CN111004860A - 一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种的引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种白术(Atractylodes macrocephala)、茅苍术(Atractylodes lancea)和北苍术(Atractylodes chinensis)的引物及其应用，本发明通过SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2序列作引物，扩增白术、北苍术、茅苍术的叶绿体基因组序列，PCR条带测序后对比发现，茅苍术的目的条带存在5bps的tatat***突变、白术的目的条带存在6bps的tcttac***突变，本发明的叶绿体基因组分子标记成功区分了白术、北苍术、茅苍术三个种，为苍术属植物的遗传多样性、***进化和分类学研究提供了技术手段。

Description

一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种的引物及其应用
技术领域
本方法涉及植物分子生物学领域，特别涉及了一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种的引物及其应用。
背景技术
苍术属(菊科)分布于中国、韩国和日本的种有7种。很多苍术属物种的药用价值早已为人们所知。根据临床用途，其干的根茎可作为两种中草药使用，即中药白术和中药苍术。在《中国药典》、《韩国药典》和《日本药典》中，苍术属植物白术的干燥根状茎被称为白术，茅苍术和北苍术的干燥根状茎被称为苍术。
中药苍术的基源植物可分为茅苍术(南苍术)和北苍术，茅苍术含挥发油约5～9％，油的主要成分为苍术醇、茅术醇、β-桉叶醇等，茅苍术呈不规则连珠状或结节状圆柱形，表面灰棕色，质坚实，断面黄白色或灰白色，散有多数橙黄色或棕红色油室，气香特异，味微甘、辛、苦；茅苍术具有燥湿健脾，祛风，散寒，明目功效。用于脘腹胀满、泄泻、水肿、脚气痿辟、风湿痹痛、风寒感冒、雀目夜盲。
北苍术含挥发油1.5％，其主要成分为苍术醇、苍术酮、茅术醇及桉叶醇等。北苍术呈疙瘩块状，质较疏松，表面黑棕色，断面散有黄棕色油室，香气较淡，味辛、苦；北苍术具有燥湿健脾，祛风，散寒，明目功效。用于脘腹胀满，泄泻，水肿，脚气痿软，风湿痹痛，风寒感冒，雀目夜盲等疾病。
白术归脾、胃经，苦、甘，温，具有健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎功效，可用于脾虚食少，腹胀泄泻，痰饮眩悸，水肿，自汗，胎动不安。土白术健脾，和胃，安胎。用于脾虚食少，泄泻便溏，胎动不安。
白术的根茎被归类为药材白术。在中药中，白术和苍术的药理作用是不同的。白术引起发汗，苍术会抑制发汗。最近的研究表明，苍术属物种的根状茎还具有许多其他药理作用，如抗菌、免疫调节、抗肿瘤和抗骨质疏松等，从而表明苍术属物种在新药开发中具有相当大的潜力。
尽管苍术属物种被广泛用作医药产品的基源植物，但其种类之间的分类关系仍存在争议。白术和苍术成分和功能上具有很大区别，而茅苍术和北苍术形态形似，用宏观观察来区分物种困难、易误用，但其主要的化学成分、生物活性物质的含量及其种类均不相同，所以准确的品种鉴定是保证苍术类药材临床安全性的关键。因此，需要一种准确的物种测定方法，以确保苍术属物种的药用安全性和有效性。
近年来，许多分子识别方法得到了发展，普遍使用的DNA条形码，如ITS和trnK基因，已被用于苍术属的物种鉴定和***发育分析。然而，由于物种界限不清和分辨率低，这些标记在物种水平和种下水平上的表现并不令人满意。因此，如何提供一种简便、高效可区分苍术属物种的分子标记是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种的引物及其筛选方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种的引物，引物序列为:
cz11_F：AGAACCGTCACAATACGCCT；SEQ ID NO1；
cz11_R：AACGCCTACGAAAAGATCGC；SEQ ID NO2。
一种利用叶绿体基因和cz11_F/cz11_R引物，鉴定茅苍术、白术、北苍术的方法，包括以下步骤：
(1)提取茅苍术、北苍术、白术植株的总DNA；
(2)用cz11_F/cz11_R引物对总DNA进行扩增；
(3)PCR产物测序后进行序列比对，通过序列中的差异位点区分种类。
所述扩增反应条件为：在90-95℃预变性2-10分钟；90-95℃变性10-50s，40-60℃退火15-50s，72℃延伸20-120s，30-40个循环；最终72℃延伸2-10分钟；
差异位点包括：茅苍术目的条带的5bps tatat***突变、白术目的条带的6bpstcttac***突变。
引物选择步骤包括：
(1)提取植株总DNA，对苍术属总DNA进行测序，从总DNA测序结果中获得叶绿体基因组序列，并对数据进行差异分析；
