CN111808755A - 提升微藻细胞密度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了提升微藻细胞密度的方法,包括:将处于生长缓慢及停滞状态、受到胁迫或衰退状态的微藻细胞转入新鲜的培养液中,并向培养液中添加硝普钠继续培养,以提升微藻细胞密度。本发明的方法能显著提高培养液中微藻细胞密度,缩短培养时间,提高培养效率。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域,涉及一种提升微藻细胞密度的方法,即添加硝普钠提高微藻细胞密度的方法。
背景技术
微藻是一类在陆地、海洋分布广泛,营养丰富、光合利用度高的自养植物,细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等,使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。微藻种类繁多,微藻细胞中含有蛋白质、脂类、藻多糖、β-胡萝卜素等高价值的营养成分和化工原料。微藻的蛋白质含量很高,是单细胞蛋白的一个重要来源。微藻所含的维生素A、维生素E、硫氨素、核黄素、吡多醇、维生素B12、维生素C、生物素、肌醇、叶酸、泛酸钙和烟酸等增加了其作为单细胞蛋白的价值。常见的微藻种类包括雨生红球藻,小球藻,螺旋藻,杜氏盐藻等。雨生红球藻中类胡萝卜素含量较高,具有着色和营养的作用,可用来防治癌症、抗辐射、延缓衰老,增强机体免疫力等生理作用。杜氏盐藻含有丰富的油脂、β-胡萝卜素、蛋白质、多糖等,同时含较高的Ca、P、Zn等矿物质,还含有包括人类必需氨基酸在内的18种氨基酸,累积的甘油为干重的40%-50%,是优质的化妆品原料,也是化工、轻工和医药工业中用途极广的有机中间体。小球藻拥有目前发现的最接近人体需要的天然均衡营养食品,小球藻富含七大营养素:蛋白质、脂类、碳水化合物、矿物质、维生素、水、膳食纤维,18种氨基酸被誉为“灌装的太阳”和“绿色黄金”。主要应用于保健食品、新资源食品添加应用、美容护肤、生物制药领域,同时小球藻对改善环境和畜牧业也有非常广泛的运用,比如水体土壤污染治理、生物能源、植物再生、饲料等领域都有长足的发展。总之,微藻作为丰富而宝贵的自然资源,具有十分广阔的开发价值,研究如何提高微藻的培养密度,提高培养效率是微藻资源开发与利用中十分重要的一环。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种提升微藻细胞密度的方法,获得一种新的提升微藻细胞密度方法的技术路线,并能显著提高培养液中微藻细胞密度,缩短培养时间,提高培养效率。
为此,本发明提供的技术方案为:
提升微藻细胞密度的方法,包括如下步骤:将处于生长缓慢及停滞状态、受到胁迫或衰退状态的微藻细胞转入新鲜的培养液中,并向培养液中添加硝普钠继续培养,以提升微藻细胞密度。
优选的是,所述的提升微藻细胞密度的方法中,所述硝普钠于培养液中的浓度为15-50μmol/L。
优选的是,所述的提升微藻细胞密度的方法中,所述生长缓慢及停滞状态包括处于对数生长末期及稳定期的细胞。
优选的是,所述的提升微藻细胞密度的方法中,将包含对数生长末期的微藻细胞培养液离心后取藻泥接种于灭菌后的新鲜BG11培养基中,添加过滤除菌的硝普钠至终浓度为15-50μmol/L,然后开始培养。
优选的是,所述的提升微藻细胞密度的方法中,培养过程中给予光照培养,控制培养温度为25-30℃,光强为25μmol photons m-2s-1。
优选的是,所述的提升微藻细胞密度的方法中,所述光照为人工光照或自然光照,所述人工光照包括白炽灯或LED灯条进行光照。
优选的是,所述的提升微藻细胞密度的方法中,所述硝普钠作为MO供体,包括金属-NO复合物硝普钠、新型金属-NO复合物Ni-(SalPipNONO)、无菌NO气体、偶氮二醇烯鎓盐和NO供体纳米粒子中的任意一种。
优选的是,所述的提升微藻细胞密度的方法中,获取对数生长阶段微藻培养液的方法包括如下步骤:
在封闭式光生物反应器中,利用BG11培养基对微藻进行自养培养或兼养培养或异养培养,控制培养温度为25-30℃,光强为25μmol photons m-2s-1,培养微藻至对数生长期末期,获得包含对数生长末期的微藻细胞培养液。
