包含SEQ ID NO:15的序列。
29.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含成熟miR-29a序列。
30.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物如表1中所示。
31.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含SEQ ID NO:6、7或27的序列，并且所述第二链包含选自SEQ ID NO:3-5或11的序列。
32.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含成熟miR-29c序列。
33.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述miR-29模拟化合物如表3中所示。
34.权利要求1至22中任一项的方法，其中所述第一链包含SEQ ID NO:25、26或35的序列，并且所述第二链包含选自SEQ ID NO:22-24或12的序列。
35.权利要求1至34中任一项的方法，其中在药物组合物中包含治疗有效量的所述miR-29模拟化合物。
36.权利要求1至35中任一项的方法，其中所述受试者是人。
37.权利要求36的方法，其中所述受试者患有糖尿病。
38.权利要求36或37的方法，其中所述受试者患有糖尿病性视网膜病变。
39.权利要求36或37的方法，其中所述受试者患有年龄相关的黄斑变性(AMD)。
40.权利要求39的方法，其中所述受试者患有湿性年龄相关的黄斑变性(湿性AMD)。
41.权利要求38的方法，其中所述受试者正在接受抗VEGF疗法。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200717 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |