CN111411069B - 一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法 - Google Patents

一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，属于藻类生物技术领域，特别是一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法；本发明通过将三角褐指藻于自制的培养基中培养，当三角褐指藻达到对数生长期时，添加光合诱导素PIF，可提高三角褐指藻的细胞生长，且可快速诱导岩藻黄素相关基因表达，促进岩藻黄素快速积累，当三角褐指藻培养达到对数生长期时添加光合诱导素，三角褐指藻的细胞量提高17.7％，岩藻黄素的含量提高了44％，成功的解决了现有技术中岩藻黄素稀缺的问题。

Description

一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法
技术领域
本发明涉及藻类生物技术领域，特别是涉及一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法。
背景技术
岩藻黄素(Fucoxanthin)是类胡萝卜素中叶黄素类的一种天然色素，研究表明，岩藻黄素具有多种促进健康的特性，如抗肥胖、抗糖尿病、降血压、抗氧化、抗癌、神经保护作用、治疗眼部炎症等，作为药物、护肤美容产品以及保健品在市场上得以广泛的应用；其中，岩藻黄素的抗氧化特性被认为是发挥有益健康作用的主要机制。
岩藻黄素广泛存在于各种藻类、海洋浮游植物、水生贝壳类等动植物中；最早用于提取岩藻黄素的物质主要为大型藻，例如海带、羊栖菜等，因养殖成本高和提取含量低等原因限制了岩藻黄素的开发利用；国内外研究者发现，三角褐指藻中也含有岩藻黄素，且具有生长繁殖快、易人工培养等优势，但岩藻黄素在三角褐指藻中的含量极低，导致岩藻黄素价格极其昂贵，因此，急需提供一种可以提高三角褐指藻中岩藻黄素含量的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，该制备方法克服了上述现有技术中存在的缺陷，本发明通过将三角褐指藻于自制的培养基中培养，当三角褐指藻达到对数生长期时，添加光合诱导素PIF作为光合促进剂，通过在快速生长期时添加光合诱导素，可提高三角褐指藻的细胞生长，且可快速诱导岩藻黄素相关基因表达，促进岩藻黄素快速积累。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，具体包括如下步骤：
(1)接种培养：将三角褐指藻接种到改良的F/2培养液中接种培养，培养过程中定时摇藻；
(2)生长测定：取三角褐指藻藻液，用紫外分光光度计测定其吸光度，并将其转化为细胞数，确定细胞的生长周期；
(3)光合诱导素添加：待三角褐指藻生长达到对数生长期时，添加光合诱导素，继续培养40～60h，测定三角褐指藻中岩藻黄素的含量。
优选的，所述改良的F/2培养液的组成为：硝酸钠74.8㎎、磷酸二氢钠4.4㎎、硅酸钠8.4～16.7㎎、F/2微量元素溶液1mL、F/2维生素溶液1mL、消毒海水1000mL。
优选的，所述F/2微量元素溶液的组成为：硫酸锌23㎎、硫酸铜10㎎、氯化锰178㎎、柠檬酸铁3.9mg、钼酸钠7.3mg、乙二胺四乙酸钠4.35mg、氯化钴12㎎、纯净水1000mL。
优选的，所述F/2微量元素溶液的组成为：维生素B120.5㎎、维生素H0.5㎎、维生素B1100㎎、纯净水1000mL。
优选的，所述接种培养的温度为20±1℃，光照强度为60～80μmol/(m2·s)，光暗周期交替进行，每个周期为12h。
优选的，所述接种培养时，三角褐指藻和改良的F/2培养液的重量比为1:2～3。
优选的，步骤(2)中，将藻液吸光度转变成细胞数的方法如下：取4mL藻液于UV-5200型紫外分光光度计上测定三角褐指藻藻液在680nm处的吸光值，根据回归方程y＝124.14x-9.5138(R2＝0.9983)，计算三角褐指藻的细胞密度；
其中x为680nm处的吸光值，y为三角褐指藻的细胞密度。
优选的，所述光合诱导素的添加浓度为0.01～10μg/L。
优选的，所述三角褐指藻中岩藻黄素含量的测定方法如下：
(1)取光合诱导剂处理过的藻液50mL，于4℃、5000rpm下离心分离10min得藻泥，真空冷冻干燥24h后得到固态藻；