优选的是,所述的提升微藻细胞密度的方法中,所述微藻为雨生红球藻、小球藻、杜氏盐藻或莱茵衣藻。
本发明至少包括以下有益效果:
本发明经实例实验证明,向雨生红球藻培养液中加入硝普钠后,藻细胞浓度比正常培养条件下提高了22%-51.1%,向杜氏盐藻培养液中加入硝普钠后,藻细胞浓度比正常培养条件下提高了12.7%-24.7%,向小球藻培养液中加入硝普钠后,藻细胞浓度比正常培养条件下提高了18.4%,充分说明了硝普钠在提升雨生红球藻培养密度领域有很大的应用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例中250mL三角瓶中硝普钠对雨生红球藻细胞密度随时间变化影响图。
图2为本发明其中一个实施例中250mL三角瓶中硝普钠对雨生红球藻细胞干重随时间变化影响图。
图3为本发明其中一个实施例中通入无菌NO气体对雨生红球藻细胞密度影响图。
图4为本发明其中一个实施例中通入无菌NO气体对雨生红球藻细胞干重影响图。
图5为本发明其中一个实施例中250mL三角瓶中硝普钠对杜氏盐藻细胞密度随时间变化影响图。
图6为本发明其中一个实施例中250mL三角瓶中硝普钠对小球藻细胞密度随时间变化影响图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解,本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供提升微藻细胞密度的方法,包括如下步骤:将处于生长缓慢及停滞状态、受到胁迫或衰退状态的微藻细胞转入新鲜的培养液中,并向培养液中添加硝普钠继续培养,以提升微藻细胞密度。硝普钠为鲜红色透明粉末状结晶,易溶于水,液体呈褐色性质不稳定,放置后或遇光时易分解,使高铁离子(Fe)变为低铁离子(Fe),液体变为蓝色。由于其作用迅速,而且消失也快,是治疗高血压急症及急性左心衰竭的常用药物。科学研究常以硝普钠为一氧化氮供体。本发明中硝普钠通过释放NO,作为抗氧化剂调控抗氧化酶***活性,促进叶绿素的合成;也作为信号分子缓解金属离子对微藻的胁迫作用,从而加速细胞***。
在本发明的其中一个实施例中,作为优选,所述硝普钠于培养液中的浓度为15-50μmol/L。
在本发明的其中一个实施例中,作为优选,所述生长缓慢及停滞状态包括处于对数生长末期及稳定期的细胞。
在上述方案中,作为优选,将包含对数生长末期的微藻细胞培养液离心后取藻泥接种于灭菌后的BG11培养基中,添加过滤除菌的硝普钠至终浓度为15-50μmol/L,然后开始培养。
在上述方案中,作为优选,培养过程中给予光照培养,控制培养温度为25-30℃,光强为25μmol photons m-2s-1。
在本发明的其中一个实施例中,作为优选,所述光照为人工光照或自然光照,所述人工光照包括白炽灯或LED灯条进行光照。
在本发明的其中一个实施例中,作为优选,所述硝普钠作为MO供体,包括金属-NO复合物硝普钠、新型金属-NO复合物Ni-(SalPipNONO)、无菌NO气体、偶氮二醇烯鎓盐和NO供体纳米粒子中的任意一种。
在本发明的其中一个实施例中,作为优选,获取对数生长阶段微藻培养液的方法包括如下步骤:
在封闭式光生物反应器中,利用BG11培养基对微藻进行自养培养或兼养培养或异养培养,控制培养温度为25-30℃,光强为25μmol photons m-2s-1,培养微藻至对数生长期末期,获得包含对数生长末期的微藻细胞培养液。
在本发明的其中一个实施例中,作为优选,所述微藻为雨生红球藻、小球藻、杜氏盐藻或莱茵衣藻。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案,现提供如下的实施例进行说明:
实施例1
在室内采用250mL三角瓶进行混养培养获得游动阶段的雨生红球藻培养液。藻种为雨生红球藻,来自中国科学院天津工业生物技术研究所,编号为HA-3。待培养至不动细胞时期,在超净工作台内将不动生长阶段雨生红球藻分装入50ml无菌离心管内,以2000rpm离心2min,弃掉上清,将藻泥接种于灭菌后的在121℃、0.1MPa的条件下灭菌20分钟,冷却后的新鲜上海光语生物科技有限公司BG11培养基中,混合均匀后,使藻细胞密度为5×10^5-6×10^5cells/mL,添加过滤除菌的硝普钠至终浓度为15μmol/L,然后开始进行自养培养,培养过程中给予LED灯条提供的人工光照和摇床混合,控制培养温度为25-30℃,光强为25μmolphotons m-2s-1。培养周期为5天,每日取样在光学显微镜下用血球计数板计数。
