CN111378636A - 一种富含乳糖的生物质联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的集成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种富含乳糖的生物质联产beta‑半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的集成方法，包括富含乳糖的生物质发酵联产胞内酶beta‑半乳糖苷酶和乙醇；利用蒸馏所得的乙醇溶液透性化处理酵母全细胞；喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液获得beta‑半乳糖苷酶酶制剂和利用透性化处理液进一步蒸馏获得所需浓度的乙醇产品。本发明基于乳酸克鲁维酵母不仅可以内生分泌合成beta‑半乳糖苷酶，还可合成次级代谢产物乙醇的特性，首次实现了beta‑半乳糖苷酶和乙醇的联产。是一种可高效利用富含乳糖的底物联产beta‑半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的绿色环保技术，酶制剂产品质量好、产率高，且乙醇产品浓度高，具备扩试工业化生产的潜力。
Description
技术领域
本发明属于酶制剂制备技术领域，涉及一种富含乳糖的生物质联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的集成方法，包括富含乳糖的生物质发酵联产胞内酶beta-半乳糖苷酶和乙醇，也包括利用蒸馏所得的乙醇溶液透性化处理酵母全细胞，且包括喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液获得beta-半乳糖苷酶酶制剂，还包括利用透性化处理液进一步蒸馏获得所需浓度的乙醇产品。该集成工艺是一种可高效利用乳清粉联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的绿色环保技术，酶制剂产品质量好、产率高，且乙醇产品浓度高。
背景技术
beta-半乳糖苷酶(beta-Galactosidase,EC 3.2.1.23)，又称乳糖酶或beta-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，具有水解乳糖转化为半乳糖与葡萄糖的活性，是解决人类中乳糖不耐症的关键酶。beta-半乳糖苷酶还具有转糖苷活性，可以催化乳糖转化生成低聚半乳糖。beta-半乳糖苷酶广泛存在于动植物和微生物中，其生产主要来源于微生物，包括酵母菌、真菌和细菌。商业beta-半乳糖苷酶的主要生产来源是乳酸克鲁维酵母，乳酸克鲁维酵母不仅可内生高效表达beta-半乳糖苷酶，而且生产条件温和，易于繁殖生长，最重要的是该酵母是一种可食用的酵母，具有食品安全性。但该酵母分泌合成的beta-半乳糖苷酶是胞内酶，游离酶的生产需要细胞破壁、酶提取和纯化等复杂操作，导致酶回收效率低，且生产成本高。
生物乙醇作为一种新的能源来源，是可再生原料通过微生物发酵获得的，是一种可再生的、经济上可承受的，且对环境安全的能源物质，面对化石燃料的供应减少、能源危机以及传统化石能源使用造成的严重环境问题，生物乙醇将逐渐成为石油的替代品。乳酸克鲁维酵母与酿酒酵母属于同一种属，具有酿酒酵母的兼性厌氧特性。在有氧代谢条件下，乳酸克鲁维酵母还能够发酵乳清、糖蜜等廉价原料，通过三羧酸循环代谢丙酮酸，在无氧代谢条件下，乳酸克鲁维酵母可转化丙酮酸生产生物乙醇。
利用乳酸克鲁维酵母可以内生分泌合成beta-半乳糖苷酶，还可合成次级代谢产物乙醇的特性，开发一项利用乳酸克鲁维酵母高效联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的绿色环保技术，同时获得产品质量好、产率高的beta-半乳糖苷酶酶制剂和高浓度的乙醇产品，将是一项重大技术突破，具备扩试工业化生产的潜力。
发明内容
为解决上述酶制剂制备难题，同时得到乙醇产品，本发明以富含乳糖的生物质为底物开发了一种联产beta-半乳糖苷酶和乙醇的集成工艺技术。乳清，奶酪生产的副产物，含有质量比为4.5-5％的乳糖、0.6-08％的蛋白质、0.4-0.5％的脂肪和少量矿物盐类等，具有高生物需氧量和化学需氧量特性。目前，全球乳清的总产量达到1.8～1.9亿吨，而且每年产量仍在不断增长，若未利用处理好，容易造成环境的严重污染问题。因为乳清粉便于储存、运输和应用，大部分乳清被干燥成乳清粉。而且乳清粉因含有高度浓缩的乳糖和其他高营养价值成分，常被利用生产高附加值产品。以乳清粉代替乳糖和麦芽提取物的工业培养基在成本上具有极为明显的优势，此外乳清粉属于废弃生物质资源，具有废弃资源回收再利用的优势。酵母能以葡萄糖、半乳糖和乳糖作为碳源进行繁殖生长，是一种可以应用在食品领域中的对人类安全的微生物。酵母以富含乳糖的生物质为底物联产beta-半乳糖苷酶和乙醇，利用乙醇透性化处理酵母细胞，经过喷雾干燥获得beta-半乳糖苷酶酶制剂。本发明是一种可高效利用乳清粉联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的绿色环保技术，酶制剂产品质量好、产率高，且乙醇产品浓度高，具备扩试工业化生产的潜力。
本发明的技术方案如下:
一种富含乳糖的生物质联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的集成方法，包括如下步骤：
1)富含乳糖的生物质发酵联产胞内酶beta-半乳糖苷酶和乙醇；
2)利用蒸馏所得的乙醇溶液透性化处理酵母全细胞；
3)喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液获得beta-半乳糖苷酶酶制剂
4)利用透性化处理液进一步蒸馏获得所需浓度的乙醇产品
所述步骤1)的方法是：将乳酸克鲁维酵母单克隆接种到种子液培养基中制备酵母种子液，然后向富含乳糖的生物质培养基中加入体积比为1～10％酵母种子液，在温度为16～37℃，搅拌转速为200～500rpm，pH值为8.5～10的条件下发酵制备，发酵时间为8～48h，获得酵母全细胞发酵液。
所述的种子液培养基是每升培养基中含有1～30g酵母膏，1～30g蛋白胨和1～10g氯化钠；所述的富含乳糖的生物质选自乳糖、乳清或乳清粉；所述的培养基是每升培养基中含有1～100g富含乳糖的生物质，1～30g酵母膏和1～30g蛋白胨；所述的酵母全细胞含有beta-半乳糖苷酶胞内酶；所述的发酵液中还含有浓度为5～20g/L的乙醇。
所述的乳酸克鲁维酵母购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC1773。
所述步骤2)的方法是：将上述所述的发酵液进行离心分离，获得发酵上清液和酵母全细胞沉淀，利用旋转蒸发仪在35～45℃，0.07～0.08MPa条件下蒸馏发酵上清液获得浓度为体积比37％～50％的蒸馏乙醇溶液；酵母全细胞沉淀用于透性化处理；采用浓度为体积比20％～50％的蒸馏乙醇溶液透性化处理浓度为1～100g/L的酵母全细胞，透性化处理温度为0～37℃，透性化处理时间为5s～5min，离心分离获得乙醇处理液和透性化酵母细胞，向透性化酵母细胞加入pH值为4～10的50mM磷酸钠缓冲液使透性化酵母细胞质量比为1％～10％，经洗涤再离心除去上清液，获得透性化酵母细胞。
所述步骤3)的方法是：取一定质量的透性化细胞(细胞干重)，加入相应体积的50mM pH7.0磷酸钠缓冲液使固形物含量为2～3％，摇匀，制得透性细胞悬浮液，通过喷雾干燥可获得单位酶活为2.6～5.2U/mg，含水率为5.9～8.7％的beta-半乳糖苷酶酶制剂。
喷雾干燥条件是：进口温度180～220℃，雾化压力2.5～3.5bar，进料速度450～500mL/h，鼓风速率4～5m/s。
所述步骤4)的方法是：将透性化酵母细胞离心分离获得乙醇处理液，利用旋转蒸发仪在35～45℃，0.07～0.08MPa条件下蒸馏乙醇处理液获得浓度为体积比75～95％的蒸馏乙醇产品，其中，浓度为体积比75％的乙醇产品可用于灭菌消毒，浓度为体积比95％的乙醇产品可用作燃料。此外，乙醇是一种良好的有机溶剂。还可通过进一步二次蒸馏制备无水乙醇，能应用于燃料、工业试剂或医药等领域。
本发明的所述的离心条件为离心转速1000～15000rpm，离心时间1～20min。
本发明提供一种富含乳糖的生物质联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的集成方法，与现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明基于乳酸克鲁维酵母不仅可以内生分泌合成beta-半乳糖苷酶，还可合成次级代谢产物乙醇的特性，首次实现了beta-半乳糖苷酶和乙醇的联产。该集成工艺技术是一种可高效利用富含乳糖的底物联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的绿色环保技术，酶制剂产品质量好、产率高，且乙醇产品浓度高，具备扩试工业化生产的潜力。
(2)本发明采用的乳酸克鲁维酵母是一种可食用、对人类安全无害的酵母，本章中所用的培养基配方都是食品级，因此所得的乙醇发酵液满足食品级质量要求，可广泛应用于医药、化妆品、饮料酒水和工业试剂等。通过该集成方法还获得高浓度乙醇产品，其中，浓度为体积比75％的乙醇产品可用于灭菌消毒，浓度为体积比95％的乙醇产品可用作酒精灯燃料，也可用作有机溶剂。还可通过进一步二次蒸馏制备无水乙醇，能应用于燃料、工业试剂或医药等领域。
(3)本发明通过喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液制备beta-半乳糖苷酶酶制剂，规避了细胞破壁、酶提取和纯化等步骤，相比于游离酶，具有易于工业生物转化催化，高稳定性和可重复利用等优势。所得产品的单位酶活达到5.15U/mg(cell dry wt.)，高于诺维信公司市售的beta-半乳糖苷酶酶制剂产品的单位酶活(2600LAU/g，经单位换算，相当于2.6U/mg)。而且产品的产率(Yp值)达到了88.84％，基本达到了扩大化生产的产率要求。含水率仅为5.96％，与文献报道通过喷雾干燥获得的其他产品的含水率相当，适合于长期储存。
附图说明
图1富含乳糖的生物质联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的操作流程图
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
本发明所述的一种富含乳糖的生物质联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的集成方法(图1)，包括下述步骤：
1)富含乳糖的生物质发酵联产胞内酶beta-半乳糖苷酶和乙醇
酵母单克隆接种到种子液培养基中制备酵母种子液，然后向富含乳糖的生物质培养基加入体积比为1～10％酵母种子液，在温度为16～37℃，搅拌转速为200～500rpm，pH值为8.5～10的条件下发酵制备，发酵时间为8～48h，获得酵母全细胞发酵液。
2)利用蒸馏所得的乙醇溶液透性化处理酵母全细胞
将上述所述的发酵液进行离心分离，获得酵母全细胞沉淀和发酵上清液，利用旋转蒸发仪在35～45℃，0.07～0.08MPa条件下蒸馏发酵上清液获得浓度为体积比37％～50％的蒸馏乙醇溶液，酵母全细胞沉淀用于透性化处理；采用浓度为体积比20％～50％的乙醇溶液透性化处理浓度为1～100g/L的酵母全细胞，透性化处理温度为0～37℃，透性化处理时间为5s～5min，离心分离获得乙醇处理液和透性化酵母细胞，向透性化酵母细胞加入pH值为4～10的50mM磷酸钠缓冲液使透性化酵母细胞质量比为1％～10％，经洗涤再离心除去上清液，获得透性化酵母细胞。
3)喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液获得beta-半乳糖苷酶酶制剂
取一定质量的透性化细胞(细胞干重)，加入相应体积的50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液使固形物含量为2～3％，摇匀，制得透性细胞悬浮液，通过喷雾干燥可获得单位酶活为2.6～5.2U/mg，含水率为5.9～8.7％的beta-半乳糖苷酶酶制剂。
4)利用透性化处理液进一步蒸馏获得所需浓度的乙醇产品
将透性化酵母细胞离心分离获得乙醇处理液，利用旋转蒸发仪在35～45℃，0.07～0.08MPa条件下蒸馏乙醇处理液获得浓度为体积比75％～95％的蒸馏乙醇溶液，用于酵母全细胞透性化处理。
实施例一
1)富含乳糖的生物质发酵联产胞内酶beta-半乳糖苷酶和乙醇
将保存的乳酸克鲁维酵母菌种接种至平板固体LB培养基上，30℃培养72h，制得活化单菌落。取活化的单菌落接种至液体LB培养基中，30℃、160rpm震荡扩大培养20h，得到种子培养液。在7-L发酵罐中，以体积比为1％将40mL种子培养液接入4L发酵培养基中，在初始pH值8.5，转速200rpm，通气量1vvm，温度16℃条件下培养48h，获得酵母全细胞发酵液，离心分离得到乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀和发酵上清液，乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀用于透性化处理，发酵上清液用于蒸馏浓缩。发酵培养基配方如下：乳清粉60g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏12g/L，121℃灭菌20min。
2)利用蒸馏所得的乙醇溶液透性化处理酵母全细胞
所得发酵上清液含有浓度为25g/L的乙醇，通过在35℃，0.07MPa条件下蒸馏浓缩获得浓度为体积比37％的乙醇溶液，加50mmol/L磷酸钠缓冲液稀释至体积比20％，利用体积比20％的乙醇溶液对浓度为1g/L的乳酸克鲁维酵母全细胞在0℃条件下进行透性化处理5s，离心分离获得乙醇处理液和透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀，乙醇处理液继续用于蒸馏浓缩，向透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀加入pH值为4的浓度为50mmol/L磷酸钠缓冲液使透性化酵母细胞质量比为1％，经洗涤再离心除去上清液，获得透性化酵母细胞。