(2)将固态藻与无水乙醇以1:40(g/mL)的比例混合，于60℃下避光浸提1h，去除上清液，再加入等体积的无水乙醇混合，重复浸提1h，得到浸提液；
(3)将浸提液在5000rpm下离心10min，取上清液测定其在A445处的吸光度，利用C＝(1000×A445×N×V)/(A1％cm×M×100)计算出岩藻黄素的含量；
其中N表示稀释倍数；V表示提取液的体积；M为样品质量；A1％cm为1600。
本发明的有益技术效果：
本发明提供了一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，本发明通过将三角褐指藻于自制的培养基中培养，当三角褐指藻达到对数生长期时，添加光合诱导素PIF，通过添加光合诱导素作为光合促进剂，可提高三角褐指藻的细胞生长，且可快速诱导岩藻黄素相关基因表达，促进岩藻黄素快速积累；实验结果表明，当三角褐指藻培养达到对数生长期时添加光合诱导素，三角褐指藻的细胞量提高17.7％，岩藻黄素的含量提高了44.2％，取得了较优的技术效果。
附图说明
图1为实施例和对比例处理后对三角褐指藻细胞生长的影响；
图2为实施例和对比例处理后对三角褐指藻中岩藻黄素含量的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，具体包括如下步骤：
(1)接种培养：将三角褐指藻接种到改良的F/2培养液中接种培养，培养过程中定时摇藻；
(2)生长测定：取三角褐指藻藻液，用紫外分光光度计测定其吸光度，并将其转化为细胞数，确定细胞的生长周期；
(3)光合诱导素添加：待三角褐指藻生长达到对数生长期时，添加光合诱导素，继续培养40～60h，测定三角褐指藻中岩藻黄素的含量。
在本发明中，接种培养时，所述改良后的F/2培养液的组成优选为：硝酸钠74.8㎎、磷酸二氢钠4.4㎎、硅酸钠8.4～16.7mg、F/2微量元素溶液1mL、F/2维生素溶液1mL、消毒海水1000mL；其中所述F/2微量元素溶液的组成优选为：硫酸锌23mg、硫酸铜10mg、氯化锰178mg、柠檬酸铁3.9mg、钼酸钠7.3mg、乙二胺四乙酸钠4.35mg、氯化钴12mg、纯净水1000mL；所述F/2微量元素溶液的组成优选为：维生素B120.5mg、维生素H0.5mg、维生素B1100mg、纯净水1000mL；所述培养液为发明人自行配置，该培养液更接近于其生长环境，可满足三角褐指藻的生长需求，同时添加各种营养元素，为其提供了丰富的营养；
所述培养接种过程中，接种培养的温度优选为20±1℃，光照强度优选为60～80μmol/(m2·s)，更优选为70μmol/(m2·s)，光照培养时，光暗周期交替进行，每个周期时间为12h；培养过程中，不定时的进行摇藻操作，便于更换三角褐指藻的位置，每日摇藻优选5～9次；培养接种时，三角褐指藻和改良F/2培养液的重量比优选为1:2～3，更优选为1:2。
在本发明中，所述接种培养的过程中，对藻液进行生长监测，每日取三角褐指藻的藻液，用UV-5200型紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司)测定其吸光度，并根据回归方程y＝124.14x-9.5138(R2＝0.9983)，计算三角褐指藻的细胞密度，其中x为680nm处的吸光值，y为三角褐指藻的细胞密度。
当通过计算得到三角褐指藻的细胞数，判断其生长达到对数生长期时(三角褐指藻接种后的4天左右可达到对数生长期)，添加光合诱导素，其中光合诱导素的添加浓度为0.01～10μg/L，即1L培养基中添加0.01～10μg光合诱导素；处于对数生长期的三角褐指藻生长最旺盛，最有活力，细胞数量最多，此时添加光合诱导素，可快速诱导岩藻黄素相关基因表达，可促进岩藻黄素快速积累，实现在较短时间内岩藻黄素的快速积累；当接种三角褐指藻40～60h后优选添加光合诱导素48h后，对三角褐指藻中的岩藻黄素含量进行测定，方法如下：
(1)取光合诱导剂处理过的藻液50mL，于4℃、5000rpm下离心分离10min得藻泥，真空冷冻干燥24h后得到固态藻；
(2)将固态藻与无水乙醇以1:40(g/mL)的比例混合，于60℃下避光浸提1h，去除上清液，再加入等体积的无水乙醇混合，重复浸提1h，得到浸提液；
(3)将浸提液在5000rpm下离心10min，取上清液测定其在A445处的吸光度，利用C＝(1000×A445×N×V)/(A1％cm×M×100)计算出岩藻黄素的含量；
