CN111398600B - 一种人源可溶性bcma蛋白的elisa检测试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒及其使用方法和应用。所述ELISA检测试剂盒包括:预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板,生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体,过氧化物酶标记的链霉亲和素,人BCMA蛋白标准品,稀释液,终止反应液,酶标板清洗液和显色液。本发明利用抗人BCMA兔单克隆抗体进行双抗体夹心法检测人源可溶性BCMA蛋白,能够准确检测待测样品中人源可溶性BCMA蛋白的浓度,其重复测试中CV值均小于10%检测结果准确可靠,回收率大于85%,灵敏度较高,可检测到浓度为31.25pg/mL的人源可溶性BCMA蛋白。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域,尤其涉及一种人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒及其使用方法和应用。
背景技术
BCMA(B cell maturation antigen,B细胞成熟抗原)是一种III型跨膜蛋白,主要在成熟B细胞和恶性B细胞表面表达,是肿瘤坏死因子受体家族的一员,B淋巴细胞刺激因子和增殖诱导配体的受体,能够促进B细胞生存,在体液免疫调节中起到重要作用。
临床研究表明,BCMA及其配体能够活化NF-κB信号通路,并且JNK信号通路的活化与BCMA表达间可形成正反馈回路,共同促进浆细胞和肿瘤细胞的存活与增殖。膜蛋白BCMA经B细胞表达后,γ-分泌酶将其胞外区切断使其从膜上脱落,形成可溶性的BCMA(sBCMA),进入外周血循环,这一过程不需要被激活或者附加的激酶参与。
多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞疾病,其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞,而浆细胞是B淋巴细胞发育到最终功能阶段的细胞。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。
研究表明,MM患者由于存在B细胞恶性增殖,从而使外周血中sBCMA浓度远高于正常人。并且进一步研究表明,在MM患者中,sBCMA浓度可以有效的反应MM患者病情;sBCMA浓度变化与MM患者M蛋白和SFLC水平变化一致,且sBCMA浓度变化与MM患者治疗后响应相关。上述研究表明sBCMA在MM中发挥了重要的作用,可能成为该疾病的生物标记物,亦可能成为该疾病的疗效判定。
针对人可溶性BCMA的检测方法一方面为临床的辅助诊断、鉴别诊断、观察疗效、检测复发以及预后评价提供一个新的参考指标和检测方法;另一方面,ELISA检测法相较于免疫组化、western-blot检测等半定量检测法,能够定量的检测蛋白含量,具有更直接更准确的优势。然而,市售的人源可溶性BCMA的ELISA检测试剂盒存在稳定性差、检测灵敏度较低,重复性较差和检测结果可靠性较低等问题。
因此,提供一种灵敏度较高、检测结果更加准确可靠的ELISA检测试剂盒是本领域亟待解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒及其使用方法和应用,所述ELISA检测试剂盒的灵敏度较高且可靠性较好。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒,包括:
预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板,生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体,过氧化物酶标记的链霉亲和素,人BCMA蛋白标准品,稀释液,终止反应液,酶标板清洗液和显色液。
本发明以包被于ELISA酶标板上的抗人BCMA兔单克隆抗体作为固相捕获抗体和生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体作为检测抗体,进行双抗体夹心法检测,以定量检测人可溶性BCMA蛋白。本发明中提供的抗人BCMA兔单克隆抗体对人BCMA蛋白的捕获能力较好,将其作为检测抗体和捕获抗体,能够提高检测结果的灵敏度和准确性。
作为本发明优选的技术方案,所述抗人BCMA兔单克隆抗体的制备方法包括如下步骤:
采用纯化的人BCMA蛋白免疫兔,提取所述免疫兔的外周血中的B淋巴细胞,进行基因调取,获得具有抗人BCMA特异性的抗体基因,再将所述抗体基因进行转染并表达,纯化后得到所述抗人BCMA兔单克隆抗体。