3)喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液获得beta-半乳糖苷酶酶制剂
取21.6g透性化细胞(细胞干重)，加1.08L 50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液使固形物含量为2％，摇匀，制得透性细胞悬浮液，通过喷雾干燥获得2.40g酶制剂，单位酶活为3.22U/mg，含水率为7.64％。
4)利用透性化处理液进一步蒸馏获得所需浓度的乙醇产品
所得透性化处理液含有浓度为体积比18.1％的乙醇，通过在35℃，0.07MPa条件下蒸馏浓缩获得浓度为体积比75％乙醇溶液，用于实验室灭菌消毒操作。
实施例二
1)富含乳糖的生物质发酵联产胞内酶beta-半乳糖苷酶和乙醇
将保存的乳酸克鲁维酵母菌种接种至平板固体LB培养基上，30℃培养72h，制得活化单菌落。取活化的单菌落接种至液体LB培养基中，30℃、160rpm震荡扩大培养20h，得到种子培养液。在7-L发酵罐中，以体积比为5％将200mL种子培养液接入4L发酵培养基中，在初始pH值8.8，转速360rpm，通气量1vvm，温度28℃条件下培养24h，获得酵母全细胞发酵液，离心分离得到乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀和发酵上清液，乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀用于透性化处理，发酵上清液用于蒸馏浓缩。发酵培养基配方如下：乳糖60g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏12g/L，121℃灭菌20min。
2)利用蒸馏所得的乙醇溶液透性化处理酵母全细胞
所得发酵上清液含有浓度为30g/L的乙醇，通过在40℃，0.075MPa条件下蒸馏浓缩获得浓度为体积比45％的乙醇溶液，加50mmol/L磷酸钠缓冲液稀释至体积比35％，利用体积比35％的乙醇溶液对浓度为50g/L乳酸克鲁维酵母全细胞在20℃条件下进行透性化处理2min，离心分离获得乙醇处理液和透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀，乙醇处理液继续用于蒸馏浓缩，向透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀加入pH值为7的浓度为50mmol/L磷酸钠缓冲液洗涤使透性化酵母细胞质量比为5％，经洗涤再离心除去上清液，获得透性化酵母细胞。
3)喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液获得beta-半乳糖苷酶酶制剂
取22g透性化细胞(细胞干重)，加0.875L 50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液使固形物含量为2.5％，摇匀，制得透性细胞悬浮液，通过喷雾干燥获得0.81g酶制剂，单位酶活为5.15U/mg，含水率为5.96％。
4)利用透性化处理液进一步蒸馏获得所需浓度的乙醇产品
所得透性化处理液含有浓度为体积比33.6％的乙醇，通过在40℃，0.075MPa条件下蒸馏浓缩获得浓度为体积比95％乙醇溶液，用作实验室酒精灯、酒精炉的燃料。
实施例三
1)富含乳糖的生物质发酵联产胞内酶beta-半乳糖苷酶和乙醇
将保存的乳酸克鲁维酵母菌种接种至平板固体LB培养基上，30℃培养72h，制得活化单菌落。取活化的单菌落接种至液体LB培养基中，30℃、160rpm震荡扩大培养20h，得到种子培养液。在500mL锥形瓶中，以体积比为10％将10mL种子培养液接入100mL发酵培养基中，在初始pH值为10，转速为500rpm，温度为37℃条件下培养8h，获得酵母全细胞发酵液，离心分离得到乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀和发酵上清液，乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀用于透性化处理，发酵上清液用于蒸馏浓缩。发酵培养基配方如下：乳清100mL/L，蛋白胨30g/L，酵母膏30g/L，121℃灭菌20min。
2)利用蒸馏所得的乙醇溶液透性化处理酵母全细胞
所得发酵上清液含有浓度为32g/L的乙醇，通过在45℃，0.08MPa条件下蒸馏浓缩获得浓度为体积比50％的乙醇溶液，利用体积比50％的乙醇溶液对浓度为100g/L乳酸克鲁维酵母全细胞在37℃条件下进行透性化处理5min，离心分离获得乙醇处理液和透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀，乙醇处理液继续用于蒸馏浓缩，向透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀加入pH值为10的浓度为50mmol/L磷酸钠缓冲液使透性化酵母细胞质量比为10％，经洗涤再离心除去上清液，获得透性化酵母细胞。。