(2)选择差异区域设计检测引物；
(3)对设计的检测引物进行实际检测；
叶绿体基因组测序方法为NGS测序法；
数据差异分析方法包括：
三种苍术属植物叶绿体基因组特征分析、内含子和外显子长度信息分析、叶绿体基因组密码子使用频率分析、叶绿体基因组重复序列信息、叶绿体基因组SSR序列信息、叶绿体基因组***缺失突变信息、叶绿体基因组重变异位点信息；
植株实际检测的步骤为：收集苍术属不同种的植株，并进行总DNA提取，使用检测引物扩增每株植物提取的总DNA，产物经电泳回收后进行Sanger测序，根据测序结果筛选能够区分3个苍术属物种的引物。
PCR反应条件：90-95℃预变性2-10分钟；90-95℃变性10-50s，40-60℃退火15-50s，72℃延伸20-120s，30-40个循环；最终延伸72℃，2-10分钟；
PCR反应混合物包含12.5μL TAQ MasterMix(2×)、0.5-2μL正向引物、0.5-2μL反向引物和纯化的总DNA(20-200ng)。
优选的，PCR反应条件：94℃预变性2-5分钟，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃最终延伸2分钟。
优选的，正、反向引物的浓度为5-20μM；
优选的，纯化的总DNA50-100ng；
PCR产物的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳；
优选的，琼脂糖浓度为1-3％；
PCR产物测序方法为sanger测序法。
综上所述，本发明提供了一种利用叶绿体基因鉴定苍术属种引物的筛选方法，开发的分子标记成功区分了茅苍术、北苍术和白术。本发明的叶绿体基因组标记为苍术属药用物种的遗传多样性、***进化和分类学研究提供了宝贵的遗传资源。
附图说明
图1：3种苍术属植物叶绿体基因组特征图示；
图2：白术、北苍术、茅苍术密码子使用频率统计图；
图3：3种叶绿体基因组重复序列长度和数量统计图；
图4：苍术属3种植物15个个体扩增产物的比对图；
图5：cz11引物对不同产地3种苍术属物种的测序结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.取白术、北苍术、茅苍术植株提取基因组，通过NGS技术测序，获得苍术、北苍术和白术叶绿体基因组序列，通过软件对序列进行数据分析。
数据差异分析方法：
本发明使用REPuter软件识别四种类型的重复序列，包括正向重复、回文重复、反向重复和互补重复；最小重复单元大小设定为30bp，重复单元之间相似性的临界值设定为90％。
使用MISA软件预测简单重复序列(SSR)，其阈值如下：①重复单元核苷酸残基数为1个时，重复单元数至少为8个；②重复单元核苷酸残基数为2-3个时，重复单元数至少为4个；③重复单元核苷酸残基数为4-6个时，重复单元数至少为3个。
在序列比对的基础上，利用DnaSP(v5.1)软件对***缺失突变和单核苷酸多态性(SNPs)进行分析。以茅苍术的叶绿体基因组为参照，用mVISTA软件以S huffle-LAGAN模式对三种苍术属药用物种的叶绿体基因组进行了比较。
利用CodonW软件，采用RSCU比值对密码子使用频率进行了分析。
目标序列变异分析方法为：所有的读序映射到目标序列，以确定目标序列的多样性水平。首先利用序列比对将该序列与测序产生的读序进行比对。将搜索到的读序利用Clustalw2软件再与目标序列进行比对。最后，使用EMBOSS软件中的ExtractAlign程序提取多重比对结果。计算了映射到每个物种目标序列的读序的类型和出现的频率。
结果如下：
(1)三种叶绿体基因组特征综述如表1所示。茅苍术、北苍术和白术叶绿体基因组的总长度分别为153201、153258和153261bps。三个叶绿体基因组均显示出典型的四分体结构，分别被一对长度为25148、25148和25154bps的反向重复序列(IR)区分割为一个大单拷贝(LSC)区和一个小单拷贝(SSC)区。大单拷贝区的长度分别为84249、84282和84280bps，小单拷贝区的长度分别为18656、18680和18673bps。
三种植物叶绿体基因组的g/c含量均为37.7％。该值低于IR区(43.2％)，高于LSC区(35.8％)和SSC区(31.5％)，说明LSC区、SSC区和IR区存在不同的起源或选择压力。
表1.三种苍术属植物叶绿体基因组特征分析
Figure BDA0002358396810000061
Figure BDA0002358396810000071
(2)茅苍术、北苍术叶绿体基因组均含有132个基因，白术叶绿体基因组含有130个基因，其中包括119个非重复的基因，编码78个蛋白质、37个tRN A和4个rRNA(表2)。7个基因，即rpl23、ycf1、ycf2、ycf15、ndhB、rps7和rps12，以及所有rRNA基因都存在于IR区域(图1)。叶绿体基因组包含了21个含内含子的基因，包括11个蛋白质编码基因和8个含有1个内含子的t RNA基因，以及所有3个物种中含有2个内含子的蛋白质编码基因clpP和ycf3(表2)。rps12基因是一个特殊的反式剪接基因：5'外显子位于LSC区，3'外显子位于IR区。