本发明中所述抗人BCMA兔单克隆抗体的具体操作可以为:采用纯化的人BCMA蛋白免疫兔,得到达到要求效价的外周血,提取其中的B淋巴细胞进行基因调取,获得具有抗人BCMA特异性的抗体基因,将该基因用于HEK293细胞的瞬时转染及表达,然后进行纯化,制得。
作为本发明优选的技术方案,所述人BCMA蛋白的制备方法包括如下步骤:
检索人BCMA基因并进行密码子优化,利用同源重组的方法将目的基因与表达载体连接,转化感受态细胞;再将所述感受态细胞进行扩大培养,诱导表达后纯化,得到所述人BCMA蛋白。
优选地,编码所述人BCMA蛋白的基因的序列包括如SEQ.ID.NO:1所示的核苷酸序列。
本发明中,根据GENBANK中查询的人BCMA基因序列(Q02223)并利用大肠杆菌偏爱的host organism:E.coil strain K12进行密码子优化,最终得到优化后的基因序列,其序列如SEQ.ID.NO:1所示,继而合成目的基因。
SEQ.ID.NO:1具体序列为:
ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGCTGCAGATGGCAGGCCAGTGTAGCCAGAACGAGTACTTCGACAGCCTGCTGCACGCTTGTATCCCTTGCCAGCTCCGCTGCAGTAGCAATACCCCTCCTCTGACTTGCCAGCGGTATTGCAACG CCAGCGTGAC CAACAGCGTGAAGGGAACCAACGCTTGA。
利用同源重组的方法将目的基因与表达载体连接,转化感受态细胞,然后将感受态细胞进行扩大培养,在扩大培养的过程中加入IPTG进行诱导表达,最后收集菌体。
本发明中,所述抗人BCMA兔单克隆抗体能够提高检测试剂盒的稳定性,所述试剂盒在开封后的检测值不会随着开封时间的延长而降低,保证其检测结果的准确性,同时便于存储,不容易发生变性。
本发明第一方面提供了一种人源可溶性BCMA蛋白的检测方法,所述的检测方法以包被于ELISA酶标板上的抗人BCMA兔单克隆抗体作为固相捕获抗体和标记的抗人BCMA兔单克隆抗体作为检测抗体,通过酶标底物的链霉亲和素(Streptavidin)部分与兔单克隆抗体上的生物素耦联,使酶标底物与兔单克隆抗体结合,经显色,以实现人源可溶性BCMA的定量检测。
作为本发明优选的技术方案,所述过氧化物酶包括辣根过氧化物酶。
优选地,所述稀释液包括样品稀释液、抗体稀释液和链霉亲和素稀释液。本发明中,所述三种稀释液可以均为质量分数为1%BSA的PBS缓冲液。
优选地,所述显色液包括四甲基联苯胺溶液。
优选地,所述终止反应液包括1.8-2.2mol/L(例如可以是1.8mol/L、1.85mol/L、1.9mol/L、1.95mol/L、2mol/L、2.1mol/L或2.2mol/L等)的硫酸溶液。
本发明中,所述酶标板清洗液可以是含有质量分数为0.05%Tween20的PBS溶液,pH为7.2-7.4,例如7.2、7.25、7.3、7.35或7.4。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述的ELISA检测试剂盒的使用方法,其特征在于,包括步骤如下:
(1)将抗人BCMA兔单克隆抗体包被于酶标板上,加入酶标板清洗液,洗涤后干燥;
(2)将按比例稀释的待测样品加入酶标板,孵育;
(3)将生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体稀释,加入到酶标板,孵育,干燥后加入酶标板清洗液,洗涤干燥;
(4)将过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释,加入到酶标板,孵育,干燥后加入酶标板清洗液,洗涤干燥;
(5)将显色液加入到酶标板,避光孵育后加入终止反应液,测定OD值,通过标准曲线得到所述待测样品中人源可溶性BCMA蛋白的浓度。
本发明的第二方面,提供了上述的人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒的使用方法,所述ELISA检测试剂盒能够检测健康人及多发性骨髓瘤患者外周血液样本中的BCMA蛋白浓度。
所述的健康人,是指无已确诊的各***严重慢性疾病、无全身免疫相关性疾病、无传染性疾病、3个月内无外伤史和急性感染病史的人。
所述的多发性骨髓瘤,包括诊断为冒烟型(无症状)多发性骨髓瘤及活动性(症状性)多发性骨髓瘤的I期、II期、III期。