3)喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液获得beta-半乳糖苷酶酶制剂
取3240mg透性化细胞(细胞干重)，加108mL 50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液使固形物含量为3％，摇匀，制得透性细胞悬浮液，通过喷雾干燥获得324mg酶制剂，单位酶活为2.61U/mg，含水率为8.68％。
4)利用透性化处理液进一步蒸馏获得所需浓度的乙醇产品
所得透性化处理液含有浓度为体积比35.2％的乙醇，通过在45℃，0.08MPa条件下蒸馏浓缩获得浓度为体积比92％乙醇溶液，用作实验室试剂、药品的溶剂。
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (9)
1.一种富含乳糖的生物质联产beta-半乳糖苷酶酶制剂和乙醇产品的集成方法，其特征是包括如下步骤：
1)富含乳糖的生物质发酵联产胞内酶beta-半乳糖苷酶和乙醇；
2)利用蒸馏所得的乙醇溶液透性化处理酵母全细胞；
3)喷雾干燥透性化酵母细胞悬浮液获得beta-半乳糖苷酶酶制剂
4)利用透性化处理液进一步蒸馏获得所需浓度的乙醇产品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤1)的方法是：将乳酸克鲁维酵母单克隆接种到种子液培养基中制备酵母种子液，然后向富含乳糖的生物质培养基中加入体积比为1～10％酵母种子液，在温度为16～37℃，搅拌转速为200～500rpm，pH值为8.5～10的条件下发酵制备，发酵时间为8～48h，获得酵母全细胞发酵液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的种子液培养基是每升培养基中含有1～30g酵母膏，1～30g蛋白胨和1～10g氯化钠；所述的富含乳糖的生物质选自乳糖、乳清或乳清粉；所述的培养基是每升培养基中含有1～100g富含乳糖的生物质，1～30g酵母膏和1～30g蛋白胨；所述的酵母全细胞含有beta-半乳糖苷酶胞内酶；所述的发酵液中还含有浓度为5～20g/L的乙醇。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的乳酸克鲁维酵母购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC1773。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤2)的方法是：将上述所述的发酵液进行离心分离，获得发酵上清液和酵母全细胞沉淀，利用旋转蒸发仪在35～45℃，0.07～0.08MPa条件下蒸馏发酵上清液获得浓度为体积比37％～50％的蒸馏乙醇溶液；酵母全细胞沉淀用于透性化处理；采用浓度为体积比20％～50％的蒸馏乙醇溶液透性化处理浓度为1～100g/L的酵母全细胞，透性化处理温度为0～37℃，透性化处理时间为5s～5min，离心分离获得乙醇处理液和透性化酵母细胞，向透性化酵母细胞加入pH值为4～10的50mM磷酸钠缓冲液使透性化酵母细胞质量比为1％～10％，经洗涤再离心除去上清液，获得透性化酵母细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤3)的方式是：取一定质量的透性化细胞(细胞干重)，加入相应体积的50mM pH 7.0磷酸钠缓冲液使固形物含量为2～3％，摇匀，制得透性细胞悬浮液，通过喷雾干燥可获得单位酶活为2.6～5.2U/mg，含水率为5.9～8.7％的beta-半乳糖苷酶酶制剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是喷雾干燥条件是：进口温度180～220℃，雾化压力2.5～3.5bar，进料速度450～500mL/h，鼓风速率4～5m/s。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤4)的方式是：将透性化酵母细胞离心分离获得乙醇处理液，利用旋转蒸发仪在35～45℃，0.07～0.08MPa条件下蒸馏乙醇处理液获得浓度为体积比75～95％的蒸馏乙醇产品。
9.如权利要求5或8所述的方法，其特征是所述的离心条为离心转速1000～15000rpm，离心时间1～20min。
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