其中A445处的吸光值由双光束紫外可见分光光度计测定，型号为UV-4802，生产厂家为上海尤尼柯仪器有限公司；
且N表示稀释倍数；V表示提取液的体积；M为样品质量；A1％cm为1600。
下面结合实施例对本发明提供的提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
1)本发明所用三角褐指藻选自宁波大学实验室自行培养的三角褐指藻；
2)接种培养时所用的改良的F/2培养基为自制培养基，其组成为硝酸钠74.8㎎、磷酸二氢钠4.4㎎、硅酸钠10mg、F/2微量元素溶液1mL、F/2维生素溶液1mL、消毒海水1000mL；其中所述F/2微量元素溶液的组成优选为：硫酸锌23mg、硫酸铜10mg、氯化锰178mg、柠檬酸铁3.9mg、钼酸钠7.3mg、乙二胺四乙酸钠4.35mg、氯化钴12mg、纯净水1000mL；所述F/2微量元素溶液的组成优选为：维生素B120.5mg、维生素H0.5mg、维生素B1100mg、纯净水1000mL；
3)岩藻黄素的含量采用以下方式测定；
(1)取光合诱导剂处理过的藻液50mL，于4℃、5000rpm下离心分离10min得藻泥，真空冷冻干燥24h后得到固态藻；
(2)将固态藻与无水乙醇以1:40(g/mL)的比例混合，于60℃下避光浸提1h，去除上清液，再加入等体积的无水乙醇混合，重复浸提1h，得到浸提液；
(3)将浸提液在5000rpm下离心10min，取上清液测定其在A445处的吸光度，利用C＝(1000×A445×N×V)/(A1％cm×M×100)计算出岩藻黄素的含量；
以下实施例所用三角褐指藻、改良F/2培养基以及岩藻黄素含量的测定均选自上述提供的类型或测量方法；
实施例1：
取自宁波大学实验室自行培养的，处于对数生长期且生长良好的三角褐指藻以1:2的重量比接种到改良的F/2培养液中进行接种培养，培养的温度为20℃，光照强度为60μmol/(m2·s)，光暗周期交替培养，每个周期为12h，培养过程中，不定时的进行摇藻操作，每日摇藻5次；
每日取培养的三角褐指藻藻液，用上海元析仪器有限公司生产的UV-5200型紫外分光光度计测定其吸光值，并根据回归方程y＝124.14x-9.5138(R2＝0.9983)并测得的吸光值转化为细胞数，从而确定细胞的生长周期；
当三角褐指藻接种培养4天，即达到三角褐指藻的对数生长期时，添加光合诱导素，使光合诱导素的浓度为0.01μg/L(1L培养液中包含0.01μg光合诱导素)，继续培养45h。
实施例2：
取自宁波大学实验室自行培养的，处于对数生长期且生长良好的三角褐指藻以1:2.5的重量比接种到改良的F/2培养液中进行接种培养，培养的温度为21℃，光照强度为70μmol/(m2·s)，光暗周期交替培养，每个周期为12h，培养过程中，不定时的进行摇藻操作，每日摇藻6次；
每日取培养的三角褐指藻藻液，用上海元析仪器有限公司生产的UV-5200型紫外分光光度计测定其吸光值，并根据回归方程y＝124.14x-9.5138(R2＝0.9983)并测得的吸光值转化为细胞数，从而确定细胞的生长周期；
当三角褐指藻接种培养4天，即达到三角褐指藻的对数生长期时，添加光合诱导素，使光合诱导素的浓度为1μg/L(1L培养液中包含1μg光合诱导素)，继续培养48h。
实施例3：
取自宁波大学实验室自行培养的，处于对数生长期且生长良好的三角褐指藻以1:3的重量比接种到改良的F/2培养液中进行接种培养，培养的温度为19℃，光照强度为80μmol/(m2·s)，光暗周期交替培养，每个周期为12h，培养过程中，不定时的进行摇藻操作，每日摇藻8次；
每日取培养的三角褐指藻藻液，用上海元析仪器有限公司生产的UV-5200型紫外分光光度计测定其吸光值，并根据回归方程y＝124.14x-9.5138(R2＝0.9983)并测得的吸光值转化为细胞数，从而确定细胞的生长周期；
当三角褐指藻接种培养4天，即达到三角褐指藻的对数生长期时，添加光合诱导素，使光合诱导素的浓度为10μg/L(1L培养液中包含10μg光合诱导素)，继续培养48h。
对比例1：
对比例1与实施例1相比，仅未添加光合诱导素，其余步骤均与实施例1相同；
对比例2：
对比例2与实施例2相比，仅三角褐指藻的培养液组成不同，其余均与实施例2相同；
对比例2中三角褐指藻培养基的组成为：Na2SiO3、CuSO4、ZnSO4、MnCl2、EDTANa2、Na2MoO4、CoCl2、FeCl3、Na2SeO3、VB12、VB7、VB1、H3BO3、KCl、KBr、NaF、CaCl2、SrCl2、MgCl2、NaNO3、NaH2PO4和水。
