CN111424110A - 一种鉴别皂荚的试剂盒及鉴别和定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别皂荚的试剂盒及鉴别和定量方法。该试剂盒包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对和由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对中的至少一个引物对。上述引物与传统的DNA宏条形码技术所用的引物相比，片段更短，而且变异位点更多、遗传距离更高，可用于皂荚及其混伪品宏条形码鉴别的分子标记。

Description

一种鉴别皂荚的试剂盒及鉴别和定量方法
技术领域
本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别皂荚的试剂盒及鉴别和定量方法。
背景技术
皂角刺为豆科植物皂荚(Gleditsia sinensis Lam.)的干燥棘刺，而山皂荚(Gleditsia japonica Miq.)的棘刺常被误当作正品皂角刺使用，在一定程度上影响了临床用药的安全性。为了提高皂角刺的品质，增强皂角刺质量的可控性以及确保临床用药安全，对皂荚和山皂荚进行鉴别显得尤为重要。
目前中药的传统鉴别方法有基原鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别等，它们在中药鉴别领域发挥了巨大的作用，但这些传统鉴别方法会受到鉴别效率和主观因素等影响，无法完全满足目前中药鉴别的需求。
DNA分子鉴别技术不受材料部位、生长阶段和生长环境等限制，具有鉴别快速准确、重复性高和稳定性好的优点，目前在中药鉴别方面已有广泛的应用。其中，由DNA条形码结合高通量技术而衍生出的DNA宏条形码技术可以用于混合中药样品的鉴别，有望解决目前复杂中药体系定性、定量鉴别困难的问题。目前用于药用植物的DNA条形码有ITS/ITS2，psbA-trnH，matK，trnL和rbcL等。核基因ITS2序列对于相似性较高、种间变异不显著的物种，会出现无法成功鉴别的情况，并且，对于异花授粉植物，ITS2序列的测序因基因重组而受到影响。psbA-trnH序列在物种之间存在***、缺失、长度变异较大甚至倒位的现象，可导致其遗传变异被过度评估。rbcL序列在种水平变异小，更适合科和属水平的鉴别。另外，传统DNA条形码的片段长度通常大于650bp，由于中药材在采收、加工和炮制过程DNA会发生不同程度的降解，故难以利用标准长度的DNA条形码进行扩增，同样限制了此类技术的推广和应用。皂荚和山皂荚在基因组大小、基因数量和基因顺序上高度保守，因此，用传统的DNA宏条形码技术鉴别皂荚和山皂荚可能无法准确鉴别。并且，引物偏好性也会直接影响DNA宏条形码技术鉴别结果的准确性。
发明内容
针对传统的DNA宏条形码技术在皂荚的鉴别中可能无法准确鉴别的技术问题，本发明提供了一种鉴别皂荚的试剂盒。
以及，本发明还提供了一种定量皂荚含量的方法。
以及，本发明还提供了一种定量皂荚含量的方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种鉴别皂荚的试剂盒，包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对和由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对中的至少一个引物对。
SEQ ID NO.1的序列为：5′-CTTCCAAAACGAAGAT-3′；
SEQ ID NO.2的序列为：5′-AGCATTTTCAAATCGA-3′；
SEQ ID NO.3的序列为：5′-CTAGTTTGTCAACTTTTC-3′；
SEQ ID NO.4的序列为：5′-AAATTCCTTATCTAGAGC-3′。
以上两对引物以皂荚叶绿体基因组的ycf1b基因序列为基础，经人工设计后得到。与传统的DNA宏条形码所用的引物相比，上述引物不仅片段更短，而且变异位点更多、遗传距离更高，可作为皂荚及其他植物宏条形码鉴别的分子标记，能够将皂荚与其他植物区分开，且不受采收、加工和炮制过程的影响。同时，该引物特异性还能够对皂荚的常见伪品山皂荚，也可以准确鉴别。使用该试剂盒进行皂荚鉴别，具有特异性好、灵敏度高的优点，能够准确鉴别待测物是否为皂荚。
优选地，所述试剂盒包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对。序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对具有更高的特异性和灵敏性，能够使鉴别结果更准确。
优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和模板DNA，所述PCR缓冲液中含有1mM Mg2+和200μM dNTP。PCR缓冲液、DNA聚合酶均可选择用于PCR扩增的市售试剂，如宝日医生物技术有限公司的GflexTM Buff er、Tks GflexTM DNA Polymerase。
以及，本发明实施例还提供了一种鉴别皂荚的方法，用上述的引物对通过PCR扩增对皂荚进行鉴别。用以上引物扩增得到的片段能够准确检测出待测物种是否为皂荚，从而将DNA宏条形码技术用于皂荚的鉴别。