作为本发明优选的技术方案,步骤(1)所述按比例稀释待测样品的方法为:所述待测样品为健康人外周血液,待测样品与样品稀释液的体积比为1:(40-60),例如可以是1:40、1:42、1:44、1:46、1:48、1:50、1:52、1:54、1:56、1:58或1:60等;所述待测样品为多发性骨髓瘤患者外周血液,待测样品与样品稀释液的体积比为1:(80-120),例如可以是1:80、1:82、1:85、1:90、1:92、1:95、1:98、1:100、1:102、1:105、1:108、1:110、1:115或1:120等。
优选地,步骤(1)所述孵育的温度为35-38℃,例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃;时间为0.5-1.5h,例如可以是0.5h、0.8h、1h、1.05h、1.1h、1.15h、1.2h、1.3h、1.4h或1.5h等。
优选地,所述稀释后的待测样品与酶标板清洗液的体积比为1:(2.5-3.5),例如可以是1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4或1:3.5等。
作为本发明优选的技术方案,步骤(2)所述稀释为将生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体稀释至浓度为150-250ng/mL,例如可以是150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL、210ng/mL、220ng/mL、230ng/mL、240ng/mL或250ng/mL等。
优选地,步骤(2)所述孵育的温度为35-38℃,例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃;时间为30-45min,例如可以是30min、32min、33min、35min、38min、40min、41min、42min、44min或45min等。
优选地,所述稀释后的生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体与酶标板清洗液的体积比为1:(2.5-3.5),例如可以是1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4或1:3.5等。
优选地,步骤(3)所述过氧化物酶标记的链霉亲和素与链霉亲和素稀释液的体积比为1:(150-250),例如可以是1:150、1:160、1:170、1:180、1:190、1:200、1:210、1:220、1:230、1:240或1:250等。
优选地,步骤(3)所述孵育的温度为35-38℃,例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃;时间为15-25min,例如可以是15min、16min、18min、19min、20min、21min、22min、24min或25min等。
优选地,步骤(4)所述孵育的温度为35-38℃,例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃或38℃;时间为10-20min,例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min等。
作为本发明优选的技术方案,所述使用方法包括如下步骤:
(1)将健康人外周血液或多发性骨髓瘤患者外周血液使用样品稀释液稀释后,加入预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板中,35-38℃孵育0.5-1.5h;
(2)将生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体稀释至浓度为150-250ng/mL,加入到酶标板,35-38℃孵育30-45min,干燥后加入酶标板清洗液,洗涤干燥;
(3)将过氧化物酶标记的链霉亲和素按1:(150-250)稀释,加入到酶标板,35-38℃孵育15-25min,干燥后加入酶标板清洗液,洗涤干燥;
(4)将显色液加入到酶标板上,避光条件下35-38℃孵育10-20min后加入终止反应液,测定OD值,通过标准曲线得到所述待测样品中人源可溶性BCMA蛋白的浓度。
本发明中,所述试剂盒可以采用如下所述的具体检测:
(1)将抗人BCMA兔单克隆抗体稀释成400ng/mL的浓度,每孔100μL,4℃过夜包被ELISA酶标板;甩去各孔中的液体,加入ELISA酶标板清洗液,每孔300μL,洗涤5次,在干净的纸上拍干;
(2)将健康人血浆按1:50稀释(或者将MM患者血浆按1:100稀释),每孔100μL,37℃孵育1小时;同时,将梯度稀释的人源可溶性BCMA标准品蛋白,每孔100μL,37℃孵育1小时;甩去各孔中的液体,加入ELISA酶标板清洗液,每孔300μL,洗涤5次,在干净的纸上拍干;