将实施例1～3和对比例1～2培养的三角褐指藻的细胞生长情况进行测定，详见图1，其中对比例1的实验结果用D1代替、对比例2用D2代替、实施例1用S1代替、实施例2用S2代替、实施例3用S3代替；由图1可知，选用发明人自制的改良F/2培养液培养三角褐指藻，且在三角褐指藻对数生长期时添加光合诱导素，可促进三角褐指藻细胞的快速生长，且实施例2中所述的细胞密度相对于D1和D2增长约17.7％。
将实施例1～3和对比例1～2培养的三角褐指藻中的岩藻黄素进行测定，详见图2，其中对比例1的实验数据用D1代替、对比例2用D2代替、实施例1用S1代替、实施例2用S2代替、实施例3用S3代替；由图2可知，选用发明人自制的改良F/2培养基培养三角褐指藻，且在三角褐指藻对数生长期添加光合诱导素，在光合诱导素的浓度为1μg/L时，三角褐指藻中岩藻黄素的含量最高，相比于D1和D2来说，岩藻黄素的含量为2.59mg·g-1DW，提高了约44％，取得了较大的技术进步，为岩藻黄素的应用开拓了更广阔的市场。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，具体包括如下步骤：
（1）接种培养：将三角褐指藻接种到改良的F/2培养液中接种培养，培养过程中定时摇藻；
（2）生长测定：取三角褐指藻藻液，用紫外分光光度计测定其吸光度，并将其转化为细胞数，确定细胞的生长周期；
（3）光合诱导素添加：待三角褐指藻生长达到对数生长期时，添加光合诱导素，继续培养40~60h，测定三角褐指藻中岩藻黄素的含量；
所述改良的F/2培养液的组成为：硝酸钠 74.8㎎、磷酸二氢钠 4.4㎎、硅酸钠 8.4~16.7㎎、F/2 微量元素溶液 1mL、F/2 维生素溶液 1mL、消毒海水 1000mL；
所述F/2维 生素溶液的组成为：维生素B12 0.5㎎、维生素H 0.5㎎、维生素B1 100㎎、纯净水1000mL；
所述光合诱导素的添加浓度为0.01~10μg/L。
2.根据权利要求1所述的用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特征在于，所述F/2微量元素溶液的组成为：硫酸锌23㎎、硫酸铜10㎎、氯化锰178㎎、柠檬酸铁3.9mg、钼酸钠7.3mg、乙二胺四乙酸钠4.35mg、氯化钴12㎎、纯净水1000mL。
3.根据权利要求1所述的用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特征在于，所述接种培养的温度为20±1℃，光照强度为60~80μmol/(m2·s)，光暗周期交替进行，每个周期为12h。
4.根据权利要求1所述的用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特征在于，所述接种培养时，三角褐指藻和改良的F/2培养液的重量比为1:2~3。
5.根据权利要求1所述的用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特征在于，步骤（2）中，将藻液吸光度转变成细胞数的方法如下：取4mL藻液于UV-5200型紫外分光光度计上测定三角褐指藻藻液在680nm处的吸光值，根据回归方程y=124.14x-9.5138(R2=0.9983)，计算三角褐指藻的细胞密度；
其中x为680nm处的吸光值，y为三角褐指藻的细胞密度。
6.根据权利要求1所述的用光合促进剂提高三角褐指藻岩藻黄素含量的方法，其特征在于，所述三角褐指藻中岩藻黄素含量的测定方法如下：
（1）取光合诱导剂处理过的藻液50mL，于4℃、5000rpm下离心分离10min得藻泥，真空冷冻干燥24h后得到固态藻；
（2）将固态藻与无水乙醇以1:40（g/mL）的比例混合，于60℃下避光浸提1h，去除上清液，再加入等体积的无水乙醇混合，重复浸提1h，得到浸提液；
（3）将浸提液在5000rpm下离心10min，取上清液测定其在A445处的吸光度，利用C =（1000×A 445×N×V）/（A 1% cm×M×100）计算出岩藻黄素的含量；
其中N表示稀释倍数；V表示提取液的体积；M为样品质量；A 1% cm为1600。
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