在雨生红球藻培养液中添加终浓度为15μmol/L的硝普钠,培养5天,细胞浓度由5.07×10^5cells/mL增至9.51×10^5cells/mL,细胞干重由0.73g/L增加至0.972g/L。而使用相同的反应器、相同的培养条件培养相同的微藻,只是未添加硝普钠,培养5天后,细胞浓度由5.07×10^5cells/mL增至7.01×10^5cells/mL。细胞干重由0.73g/L增加至0.81g/L相比较而言,添加15μmol/L的硝普钠后细胞密度提高了35.7%,细胞干重提升了22.2%。如图1、图2所示。
实施例2
其他同实施例1,所不同的是雨生红球藻培养液中硝普钠添加至终浓度30μmol/L。在雨生红球藻培养液中添加终浓度为30μmol/L的硝普钠,培养5天,细胞浓度由5.07×10^5cells/mL增至10.59×10^5cells/mL,细胞干重由0.73g/L增加至1.03g/L。而使用相同的反应器、相同的培养条件培养相同的微藻,只是未添加硝普钠,培养5天后,细胞浓度由5.07×10^5cells/mL增至7.01×10^5cells/mL,细胞干重由0.73g/L增加至0.81g/L。相比较而言,添加30μmol/L的硝普钠后细胞产量提高了51.1%。细胞干重提升了27.2%。如图1、图2所示。
实施例3
其他同实施例1,所不同的是雨生红球藻培养液中硝普钠添加至终浓度50μmol/L。在雨生红球藻培养液中添加终浓度为50μmol/L的硝普钠,培养5天,细胞浓度由5.07×10^5cells/mL增至8.56×10^5cells/mL,细胞干重由0.73g/L增加至0.94g/L。而使用相同的反应器、相同的培养条件培养相同的微藻,只是未添加硝普钠,培养5天后,细胞浓度由5.07×10^5cells/mL增至7.01×10^5cells/mL,细胞干重由0.73g/L增加至0.81g/L。相比较而言,添加30μmol/L的硝普钠后细胞产量提高了22.1%。细胞干重提升了16%。如图1、图2所示。
实施例4
其他同实施例1,所不同的是雨生红球藻培养液中通入无菌NO气体至终浓度为25μmol/L。在雨生红球藻培养液中通入无菌NO气体至终浓度25μmol/L,培养5天,细胞浓度由5.09×10^5cells/mL增至10.47×10^5cells/mL,细胞干重由0.75g/L增加至1.01g/L。而使用相同的反应器、相同的培养条件培养相同的微藻,只是通入等体积无菌空气,培养5天后,细胞浓度由5.09×10^5cells/mL增至7.08×10^5cells/mL,细胞干重由0.75g/L增加至0.83g/L。相比较而言,通入无菌NO气体至终浓度为25μmol/L后细胞产量提高了32.4%。细胞干重提升了24%。如图3、图4所示。
实施例5
其他同实施例1,所不同的是所用藻种为杜氏盐藻,藻种来自天津工业生物技术研究所,编号为HTBS,当微藻细胞受到高温胁迫逐渐衰老后,以初始浓度为2×10^6-3×10^6cells/mL接种到新鲜上海光语生物科技有限公司f/2培养基中,添加硝普钠至终浓度30μM。培养6天,硝普钠浓度为30μM实验组细胞浓度由2.5×10^6cells/mL提升至5.45×10^6cells/mL,而使用相同的反应器、相同的培养条件培养相同的微藻,只是不添加硝普钠,培养6天后,细胞浓度由2.5×10^6cells/mL增至4.37×10^6cells/mL,相比较而言,添加硝普钠至终浓度为30μM后细胞产量提升了24.7%。如图5所示。
实施例6
其他同实施例1,所不同的是所用藻种为杜氏盐藻,藻种来自天津工业生物技术研究所,编号为HTBS,当微藻细胞正常培养到对数生长末期,开始衰老后,以初始浓度为2×10^6-3×10^6cells/mL接种到新鲜上海光语生物科技有限公司f/2培养基,添加硝普钠至终浓度50μM。培养6天,硝普钠浓度为50μM实验组细胞浓度由2.5×10^6cells/mL提升至4.925×10^6cells/mL。而使用相同的反应器、相同的培养条件培养相同的微藻,只是不添加硝普钠,培养6天后,细胞浓度由2.5×10^6cells/mL增至4.37×10^6cells/mL,相比较而言,添加硝普钠至终浓度为30μM后细胞产量提升了12.7%。如图5所示。