表2.北苍术、茅苍术和白术叶绿体基因的内含子和外显子长度信息
Figure BDA0002358396810000072
Figure BDA0002358396810000081
(3)在这三种植物中，共发现87个蛋白质编码基因，编码10922个密码子。在这些密码子中，异亮氨酸和半胱氨酸具有最高和最低的出现频率，分别有为1152(10.55％)和114(1.04％)个密码子(表3)。表3总结了3个叶绿体基因组中蛋白质编码基因的密码子使用情况。3个物种中相同密码子的相对同义密码子使用(RSCU)值相似(图2)。此外，叶绿体基因组蛋白质编码区(CDS)内第一、第二和第三密码子位置的a/t含量分别为58.32％、63.18％和68.20％。
表3.三个苍术属物种叶绿体基因组蛋白编码基因的密码子使用频率
Figure BDA0002358396810000082
Figure BDA0002358396810000091
Figure BDA0002358396810000101
(4)本发明分析了茅苍术、北苍术和白术叶绿体基因组中重复序列的结构和分布(表4)，分别检测到39个、37个和39个重复序列，其长度均超过30bps，相似性高于90％。结果显示3个叶绿体基因组重复序列的长度和重复次数相似。茅苍术为19个正向重复和20个回文重复，北苍术为18个正向重复和19个回文重复，白术为19个正向重复和20个回文重复。大多数重复分布在基因间区(IGS)内，大多数重复长度在30bps到40bps之间(图3)。
表4.三个苍术属物种叶绿体基因组重复序列信息
Figure BDA0002358396810000102
Figure BDA0002358396810000111
本发明在三个叶绿体基因组中共鉴定出48个简单重复序列(SSR)(表5)。SSR主要分布在IGS和内含子序列中，大多数单核苷酸重复单元的重复数是34次；3个物种的6个基因的CDS中，共鉴定出9个SSR，包括rpoB、rpoC1、rpo C2、psbC、rpoA和ycf1。3个叶绿体基因组在SSR的数目和GC含量上保守性较高。
表5.三个苍术属物种叶绿体基因组SSR序列信息
Figure BDA0002358396810000112
Figure BDA0002358396810000121
IGS：基因间区，Intron：内含子区，CDS：蛋白编码区。
(5)将叶绿体基因组目标序列与测序产生的读序进行比对，比对的相似性阈值为1e-5。将搜索到的读序利用Clustalw2软件再与目标序列进行比对。最后，使用EMBOSS软件中的ExtractAlign程序提取多重比对结果。计算了映射到每个物种目标序列的读序的类型和出现的频率。
本发明检测到44个***缺失突变位点，其中37个位于IGS区、3个位于内含子区和4个位于CDS区。大多数***缺失突变的长度介于1-6bps，7个***缺失突变的长度超过10bps。在psbN基因的编码序列中发现最长的***缺失突变，长度为24bps(表6)。还在三个物种的叶绿体基因组中检测到111个单核苷酸多样性位点(表7)，其中42个位于编码序列中。特别地，ycf1基因包含10个变异位点，因此ycf1为一个变异热点。
表6.三个苍术属物种叶绿体基因组***缺失突变信息
Figure BDA0002358396810000131
IGS：基因间区，Intron：内含子区，CDS：蛋白编码区。1:Atractylodeslancea,2:A.chinensis,3:A.macrocephala
表7.三个苍术属物种叶绿体基因组重变异位点信息
Figure BDA0002358396810000141
Figure BDA0002358396810000151
Figure BDA0002358396810000161
2.本发明选择了11对引物(表8)。每个物种收集了5个植物个体(表9)，并进行了总DNA提取。检测引物扩增从每株植物中提取的总DNA，PCR扩增实验在pH-FlexPCR***上进行，反应条件如下：
94℃预变性2分钟，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃最后延长2分钟。PCR反应混合物包含12.5μL TAQ MasterMix(2×)、1μL正向引物(10μM)、1μL反向引物(10μM)和纯化的总DNA(60ng)。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳。切胶回收后的产物进行Sanger测序。15个总DNA样本，均经11个引物组扩增，3次重复，利用双端测序对相应的PCR产物进行测序。测序结果经经比对发现，cz11_F/cz11_R可以产生稳定的目的条带，并能良好地区分白术、茅苍术和北苍术。PCR产物的45条序列的比对结果如图4所示。茅苍术的目的条带存在5bps序列为tatat的***突变；白术的目的条带存在6bps序列为tcttac的***突变。
表8.11对区分苍术属物种检测引物