其中,人源可溶性BCMA标准品蛋白以梯度稀释的方法稀释成不同的浓度,本发明的一个优选实施例中,浓度梯度为:2000pg/mL,1000pg/mL,500pg/mL,250pg/mL,125pg/mL,62.5pg/mL,31.25pg/mL,0pg/mL,制成标准曲线;
(3)将生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体稀释成200ng/mL,每孔100μL,37℃孵育40分钟;甩去各孔中的液体,加入ELISA酶标板清洗液,每孔300μL,洗涤5次,在干净的纸上拍干;
(4)将酶标底物即过氧化物酶标记的链霉亲和素按1:200稀释,每孔100μL,37℃孵育20分钟;甩去各孔中的液体,加入ELISA酶标板清洗液,每孔300μL,洗涤5次,在干净的纸上拍干;
(5)加入TMB显色液,每孔100μL,37℃避光孵育15分钟;每孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液终止反应;用酶标仪450nm波长下测定OD值,通过定量分析得到健康人血浆中可溶性BCMA蛋白的浓度。
本发明提供的使用方法与所述试剂盒配合使用,在检测人源可溶性BCMA蛋白时能够进一步提高试剂盒的重复性,检测结果更加准确。
第三方面,本发明提供一种如第一方面所述的人源可溶性BCMA蛋白检测试剂盒在检测sBCMA中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值,还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值,限于篇幅及出于简明的考虑,本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
本发明提供的ELISA检测试剂盒利用抗人BCMA兔单克隆抗体进行双抗体夹心法检测人源可溶性BCMA蛋白,同时由酶标仪定量分析,能够准确检测待测样品中人可溶性BCMA蛋白的浓度,其重复测试中CV值均小于10%检测结果准确可靠,回收率大于85%,灵敏度较高,能够检测到浓度为31.25pg/mL的人源可溶性BCMA蛋白;同时还能够减少干扰元素的影响,在开封后的一段时间内,能够保持较好的稳定性,而且还排除了免疫组化、免疫荧光等半定量方法的主观性,实现可以实现人源可溶性BCMA蛋白的定量检测。
附图说明
图1为人BCMA蛋白表达SDS-PAGE电泳验证图(其中,泳道1为诱导前的蛋白;泳道2为诱导后的蛋白;泳道M表示蛋白marker)。
图2为人BCMA蛋白western-blot验证图(泳道1为人BCMA重组蛋白;泳道M表示蛋白marker)。
图3为纯化后的人BCMA蛋白SDS-PAGE电泳图(泳道1为BSA;泳道2为纯化后的人BCMA重组蛋白;泳道M表示蛋白marker)。
图4为纯化后的兔单克隆抗体SDS-PAGE电泳验证图(泳道1为纯化后的捕获用兔单克隆抗体;泳道2为纯化后的检测用兔单克隆抗体;泳道M表示蛋白marker)。
图5为兔单克隆抗体western-blot验证图(泳道1为纯化后的捕获用兔单克隆抗体;泳道2为纯化后的检测用兔单克隆抗体;泳道M表示蛋白marker)。
图6为人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测方法标准曲线。
图7为应用实施例1中所述ELISA检测试剂盒检测健康人及治疗前MM患者得到的血浆中BCMA浓度分布图。
图8(a)为市售的人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒在开封后D0、W1、W2、W4的检测结果曲线图;图8(b)为实施例1提供的检测试剂盒在开封后D0、W1、W2、W4的检测结果曲线图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但下述的实例仅仅是本发明的简易例子,并不代表或限制本发明的权利保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中,未详细说明的实验步骤均可使用本领域中常用的实验方法进行。
实施例1
本实施例提供一种制备人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒及其制备方法。
首先,制备人源可溶性BCMA蛋白:
根据GENBANK中查询的人BCMA基因序列(Q02223)并利用大肠杆菌偏爱的hostorganism:E.coil strain K12进行密码子优化,最终得到优化后的基因序列,其序列如SEQ.ID.NO:1所示,继而合成目的基因。
SEQ.ID.NO:1具体序列为:
ATGAATCACAAAGTGCATCATCATCATCATCATATGCTGCAGATGGCAGGCCAGTGTAGCCAGAACGAGTACTTCGACAGCCTGCTGCACGCTTGTATCCCTTGCCAGCTCCGCTGCAGTAGCAATACCCCTCCTCTGACTTGCCAGCGGTATTGCAACG CCAGCGTGAC CAACAGCGTGAAGGGAACCAACGCTTGA。
利用同源重组的方法将目的基因与表达载体连接,转化感受态细胞,然后将感受态细胞进行扩大培养,在扩大培养的过程中加入IPTG进行诱导表达,最后收集菌体。对表达的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,检验蛋白是否正确表达,其结果见图1,并用western-blot验证,其结果见图2。
由图1和图2可知,成功获得了目的蛋白,其大小为7.3KD。用AKTA仪器进行纯化,纯化后的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,检验其蛋白大小及纯度,结果见图3。
然后,制备抗人源可溶性BCMA蛋白的兔单克隆抗体:
采用纯化的人BCMA蛋白免疫兔,当血清稀释浓度为1:72900且P/N大于2.0时,即可得到达到要求效价的外周血;
提取其中的B淋巴细胞进行基因调取,获得具有抗人BCMA特异性的抗体基因,将该基因用于HEK293细胞的瞬时转染及表达,培养液用AKTA仪器进行纯化得到所述兔单克隆抗体,用SDS-PAGE凝胶电泳对纯化后的兔单抗进行验证,其结果见图4;对单抗进行western-blot验证,其结果见图5;由图4和图5可知,获得了纯化后的兔单克隆抗体。
制备所述ELISA检测试剂盒:
(1)将抗人BCMA兔单克隆抗体用包被液(1×PBS,pH7.4)稀释至400ng/mL,每孔加入100μL,4℃包被过夜;弃去孔内液体,加入PBST,每孔300μL,清洗5次,每次清洗后甩去孔内液体,在干净的吸水纸上拍干;每孔加入300μL含1%BSA的PBS封闭液封闭,37℃孵育30分钟,洗涤,得到预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板;
(2)所述生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体,过氧化物酶标记的链霉亲和素,人BCMA蛋白标准品,稀释液,终止反应液,酶标板清洗液和显色液均可通过本领域常规方法进行制备。
最终,所得ELISA检测试剂盒包括:预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板(5块),生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体(20μg),过氧化物酶标记的链霉亲和素(350μL),人BCMA蛋白标准品(40ng),稀释液(10X)(25mL),终止反应液(40mL),酶标板清洗液(25X)(150mL)、显色液A(40mL)和显色液B(40mL)。
实施例2
本实施例利用实施例1提供的ELISA检测试剂盒检测可溶性BCMA标准蛋白的浓度。
将人源可溶性BCMA标准品蛋白按表1所示浓度梯度进行稀释,按照如下方法进行检测:
(1)人源可溶性BCMA标准蛋白用含1%BSA的PBS稀释成不同浓度梯度,37℃孵育1小时,
(2)洗涤:弃去孔内液体,加入PBST,每孔300μL,清洗5次,每次清洗后甩去孔内液体,在干净的吸水纸上拍干。
(3)加入检测抗体:将生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体用含1%BSA的PBS稀释至200ng/mL,每孔加入100μL,37℃孵育40分钟,洗涤。
(4)加入底物:将HRP标记的链霉亲和素用含1%BSA的PBS按1:200稀释,每孔加入100μL,37℃孵育20分钟,洗涤。
(5)显色:每孔加入100μL TMB显色液,37℃避光显色15分钟。
(6)终止反应:显色完毕后,每孔立即加入50μL 2mol/L H2SO4,于20分钟内用酶标仪在450nm单波长处测定吸收值。最终,测定得到的吸收值如表1所示:
表1 不同浓度人源可溶性BCMA蛋白的OD450读值
结果表明,本发明提供的检测试剂盒以及其配套的检测方法可检测到浓度为31.25pg/mL的人源可溶性BCMA蛋白。检测结果表明,在450nm单波长处测定吸收值与蛋白浓度进行标准曲线的四参数拟合(如图6所示),具有很好的线性关系,拟合曲线为y=(2.931-0.06075)/[1+(x/949.8)-1.133]+0.06075,r2>0.999。
实施例3
本实施例用于评价实施例1提供的ELISA检测试剂盒的重复性。