优选地，该方法的具体操作为：提取待测物的基因组作为模板DNA，用引物进行PCR扩增，扩增完成后对PCR扩增产物测序，得到ASV序列，将所述ASV序列与皂荚叶绿体基因ycf1b序列进行比对，判断结果。序列相似度＞99％即为皂荚。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为：
Figure BDA0002515918490000031
扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，55℃，15s，30个循环；68℃，30s；68℃，5min。
以及，本发明实施例还提供了一种定量皂荚含量的方法，用上述的引物对通过PCR扩增对皂荚进行定量。上述引物对基于皂荚叶绿体基因组的ycf1b基因序列设计得到，扩增产物量与皂荚和山皂荚的在待测样品中的生物量有显著的相关性更显著，能够准确检测出待测样品中皂荚的占比，从而对待测物中的皂荚进行定。
优选地，所述定量皂荚含量的方法的具体操作为：提取待测物的基因组，作为模板DNA，用所述引物进行PCR扩增，扩增完成后对PCR扩增产物测序，得到测序序列，根据所述皂荚的测序序列的数目计算得出所述待测物中皂荚含量。当待测样品数量较多时，可在上述引物5’端添加不同序列的tag序列，然后再进行PCR扩增，从而可实现混样测序，节省检测成本。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为：
Figure BDA0002515918490000041
扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，55℃，15s，30个循环；68℃，30s；68℃，5min。
附图说明
图1为本发明实施例6中凝胶电泳结果；
图2为本发明实施例7中凝胶电泳结果；
图3为本发明实施例7中两对引物分别在皂荚和山皂荚中生物量和reads数量的相关性分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种鉴别皂荚的试剂盒，该试剂盒中包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对。
实施例2
本发明实施例提供了一种鉴别皂荚的试剂盒，该试剂盒中包括由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对。
实施例3
本发明实施例提供了一种鉴别皂荚的试剂盒，该试剂盒中包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对和由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对。
实施例4
本发明实施例提供了一种鉴别皂荚的试剂盒，具体包括：
(1)由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对。
(2)PCR反应试剂：GflexTM Buffer、Tks GflexTM DNA Polymerase和模板DNA。
实施例5
本发明实施例提供了一种鉴别皂荚的试剂盒，具体包括：
(1)由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对。
(2)PCR反应试剂：GflexTM Buffer、Tks GflexTM DNA Polymerase和模板DNA。
实施例6
本发明实施例提供了一种鉴别皂荚的方法，用由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对进行皂荚的鉴别。
待测样品：含皂荚中成药尪痹胶囊，大皂角，皂角刺。
1、对3个待测样品分别提取DNA
采用TIANGEN公司的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。
2、PCR扩增及测序
PCR扩增的反应体系如表1所示：
表1鉴别皂荚的PCR扩增反应体系
Figure BDA0002515918490000061
扩增反应条件如表2所示：
表2 PCR扩增反应条件
Figure BDA0002515918490000062
配置1.5％琼脂糖凝胶，PCR反应结束后，取5μL的PCR产物加少量Loading buffer进行凝胶电泳实验，确定是否扩增出目标条带，参数设置为110V，35min。根据浓度检测报告，将PCR产物进行等量混合并建库。使用Illumina X Ten PE150平台测序，大皂角的测序数据如SEQ ID NO.5所示，皂角刺的测序数据如SEQ ID NO.6所示，尪痹胶囊的测序数据如SEQ ID NO.7所示。根据测序结果得到ASV序列，将所得ASV序列与皂荚叶绿体基因ycf1b序列进行比对。结果如图1所示，图中DZJ为大皂角、ZJC为皂角刺，WB为尪痹胶囊，M1和M2为Marker。
该结果表明，由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对能够准确鉴定出市售药材中的皂荚，且在降解严重的尪痹胶囊中可成功进行扩增，其对应的mini-barcode可成功用于鉴定降解的中药材和中成药。
实施例7
本发明实施例提供了一种定量皂荚含量的方法，分别用由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对和由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对进行皂荚的定量，步骤具体如下：
1、人工混样