Figure BDA0002358396810000162
Figure BDA0002358396810000171
表9.三种苍术属样品信息
编号 物种名 采集地点 标本编号 样品编号
1 茅苍术 北京药用植物园 Implad-20170101 A.lancea_01
2 茅苍术 北京药用植物园 Implad-20170102 A.lancea_02
3 茅苍术 北京药用植物园 Implad-20170103 A.lancea_03
4 茅苍术 北京药用植物园 Implad-20170104 A.lancea_04
5 茅苍术 北京药用植物园 Implad-20170105 A.lancea_05
6 北苍术 北京药用植物园 Implad-20170106 A.chinensis_01
7 北苍术 北京药用植物园 Implad-20170107 A.chinensis_02
8 北苍术 北京药用植物园 Implad-20170108 A.chinensis_03
9 北苍术 北京药用植物园 Implad-20170109 A.chinensis_04
10 北苍术 北京药用植物园 Implad-20170110 A.chinensis_05
11 白术 北京药用植物园 Implad-20170111 A.macrocephala_01
12 白术 北京药用植物园 Implad-20170112 A.macrocephala_02
13 白术 北京药用植物园 Implad-20170113 A.macrocephala_03
14 白术 北京药用植物园 Implad-20170114 A.macrocephala_04
15 白术 北京药用植物园 Implad-20170115 A.macrocephala_05
实施例2
为了进一步验证上述分子标记的可靠性，白术和北苍术从3个产地选择植物材料，每个产地收集6个(表10)个体。茅苍术从2个产地选择植物材料，每个产地收集2个(表10)个体。所有40个体都进行了总DNA提取。用引物对cz11_F/cz11_R进行PCR扩增。用Sanger测序法对相应的PCR产物进行测序。40个PCR产物序列的比对结果显示在(图5)中。白术和北苍术的36个个体都显示出预期的标记序列(表10)，被成功验证。茅苍术的4个个体也显示出预期的标记序列(表10)，被成功验证。
表10.三种苍术属物种的产地信息和PCR验证结果
Figure BDA0002358396810000172
Figure BDA0002358396810000181
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院药用植物研究所
<120> 一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种的引物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaaccgtca caatacgcct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacgcctacg aaaagatcgc 20

Claims (5)

1.一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种的引物，其特征在于，引物序列为:
cz11_F：AGAACCGTCACAATACGCCT；SEQ ID NO1；
cz11_R：AACGCCTACGAAAAGATCGC；SEQ ID NO2。
2.一种利用叶绿体基因鉴定茅苍术、白术、北苍术的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的引物鉴定。
3.根据权利要求2所述的一种利用叶绿体基因鉴定茅苍术、白术、北苍术的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取茅苍术、北苍术、白术植株的总DNA；
(2)用cz11_F/cz11_R引物对总DNA进行扩增；
(3)PCR产物测序后进行序列比对，通过序列中的差异位点区分种类。
4.根据权利要求3所述的一种利用叶绿体基因鉴定茅苍术、白术、北苍术的方法，其特征在于，所述扩增反应条件为：90-95℃预变性1-10分钟；90-95℃变性10-50s，40-60℃退火15-50s，72℃延伸20-120s，30-40个循环；最终延伸72℃，2-10分钟。
5.根据权利要求3所述的一种利用叶绿体基因鉴定茅苍术、白术、北苍术的方法，其特征在于，所述差异位点包括：茅苍术目的条带的5bps tatat***突变、白术目的条带的6bpstcttac***突变。
CN202010014611.7A 2020-01-07 2020-01-07 一种利用叶绿体基因鉴定苍术属药用物种的引物及其应用 Active CN111004860B (zh)

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