实施例7
其他同实施例1,所不同的是所用藻种为小球藻,藻种来自天津工业生物技术研究所,编号为NIES-227,当细胞受到光胁迫,衰老后。以初始浓度为8×10^6-9×10^6cells/mL,接种新鲜BG11培养基,添加硝普钠至终浓度30μM。培养6天,硝普钠浓度为30μM实验组细胞浓度由8.05×10^6cells/mL提升至14.55×10^6cells/mL,而使用相同的反应器、相同的培养条件培养相同的微藻,只是不添加硝普钠,培养6天后,细胞浓度由8.05×10^6cells/mL提升至11.875×10^6cells/mL,相比较而言,添加硝普钠至终浓度为30μM后细胞产量提升了18.4%。如图6所示。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的提升微藻细胞密度的方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述,根据本发明,由于SNP产生的NO具有缓解微藻氧化胁迫,加速细胞***周期,因此具有提升微藻养殖密度效果。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (9)
1.提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,包括如下步骤:将处于生长缓慢及停滞状态、受到胁迫或衰退状态的微藻细胞转入新鲜的培养液中,并向培养液中添加硝普钠继续培养,以提升微藻细胞密度。
2.如权利要求1所述的提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,所述硝普钠于培养液中的浓度为15-50μmol/L。
3.如权利要求1所述的提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,所述生长缓慢及停滞状态包括处于对数生长末期及稳定期的细胞。
4.如权利要求3所述的提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,将包含对数生长末期的微藻细胞培养液离心后取藻泥接种于灭菌后的BG11或f/2培养基中,添加过滤除菌的硝普钠至终浓度为15-50μmol/L,然后开始培养。
5.如权利要求4所述的提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,培养过程中给予光照培养,控制培养温度为25-30℃,光强为25μmol photons m-2s-1。
6.如权利要求4所述的提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,所述光照为人工光照或自然光照,所述人工光照包括白炽灯或LED灯条进行光照。
7.如权利要求1所述的提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,所述硝普钠作为MO供体,包括金属-NO复合物硝普钠、新型金属-NO复合物Ni-(SalPipNONO)、无菌NO气体、偶氮二醇烯鎓盐和NO供体纳米粒子中的任意一种。
8.如权利要求3所述的提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,获取对数生长阶段微藻培养液的方法包括如下步骤:
在封闭式光生物反应器中,利用BG11培养基对微藻进行自养培养或兼养培养或异养培养,控制培养温度为25-30℃,光强为25μmol photons m-2s-1,培养微藻至对数生长期末期,获得包含对数生长末期的微藻细胞培养液。
9.如权利要求1所述的提升微藻细胞密度的方法,其特征在于,所述微藻为雨生红球藻、小球藻、杜氏盐藻或莱茵衣藻。
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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