分别将皂荚和山皂荚按表3混样，得到3个含不同物种比例的模拟群落，即ZJ1，ZJ2，ZJ3。
表3两个物种的生物量
Figure BDA0002515918490000071
2、对3个模拟群落分别提取DNA
采用TIANGEN公司的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。
3、引物合成
在如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的引物的5’端分别添加tag序列，具体信息如表4所示，得到PCR扩增引物。
表4两对引物在3个模拟群落中的tag序列
Figure BDA0002515918490000072
Figure BDA0002515918490000081
4、引物稀释
按引物稀释的常规操作，将上述添加了tag序列的引物均分别用TE缓冲液稀释至10μM。
5、PCR扩增及测序
①实验组编号为1，2，3，4，5，6，K(空管)，负(负管)；
②体系液配制，包含2×Gflex buffer 150μL(包含1mM Mg2+和200μM dNTP)和ddH2O 108μL，每管分装21.5μL；
③分别加入0.5μL上述带tag序列的上下游引物，其中1-3号管加入SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对应的PCR扩增引物，4-6号管加入SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对应的的PCR扩增引物；
④分别加入1μL模板DNA，ZJ1的模板DNA浓度为79.9ng/μl，ZJ2的模板DNA浓度为84.4ng/μl，ZJ3的模板DNA浓度为85.1ng/μl；
⑤在冰盒上向各管依次加入0.5μL Tks Gflex DNA Polymerase(宝日医生物技术有限公司)，详细反应体系见表5和表6；其中1～3号管的模板DNA分别为提取自ZJ1，ZJ2，ZJ3的DNA，4～6号管的模板DNA分别为提取自ZJ1，ZJ2，ZJ3的DNA。
⑥简短涡旋、离心后，迅速将PCR反应体系转入PCR仪中，PCR扩增程序同实施例6中的表2。
表5管号为1-3的反应体系
Figure BDA0002515918490000082
Figure BDA0002515918490000091
表6管号为4-6的反应体系
Figure BDA0002515918490000092
凝胶电泳结果如图2所示，由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对和由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对均扩增成功，且空管和负管均无污染。
6、宏条形码数据处理
如表7所示，本实验共得到1549811条reads，首先使用fastq-multx软件根据tag序列拆分数据，bbduk软件去除引物序列。然后使用DADA2软件质量过滤后得到1394781条高质量reads。再用DADA2软件推测错误模型，去冗余，推测ASV(Amplicon sequence variant，扩增子序列变异)，双端合并，进行长度筛选，去嵌合体，得到最终ASV序列和ASV表。将ASV序列导入Geneious，翻译后剔除含终止子的ASV序列，整理得到最终ASV表。其中使用由SEQ IDNO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对扩增的样品中共含有3个ASV(序列如SEQ ID NO.8～10所示)，使用由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对扩增的样品中共含有3个ASV(序列如SEQ ID NO.11～13所示)。
表7宏条形码数据总结
Figure BDA0002515918490000101
ASV鉴别结果如表8所示，以实施例1的引物得到的ASV中，ASV_1被鉴别为皂荚，ASV_2和ASV_3被鉴别为山皂荚。对于实施例2的引物得到的ASV中，ASV_1和ASV_3被鉴别为皂荚，ASV_2被鉴别为山皂荚。
表8 ASV鉴别结果
Figure BDA0002515918490000102
以上结果证明，由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对和由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对均可以检测3个模拟群落中的皂荚和山皂荚物种，并可通过各模拟群落的ASV数量计算得知模拟群落中皂荚的含量。
7、引物定性定量能力评价
根据鉴别结果对得到的ASV序列进行整理，对以上引物的定量能力进行相关性分析。
由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对和由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对均可以检测出皂荚和山皂荚，且皂荚和山皂荚在各模拟群落中占有的reads比例与人工混合样品时不同物种的生物量比例显著性相关，如图3所示，由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ IDNO.2所示的下游引物组成的引物对于皂荚和山皂荚，reads比例与生物量比例的R2分别为0.9995和0.9993，由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对于皂荚和山皂荚，reads比例与生物量比例的R2分别为0.9599和0.9598。表明本发明所提供的引物可以较好的对皂荚及山皂荚进行宏条形码定量分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津中医药大学