用本发明所建立的ELISA方法检测3个不同浓度水平的样品,具体检测方法同实施例2,每个样品各重复测10次,计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD,根据公式得出变异系数CV(结果如表2所示):
式中:SD-10次测量结果的标准差;CV-变异系数;M-10次测量结果的平均值。
表2 人源可溶性BCMA的ELISA检测方法重复性试验
根据试验结果表明,3个不同浓度的样品通过10次重复测试,CV值均小于10%。
实施例4
本实施例对实施例1提供的ELISA检测试剂盒的回收率进行测试。
将已知浓度的高水平待测物(A)加入到低浓度的血液基质(B)中,所加待测物A与B的比例为1:9,各用所建立的ELISA检测方法重复检测3次,取平均值,根据公式计算出回收率,其结果如表3所示:
式中:R-回收率;V-样品A液的体积;V0-样品B液的体积;C-样品B液加入A液后的检测浓度平均值;C0-样品B液的浓度平均值;CS-样品A液的检测浓度平均值。
表3 人源可溶性BCMA的ELISA检测方法回收率试验
根据试验结果表明,本发明中提供的ELISA检测试剂盒回收率为86.83%,大于85%。
应用实施例1
本实施例利用实施例1提供的ELISA检测试剂盒检测健康人及治疗前MM患者血浆中的BCMA浓度。
收集健康人血浆样本45例,MM患者治疗前血浆样本17例,按照实施例1的操作步骤,将健康人血浆按1:50稀释,MM患者血浆按1:100稀释,分别检测其中BCMA蛋白浓度。
其中,45例健康人血中BCMA蛋白浓度为3.88-23.94ng/mL,平均值mean=11.97ng/mL。
17列MM患者血浆中BCMA蛋白浓度为4.57-312.93ng/mL,平均值mean=138.29ng/mL。
结果如图7所示,45例健康人血浆及17例治疗前MM患者血浆,图中横线表示平均值mean,均检测出含有不同浓度的BCMA蛋白,说明本发明提供的ELISA检测试剂盒能够检测正常人和MM患者的BCMA浓度,检测敏感度较好。
应用对比例1
本对比例分别考察市售的ELISA检测试剂盒与实施例1提供的ELISA检测试剂盒的稳定性,其中,所述市售的ELISA检测试剂盒所用的捕获抗体及生物素标记的抗体均为山羊多抗。
具体的,分别考察试剂盒开封后当天(D0)、1周(W1)、2周(W2)、4周(W4)的检测结果。市售试剂盒按照其试剂盒说明书,在每个时间点对不同浓度的标准品进行检测,实施例1提供的试剂盒检测方法同实施例2,在同样的时间点对标准品进行检测。
结果如图8(a)所示,市售的ELISA检测试剂盒在开封后4周,其检测OD值随着开封时间而不断降低;实施例1提供的ELISA检测试剂盒在开封后4周,其结果如图8(b)所示,检测OD值基本保持一致。由此可见,本发明的检测试剂盒在稳定性上较市售商品具有明显优势。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司
<120> 一种人源可溶性BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒及其使用方法和应用
<130> 20200326
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgaatcaca aagtgcatca tcatcatcat catatgctgc agatggcagg ccagtgtagc 60
cagaacgagt acttcgacag cctgctgcac gcttgtatcc cttgccagct ccgctgcagt 120
agcaataccc ctcctctgac ttgccagcgg tattgcaacg ccagcgtgac caacagcgtg 180
aagggaacca acgcttga 198
Claims (15)
1.一种人BCMA蛋白的ELISA检测试剂盒,其特征在于,包括:
预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板,生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体,过氧化物酶标记的链霉亲和素,人BCMA蛋白标准品,稀释液,终止反应液,酶标板清洗液和显色液;
所述抗人BCMA兔单克隆抗体的制备方法包括如下步骤:
采用纯化的人BCMA蛋白免疫兔,提取所述免疫兔的外周血中的B淋巴细胞,进行基因调取,获得具有抗人BCMA特异性的抗体基因,再将所述抗体基因进行转染并表达,纯化后得到所述抗人BCMA兔单克隆抗体;
所述人BCMA蛋白的制备方法包括如下步骤:
检索人BCMA基因并进行密码子优化,利用同源重组的方法将目的基因与表达载体连接,转化感受态细胞;再将所述感受态细胞进行扩大培养,诱导表达后纯化,得到所述人BCMA蛋白;