<120> 一种鉴别皂荚的试剂盒及鉴别和定量方法
<130> 2020.05.28
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 1
cttccaaaac gaagat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 2
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<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物
<400> 3
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<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 下游引物
<400> 4
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<210> 5
<211> 189
<212> DNA
<213> 大皂角
<400> 5
aattaaacaa gataaaaaaa actacaatga agaagatctt tctacttcta ttttttcaga 60
aaaaagggag gatttgtaca aaatcgatga aagagaagag aaagatatct tccgattgga 120
aaaacctctt ctaaaaatcc ttttcgatta taaacgattc catcgtccat tgcgatatat 180
aaaaaatag 189
<210> 6
<211> 189
<212> DNA
<213> 皂角刺
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<212> DNA
<213> 尪痹胶囊
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 134
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tggataatca ttggagtttt attaataacc aaaaaagaaa gaacctaagc aataaatttt 120
aaaatagggc cgaa 134

Claims (9)

1.一种鉴别皂荚的试剂盒，其特征在于，包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ IDNO.2所示的下游引物组成的引物对和由SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物组成的引物对中的至少一个引物对。
2.根据权利要求1所述的鉴别皂荚的试剂盒，其特征在于，包括由SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物组成的引物对。
3.根据权利要求1或2所述的鉴别皂荚的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和模板DNA，所述PCR缓冲液中含有1mM Mg2+和200μM dNTP。
4.一种鉴别皂荚的方法，其特征在于，用权利要求1所述的引物对通过PCR扩增对皂荚进行鉴别。
5.根据权利要求4所述的鉴别皂荚的方法，其特征在于，具体操作为：提取待测物的基因组作为模板DNA，用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，扩增完成后对PCR扩增产物测序，得到ASV序列，将所述ASV序列与皂荚叶绿体基因ycf1b序列进行比对，判断结果。
6.根据权利要求5所述的鉴别皂荚的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：
Figure FDA0002515918480000011
扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，55℃，15s，30个循环；68℃，30s；68℃，5min。
7.一种定量皂荚含量的方法，其特征在于，用权利要求1所述的引物对通过PCR扩增对皂荚进行定量。
8.根据权利要求7所述的定量皂荚含量的方法，其特征在于，具体操作为：提取待测物的基因组，作为模板DNA，用所述引物进行PCR扩增，扩增完成后对PCR扩增产物测序，得到测序序列，根据所述皂荚的测序序列的数目计算得待测物中皂荚含量。
9.根据权利要求8所述的定量皂荚含量的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：
Figure FDA0002515918480000021
扩增反应条件为：98℃，1min；98℃，10s，55℃，15s，30个循环；68℃，30s；68℃，5min。
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