编码所述人BCMA蛋白的基因的序列为如SEQ.ID.NO:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板的制备方法为:
将所述抗人BCMA兔单克隆抗体稀释到300-500ng/mL的浓度,再以每孔80-120μL的体积加入至酶标板中,4℃放置10-14h得到预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板。
3.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述过氧化物酶包括辣根过氧化物酶。
4.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述稀释液包括样品稀释液、抗体稀释液和链霉亲和素稀释液。
5.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述显色液包括四甲基联苯胺溶液。
6.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述终止反应液包括1.8-2.2mol/L的硫酸溶液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的ELISA检测试剂盒的非诊断目的的使用方法,其特征在于,包括步骤如下:
(1)将按比例稀释的待测样品加入预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板,孵育;
(2)将生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体稀释,加入到酶标板,孵育,干燥后加入酶标板清洗液,洗涤干燥;
(3)将过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释,加入到酶标板,孵育,干燥后加入酶标板清洗液,洗涤干燥;
(4)将显色液加入到酶标板,避光孵育后加入终止反应液,测定OD值,通过标准曲线得到所述待测样品中人BCMA蛋白的浓度。
8.根据权利要求7所述的使用方法,其特征在于,步骤(1)所述按比例稀释待测样品的方法为:
所述待测样品为健康人外周血液,待测样品与样品稀释液的体积比为1:(40-60);所述待测样品为多发性骨髓瘤患者外周血液,待测样品与样品稀释液的体积比为1:(80-120)。
9.根据权利要求7所述的使用方法,其特征在于,步骤(1)所述孵育的温度为35-38℃,时间为0.5-1.5h;
所述稀释后的待测样品与酶标板清洗液的体积比为1:(2.5-3.5)。
10.根据权利要求7所述的使用方法,其特征在于,步骤(2)所述稀释为将生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体稀释至浓度为150-250ng/mL;
步骤(2)所述孵育的温度为35-38℃,时间为30-45min。
11.根据权利要求10所述的使用方法,其特征在于,所述稀释后的生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体与酶标板清洗液的体积比为1:(2.5-3.5)。
12.根据权利要求7所述的使用方法,其特征在于,步骤(3)所述过氧化物酶标记的链霉亲和素与链霉亲和素稀释液的体积比为1:(150-250);
步骤(3)所述孵育的温度为35-38℃,时间为15-25min。
13.根据权利要求7所述的使用方法,其特征在于,步骤(4)所述孵育的温度为35-38℃,时间为10-20min。
14.根据权利要求7所述的使用方法,其特征在于,所述使用方法包括如下步骤:
(1)将健康人外周血液或多发性骨髓瘤患者外周血液使用样品稀释液稀释后,加入预包被抗人BCMA兔单克隆抗体的酶标板中,35-38℃孵育0.5-1.5h;
(2)将生物素标记的抗人BCMA兔单克隆抗体稀释至浓度为150-250ng/mL,加入到酶标板,35-38℃孵育30-45min,干燥后加入酶标板清洗液,洗涤干燥;
(3)将过氧化物酶标记的链霉亲和素按1:(150-250)稀释,加入到酶标板,35-38℃孵育15-25min,干燥后加入酶标板清洗液,洗涤干燥;
(4)将显色液加入到酶标板上,避光条件下35-38℃孵育10-20min后加入终止反应液,测定OD值,通过标准曲线得到所述待测样品中人BCMA蛋白的浓度。
15.如权利要求1-6任一项所述的人BCMA蛋白检测试剂盒在检测人BCMA中的非诊断目的的应用。
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